EVs檢測方法整理

A、EVs外部特征（大小和表面蛋白）檢測方法CurrentmettiodsforEVanalysisTechniqueParticlesizeTimeformeasurementLimitationsAdvantagesCryoTEM<1nm,mm>1hSamplepreparation,onlysmallamountofsampleisanalyzedMorpliok>gyrDLS,homodyne1nm…6pm1-2minPolydispcrscsampleschallenging,presenceoflargeparticlesbiasesresultsWidesizerajigeDLS,heterodyne0.5nm...6pm1-2minAnaloghomodsneDLS,butnorasdominantWiderangesofsizeandconcentrationNTA20nm...1pm5-10minDilutionnecessaryforhighcojiccntracion,non-standardizedmethodVisualizationresolution(evenpolydispcrscsamples),lowconcentrationsPCM300-500nm...10屮n1minWorkingrange%poreblocking,calibrationFluorescence,biochemicalinformationa?10-1000nmAnalogcryo-TEMMorphologyRPS50nmto10屮n,dependentonporesize30minWorkingrange,poreblocking,calibrationHighresolution^compatiblewithbuffersAPca.5nmto20|ini1hSampledilution,interactionofsamplewithmembraneFractionationTEMtransmissionelectronmicroscopy^DLSdynamiclightscattering,NTAnanoparticletackinganalysis,FCMflowcytometry,川atomicforcemicroscopy^RPSresistivepulse：&ensingTAF4flowfieldflowfractionation1、Dynamiclightscattering（DLS）:動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)原理：通過測量樣品散射光強(qiáng)度起伏的變化來得到樣品顆粒大小信息的一種技術(shù)?！皠?dòng)態(tài)”是因?yàn)闃悠分械姆肿硬煌５刈霾祭蔬\(yùn)動(dòng)，正是這種運(yùn)動(dòng)使散射光產(chǎn)生多普勒頻移。步驟：首先根據(jù)散射光的變化,機(jī)多普勒頻移測得溶液中分子的擴(kuò)散系數(shù)D,再由D=KT/6nnr可求出分子的流體動(dòng)力學(xué)半徑r（K為玻爾茲曼常數(shù)，T為絕對溫度，n為溶液的粘滯系關(guān)鍵參數(shù)：濃度（不能太濃,易發(fā)生二次散射,導(dǎo)致檢測信號減弱）/光到樣品以及散射光到檢測器的距離。測量粒徑范圍：1nm-6um優(yōu)點(diǎn)：樣品制備簡單，不需要特殊處理，可以反映樣品分子真實(shí)狀態(tài)；速度快，樣品可回收；靈敏度高。缺點(diǎn)：分析粒徑差不多的樣品比較準(zhǔn)確。對于樣品顆粒大小差異大的，并不是很準(zhǔn)確。如果樣品中有比較多大顆粒樣品，小顆粒樣品的測量結(jié)果會受影響；不能檢測熒光信息。I汎收￥力7Soattering%0slightLaserDetector―?刃Scattering■A0??皐,I汎收￥力7Soattering%0slightLaserDetector―?刃Scattering■A0??皐,?旳對<ImIifJIR、opticalrNwindowHomodyneonlyscatteredlightreachesdetectorDetectorHeterodyneReferenceANDscatteredlightisreachdetectorFig.2PrincipleofhomodyneandheterodyneDLSsystems2、Nanoparticletrackinganalysis（NTA）：納米顆粒跟蹤技術(shù)原理：與DSL類似。利用激光光源照射納米顆粒懸浮液，利用全黑背景則功能強(qiáng)信號，可以清晰觀察到帶有散射光的顆粒的布朗運(yùn)動(dòng)。可以進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)、濃度檢測。具有熒光模式。測量粒徑范圍：10nm-2000nm（有文獻(xiàn)報(bào)道能檢測EV的最小粒徑為70nm）樣品濃度范圍：0.5E+6-1E+10/cm3,相比于DLS更低。推薦分析1000-10000個(gè)。缺點(diǎn)：1、熒光模式和散射模式是分開的。2、計(jì)術(shù)限制，檢測的是二維平面信息，而Z軸方向是檢測不到。F/IIrrorAutomatedfocusL^serbeamIFig.3Schematic前tupofananoparticletrackinganalyzerMeasurennent□ellfilledwithsampleObjectiveScatteredlightLaser3、Flowcytometry:流式細(xì)胞儀粒徑檢測極限：300-500nm4、RamanMicrospectroscopy（RM）：拉曼光譜原理：基于非彈性散射（改變方向和頻率）。優(yōu)點(diǎn)：可用于EVs亞型的鑒定缺點(diǎn)：價(jià)格昂貴，技術(shù)要求高；樣品制備和采集時(shí)間長，10-100個(gè)/小時(shí)；信號弱，非彈性散射信號強(qiáng)度小于彈性散射信號的1/10000；測量重復(fù)性差；EVs置于高劑量的光線下，會產(chǎn)生光反應(yīng)，且是不可逆的。5、AtomicForceMicroscopy（AFM）:原子力顯微鏡原理：利用微小探針與待測物之間交互作用力，來呈現(xiàn)待測物的表面的物理特性。將一

個(gè)對力極為敏感的微懸臂的一端固定，另一端固定針尖。當(dāng)針尖再樣品表面掃描時(shí)，因針尖尖端原子與樣品表面原子存在的范德華力，使微懸臂產(chǎn)生微小彎曲。檢測懸臂彎曲所造成的微笑位移量，得到樣品表面信息。缺點(diǎn)：EV的固定可能會影響其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，結(jié)果會受到樣品制備模式的影響；檢測結(jié)果受微懸臂探頭影響非常大，針尖的卷積效應(yīng)可能會使橫向結(jié)果的偏差很大；成像范圍太小，只要?10um*10um；檢測速度慢，測試一個(gè)樣品通常要1小時(shí)以上。50nm;AF50nmR'■、亠?、范is華力祥品表面6、ResistivePulseSensing(RPS):電阻脈沖傳感原理：當(dāng)高電阻率的絕緣顆粒流經(jīng)檢測微孔時(shí)，會置換微孔中等體積的低電阻率電解質(zhì)溶液，使得檢測微孔電阻發(fā)生改變，并在檢測微孔兩端產(chǎn)生一個(gè)電流脈沖值或電壓脈沖值。脈沖信號得個(gè)數(shù)反映流經(jīng)檢測微孔得顆粒數(shù)目，脈沖信號的幅值大小反映顆粒的尺寸大小。另外，當(dāng)顆粒在電解質(zhì)溶液中均勻分布且溶液流經(jīng)檢測微孔的速度一定時(shí)，可以用于濃度檢測。1TimeFig卜5ResislwpuJse闘斶網(wǎng)(RPSi.Lett1TimeFig卜5ResislwpuJse闘斶網(wǎng)(RPSi.Lett；Typacaisehipwithtwocellsserrarateflv：aaninsulalingmembranexvrthasinglepore,flight:Transientsignalofcurrentngpr^enting日(1)largw十(2)sinal-,窗nd⑶medium-sizedp^rlicte-Follwingc^iibralion,thetcwntr&te,thenumher皿pertimeinterval,r^lecls■■:--i-.i!■:':-■■.■■.中間孑L徑小于1um可調(diào)電阻脈沖傳感(TRPS):A、由于EVs的粒徑異質(zhì)性很大，較大的孔徑可能會堵塞微孔。B、標(biāo)準(zhǔn)品的大小需要與樣品尺寸一樣，這對于未知樣品檢測不夠靈活。7、FieldFlowFractionation(FFF):場流分離技術(shù)原理：用于大分子、膠體和微粒的分離。在相距很近的上下平板間構(gòu)成扁平帶狀流道，載流液流于其中。載流為層流，其流型為拋物線型，中心線上速度最大。側(cè)向場從側(cè)面垂直與流動(dòng)方向施加，側(cè)向場導(dǎo)致不同成分處在距下壁不同位置上，從而有不同移動(dòng)速度，在此前提下進(jìn)行分離。通常矩形流道寬高比一般大于100：1?？煞譃殡妶鰣隽鞣蛛x、熱場場流分離、沉降場流分離和流場場流分離。

laminarflowprofileLaminarflowpumpDiffusionCrossflowA.DetectorCrossflowpumplaminarflowprofileLaminarflowpumpDiffusionCrossflowA.DetectorCrossflowpump8、Cryo-TEM:冷凍電鏡冷凍電鏡技術(shù)結(jié)合受體特異性金標(biāo)記可用于EVs表型描述。冷凍電鏡不需要對樣品進(jìn)行固定和脫水處理，因此EV的形態(tài)是真實(shí)狀態(tài)下的。9、ScanningElectronMicroscopy掃描電子顯微鏡：原理：用極狹窄的電子束去掃描樣品，通過電子束與樣品的原子相互作用產(chǎn)生各種效應(yīng)，其中主要是樣品的二次電子發(fā)射。樣品需要固定和脫水，因此形狀呈現(xiàn)一種扭曲的杯狀。ScanningElectronMicroscopy200nm10、SingleEVAnalysis(SEA)MethodScanningElectronMicroscopy200nm10、SingleEVAnalysis(SEA)Method光鏡單個(gè)EV檢測方法:Analysis3EVcaptureTargetlabelingImagingCN山Analysis3EVcaptureTargetlabelingImagingCN山&11、ExoCounter:細(xì)胞外囊泡檢測系統(tǒng)類似ELISA方法，用抗體捕獲外泌體.。但是CD9CD63CD81在外泌體的表達(dá)量均達(dá)不到100%，因此會損失很多信息。Ex&some(So^lSunm)Ab-coatedOpticaldiscEx&some(So^lSunm)Ab-coatedOpticaldiscDisc色Disc色ho&oeeas&ayontrieopticaldisc如阿FGbiaite-恒呵t：n^AhwNugsA^iJWellplateDisc口皿“匚為11Abcabled)Appl\rGMOSflEaSLCE9jMmtCoiTiRWnc?05<jrTkLlinjikcrpnulcinWash&DryUpCCnJJlt如阿FGbiaite-恒呵t：n^AhwNugsA^iJWellplateDisc口皿“匚為11Abcabled)Appl\rGMOSflEaSLCE9jMmtCoiTiRWnc?05<jrTkLlinjikcrpnulcinWash&DryUpCCnJJltOJifiMmK.I曲C3￡N評兇I

bvcoiiDtincithepulsesWt^l\r*」(TnM1ie'inadisc)puls?ofH；hEwclsCuunt^□0,0*00exofSQnKS-per[N護(hù)JM^d^rh^nL11.納米流式檢測儀(FlowNanoAnalyzer)原理：和傳統(tǒng)流式有點(diǎn)類似，均是靠激光激發(fā)顆粒產(chǎn)生光信號。不同的是，納米流式利用的是瑞利散射原理，主要檢測200nm以下的顆粒。優(yōu)點(diǎn)：散射檢測范圍7?lOOOnm(EV檢測下限為40nm),可以同時(shí)檢測樣品的粒徑、濃度、表面蛋白信息以及內(nèi)容物。缺點(diǎn)：熒光標(biāo)記的樣品需要超速離心去除游離染料。B、EVs內(nèi)容物檢測技術(shù)傳統(tǒng)核酸的提取與檢測RNA提?。悍勇确鲁樘幔禾崛r(shí)間長，步驟繁瑣；純度高；商品化柱提法檢測：PCR;RT-PCR;電泳；nextgenerationsequencing(NGS)。1.DropletPCR原理：在傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增前對樣品進(jìn)行微滴化處理，即將含有核酸分子的反應(yīng)體系分成數(shù)萬個(gè)納升級的微滴，其中每個(gè)微滴或不含待測核酸靶分子，或者含一個(gè)至數(shù)個(gè)待檢核酸靶分子。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，對每個(gè)微滴的熒光信號進(jìn)行逐一分析，有熒光信號的微滴判讀為1，沒有熒光信號的微滴判讀為0。根據(jù)泊松分布原理以及陽性微滴的個(gè)數(shù)與比例即可得出靶分子起始拷貝數(shù)或濃度。技術(shù)優(yōu)勢：靈敏度高達(dá)0.001%；能克服核酸降解的不利影響；所需樣本量少；可統(tǒng)計(jì)突變率；缺點(diǎn)：模板添加量要求較高(濃度過高導(dǎo)致全部孔都有信號，濃度過低陽性信號孔過少，均不準(zhǔn)確)；對引物特異性要求高。PCRamplifiFcation*吟西馬dnipOilDe隧4崔h亦為1疋cydiwcDNAsample+日ssayPCRamplifiFcation*吟西馬dnipOilDe隧4崔h亦為1疋cydiwcDNAsample+日ssay弓SurfactartinierfoDcFiuerficariMniDiwteller3MakedropleteSource10mill血droplelsper50|jLcCountdropletsCountjaiuplBts"■aYdropletsDigital]fluKxigscent(froplBlsmD<DCUk?-~IDHIWTiIDWR132H2.MicrofluidicsforOn-ChipExtractionandDeteCt用于芯片內(nèi)提取和檢測的微流體)

c500nrnGmO>?"/flnnclTrml?ANAtaplire100MlEk(??c500nrnGmO>?"/flnnclTrml?ANAtaplire100MlEk(??trnflchronlev?Y'RhrtcaplurBtmadflierQuan^rtaEiVfiPCR樣品小于100u1；檢測時(shí)間小于3小時(shí)。Ion-ExchangeNanodetector（離子交換納米檢測器）原理：通過交錯(cuò)換能器在交流電流作用下壓電晶體表面產(chǎn)生表面聲波（saw）,實(shí)現(xiàn)了電動(dòng)勢的裂解。EVsReleasedRNAPEezo^lectricsubstratethroughmembraneEVsReleasedRNAPEezo^lectricsubstratethroughmembraneC、EVs蛋白的檢測技術(shù)細(xì)胞外囊泡的蛋白主要來源于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，并不來自細(xì)胞器。特別關(guān)注跨膜蛋白和包漿蛋白。外泌體膜蛋白主要有四分子交聯(lián)體大家族（CD9/CD63/CD81）,在膜轉(zhuǎn)運(yùn)和生物合成成熟起作用。但是這些蛋白并不只是在外泌體中存在。微囊泡膜蛋白主要有整合蛋白、選擇蛋白和CD40配體。細(xì)胞外囊泡還包括特異的跨膜蛋白受體（皮生長受體（EGFRs））和黏附蛋白（上皮細(xì)胞黏附分子EpCAM）細(xì)胞外囊泡囊內(nèi)蛋白：TSG101/ALIX/annexins/Rabs,在膜轉(zhuǎn)運(yùn)中起作用；骨架蛋白（肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白、微管蛋白）；分子伴侶HSPs；代謝酶GAPDH。

ComparisonofnewtechnologiesJorEVprorcindetjectiunPlHtlbrmSenrsin^iikc^haik^mDcti^ctionIJinilAdvLuila^K^Limitilkin^]lead-basDdlflowDyLommn'EVscaptuncdonbeads田口dlabeled■Hi^hthroughputWellesrablKhedmeshod*RclathielyhighcdsjSforinstniiincntSimllpardubflowcylomelrySeoneriiLg；fluoi^^eni^*Siugl^EVmoLeculnjChiracLcriastionsp?￡iali.zKdiraKirumirnil^lijoai*InsensitiveforsmallEVidentifk^ilianExoScrccnPfiDtoseiiEitizcrbeads■WasHi-firceHighfhroughput』Detixlsvesicles<20QrifnMicroNMRNMR-I『rv6-LjWriuiivgbiologicalhackgruund■Lwihrou^hpiildPLEXSPR-I0MVsLnbd伽dctcclicHiHighly^^nsicivvHighthrou^hjput*Requ血speciali.redplEksrnoiiicchipMUXEl-cccrochcmical-10*EVeEasyIduseLflu1clevi朋tos-T*McMdiunnthroughput1.WesternBlottingandELISAbSubstraEe*BittinylMd國"bSubstraEe*BittinylMd國"SA-HIUraittlbody(jnli-CDaiorCD9)嗎Captureantibody(9nlhCt>?)B更壟￡sddUJN<&.一口￡041(1fB更壟￡sddUJN<&.一口￡041(1f1Q246?10Surfacearea(tlO*1nm2)Id七CD61+!180(49.72%)10?10JDyUgtiM88微型核磁共振原理：由于大多數(shù)生物實(shí)體缺乏鐵磁性背景，當(dāng)它們被納米磁珠（MNPs）靶向時(shí)，此時(shí)它們與原生的生物實(shí)體形成強(qiáng)烈對比。在基于核磁共振NMR）的磁檢測中，將MNPs置于NMR磁場中，會產(chǎn)生局部磁場，改變周圍水分子的橫向弛豫速率，從而放大分析信號。檢測靈敏度是westernblot和ELISA的?103倍。CircvJi3lingEVsMicrocoilInletsCircvJi3lingEVsMicrocoilInlets折射角達(dá)到90。折射角達(dá)到90。時(shí)，折射光將完全消失，而只剩下反射光，這種現(xiàn)象叫做全反射。（圖度，再沿界面流動(dòng)約半個(gè)波長再返回光密介質(zhì)。則透過光疏介質(zhì)的波被稱為消逝波；

2、等離子體通常指由密度相當(dāng)高的自由正、負(fù)電荷組成的氣體，其中正、負(fù)帶電粒子數(shù)目幾乎相等。把金屬表面的價(jià)電子看成是均勻正電荷背景下運(yùn)動(dòng)的電子氣體，這實(shí)際上也是一種等離子體。當(dāng)金屬受電磁干擾時(shí)，金屬內(nèi)部的電子密度分布會變得不均勻。因?yàn)閹靵隽Φ拇嬖冢瑫⒉糠蛛娮游秸姾蛇^剩的區(qū)域，被吸引的電子由于獲得動(dòng)量，故不會在引力與斥力的平衡位置停下而向前運(yùn)動(dòng)一段距離，之后電子間存在的斥力會迫使已經(jīng)聚集起來的電子再次離開該區(qū)域。由此會形成一種整個(gè)電子系統(tǒng)的集體震蕩，而庫侖力的存在使得這種集體震蕩反復(fù)進(jìn)行，進(jìn)而形成的震蕩稱等離子震蕩，并以波的形式表現(xiàn)，稱為等離子波。強(qiáng)在一定角度時(shí)大大減弱，其中是反射光完全消失的角就是SPR角。SPR角隨金表面折射率變化而變化，而折射率的變化又與金表面結(jié)合的分子質(zhì)量成正比。因此可以通過對生物反應(yīng)過程中SPR角的動(dòng)態(tài)變化獲取生物分子之間相互作用的特異信號。FlawcharinelSensorchip.GoldfilmReflKt&dPolarizedincidentII強(qiáng)在一定角度時(shí)大大減弱，其中是反射光完全消失的角就是SPR角。SPR角隨金表面折射率變化而變化，而折射率的變化又與金表面結(jié)合的分子質(zhì)量成正比。因此可以通過對生物反應(yīng)過程中SPR角的動(dòng)態(tài)變化獲取生物分子之間相互作用的特異信號。FlawcharinelSensorchip.GoldfilmReflKt&dPolarizedincidentII腆、D?r?3$ednreniity才thfrretcnanceingleLightsourceDeLectar