單克隆抗體和基因工程抗體的制備

關(guān)于單克隆抗體和基因工程抗體的制備第一頁，共六十八頁，2022年，8月28日目的要求1.掌握雜交瘤技術(shù)的基本原理2.熟悉單克隆抗體的制備技術(shù)3.熟悉基因工程抗體技術(shù)第二頁，共六十八頁，2022年，8月28日

大多數(shù)抗原分子具有多個抗原決定簇（表位，epitope）。一個抗原決定簇刺激一個B細胞克隆產(chǎn)生一種特異性抗體，一種抗原刺激機體產(chǎn)生多種抗體稱為多克隆抗體（polyclonalantibody,PcAb）如免疫血清。由一個只識別一種抗原表位的B細胞克隆產(chǎn)生的同源抗體稱為單克隆抗體(monoclonalantibody,McAb)。概述第三頁，共六十八頁，2022年，8月28日單克隆抗體理化性狀高度均一，其抗原結(jié)合部位完全相同，生物活性專一，特異性強，純度高，效價高，易于實驗標準化及大量制備，是研究抗體的一重大突破。應用比較廣，如試劑診斷盒、治療腫瘤、器官移植及自身免疫病等。第四頁，共六十八頁，2022年，8月28日

第一節(jié)雜交瘤技術(shù)的基本原理

基本原理是融合的兩種細胞保持自身的特性，產(chǎn)生具有原來兩個細胞基因信息的單個核細胞稱為雜交細胞。包括B細胞、T細胞，前者產(chǎn)生Ig，后者產(chǎn)生CK。第五頁，共六十八頁，2022年，8月28日

一、B淋巴細胞雜交瘤技術(shù)

細胞是經(jīng)抗原免疫的小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞。B細胞能產(chǎn)生抗體，但不能在體外長期生長，而骨髓瘤細胞不產(chǎn)生抗體但在體外能長期生長，二者融合，各保持其本性，既產(chǎn)生抗體又長期生長。其原理分為幾個步驟第六頁，共六十八頁，2022年，8月28日

目的是制備抗原特異的McAb，所以融合的細胞必須經(jīng)抗原免疫的B細胞，通常取脾，另一是在體外長期生長又不產(chǎn)生抗體，所以選腫瘤細胞即多發(fā)性骨髓瘤細胞，具備以下特點：

（一）細胞的選擇與融合第七頁，共六十八頁，2022年，8月28日1.穩(wěn)定、易培養(yǎng)

2.自身不分泌Ig或CK3.融合率高

4.是HGPRT缺陷株

第八頁，共六十八頁，2022年，8月28日

目前常用的BALB/c小鼠B細胞瘤株有P3-X63-Ag8.653C（P3.653）、Sp2/0等。為HAT敏感株，易培養(yǎng),融合率高，最常選用聚乙二醇(PEG)使細胞膜輕度損傷，細胞容易融合。第九頁，共六十八頁，2022年，8月28日

（二）選擇培養(yǎng)基的應用

細胞融合是一個隨機的物理過程。融合后可能出現(xiàn)以下情況:1）脾細胞與瘤細胞

2）瘤細胞與瘤細胞

3）脾細胞與脾細胞

4）未融合的脾細胞

5）未融合的瘤細胞

6）多聚體形式。

3）、4）、6）在體外易死去，不需篩選。第十頁，共六十八頁，2022年，8月28日第十一頁，共六十八頁，2022年，8月28日細胞的DNA合成一般有兩條途徑

一是糖和氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，進一步合成DNA，葉酸是重要輔酶。

一是輔助途徑，是在次黃嘌呤和胸腺嘧啶存在下，經(jīng)次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（hypoxanthineguaninephospheribosyltransferase,HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（thymidinekinase,TK）的催化作用合成DNA。第十二頁，共六十八頁，2022年，8月28日

氨基蝶呤是葉酸的拮抗劑，當氨基蝶呤存在時，能阻斷第一條途徑。細胞融合的選擇培養(yǎng)基中有三種關(guān)鍵成分，次黃嘌呤(hypoxanthine,H)、氨基蝶呤(aminopoterin,A)、胸腺嘧啶核苷(thymidine,T)，三者取前綴縮寫為HAT培養(yǎng)基，其融合細胞所用的瘤細胞是經(jīng)毒性培養(yǎng)基選擇出來的HGPRT陰性細胞株。第十三頁，共六十八頁，2022年，8月28日所以，前面提到的2）瘤細胞與瘤細胞及5)未融合的瘤細胞不能生長，只有1）脾細胞與瘤細胞才能生長，因為脾細胞為HGPRT陽性，通過補償途徑代替氨基蝶呤阻斷的主要途徑。第十四頁，共六十八頁，2022年，8月28日

（三）有限稀釋與抗原特異性選擇

在免疫動物時，一種抗原往往有多個表位，一個B細胞克隆接受一個表位，故在免疫動物時是眾多B細胞克隆的抗體的分泌，而針對目的抗原的B細胞只占很少部分，在細胞融合后，有相當一部分是無關(guān)的細胞融合體，即融合細胞分泌的不是目的抗體，要進行篩選，分二步稀釋。第十五頁，共六十八頁，2022年，8月28日計數(shù)，每個孔只放一個細胞，實際是0至數(shù)個，整個過程為克隆化，將陽性細胞株重復一次，盡量使抗體更純，將陽性細胞進行增殖，部分凍存，部分進行體外培養(yǎng)或動物接種。第十六頁，共六十八頁，2022年，8月28日

另外還有其他雜交瘤技術(shù)，如人-人B淋巴細胞雜交瘤和鼠-人B淋巴細胞雜交瘤，人骨髓瘤細胞系體外建株比較困難，生長不穩(wěn)定，有的分泌IgE，有的分泌Ig的γ、κ鏈。B細胞取外周血淋巴細胞、脾細胞、淋巴結(jié)細胞、病灶浸潤性淋巴細胞。從理論上講很好，但實際比較困難，在于缺乏好的親體骨髓瘤細胞株，較難獲得抗原特異性B淋巴細胞；人雜交瘤細胞不能在小鼠或其他動物體內(nèi)生長。

第十七頁，共六十八頁，2022年，8月28日小鼠骨髓瘤與人的B細胞雜交瘤，該技術(shù)優(yōu)點是易獲得小鼠骨髓瘤細胞，融合率較高，但最大的缺點是不同種雜交后不穩(wěn)定，雜交瘤傳代后，很快喪失分泌抗體的染色體。第十八頁，共六十八頁，2022年，8月28日二、T細胞雜交瘤

自B細胞雜交瘤技術(shù)后，T淋巴細胞雜交瘤成為熱門，為獲得淋巴因子，更深入地研究T細胞的各種功能，雖然有一些小鼠T細胞雜交瘤成功的報道，但結(jié)果不滿意，該細胞很不穩(wěn)定，分泌淋巴因子無特異性，一種T細胞雜交瘤可同時分泌幾種淋巴因子，到目前仍無突破性進展。第十九頁，共六十八頁，2022年，8月28日T淋巴細胞雜交瘤分為小鼠及人，由于T細胞功能的多樣化，制備出的T細胞雜交瘤也各有其特性，如分泌淋巴因子，特異性殺傷功能，分泌抑制因子，自身反應性等。其基本過程是將激活的T細胞與酶缺陷型T淋巴細胞瘤細胞融合，可表達特異性TCR或其他功能的雜交瘤T細胞，與B細胞相以，但細胞激活和陽性克隆篩選較為雜交，不穩(wěn)定，簡介主要步驟。第二十頁，共六十八頁，2022年，8月28日1.淋巴瘤細胞系的選擇1）體外無限制快速生長2）融合率高3）不分泌淋巴因子和殺傷功能4）缺乏某一特異性表面抗原或受體5）HGPRT酶缺陷型第二十一頁，共六十八頁，2022年，8月28日

2.特異性T細胞的制備與純化主要有可溶性抗原誘導激活的T細胞、同種反應性T細胞、人的特異性T細胞。第二十二頁，共六十八頁，2022年，8月28日

3.T細胞雜交瘤的篩選通常在含有HAT選擇培養(yǎng)基上，用特異性抗體篩選產(chǎn)生淋巴因子的雜交瘤細胞，用抗CD3-TCR抗體篩選陽性細胞。第二十三頁，共六十八頁，2022年，8月28日

三、陽性雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)

雜交瘤細胞形成的初期很不穩(wěn)定，鼠的二倍體細胞有40對染色體，雜交后80對，易丟失，丟失后仍生長，要檢測上清液中是否有目的抗體及淋巴因子。第二十四頁，共六十八頁，2022年，8月28日將陽性細胞進行單細胞培養(yǎng)，反復2～3次，確保為一單細胞陽性雜交瘤細胞應及時凍存，以防止細胞染色體丟失，發(fā)生變異或污染，凍存于液氮（-196℃）,凍存時加小牛血清至20%,加幾滴10%二甲亞砜。雜交瘤細胞培養(yǎng)可用液體、半固體、接種動物腹腔。第二十五頁，共六十八頁，2022年，8月28日第二節(jié)單克隆抗體的制備技術(shù)

McAb單一、特異、純化，利用雜交瘤技術(shù)制備McAb的基本原理是三個原則：

1）一種單克隆產(chǎn)生一種抗體

2）雜交瘤細胞保持雙親細胞特性

3）篩選培養(yǎng)基第二十六頁，共六十八頁，2022年，8月28日

一、單克隆抗體的產(chǎn)生

1.動物體內(nèi)生長雜交瘤細胞注射同系小鼠腹腔，先注射石蠟或不完全佐劑，使腹腔滲出液增多，1～2周后無菌方法抽取腹水，離心取上清。

第二十七頁，共六十八頁，2022年，8月28日

2.體外培養(yǎng)較常做，用普通培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)時間、細胞生長情況收取上清液。另有高密度培養(yǎng)，在單位體積內(nèi)增加細胞的培養(yǎng)數(shù)量。第二十八頁，共六十八頁，2022年，8月28日

二、單克隆抗體的純化

腹水或細胞上清液，均含有脂蛋白、脂質(zhì)及細胞碎片等雜質(zhì)，用濾紙去掉脂質(zhì)和大顆粒，離心去除細胞碎片和蛋白聚合物。第二十九頁，共六十八頁，2022年，8月28日目前純化方法有十幾種，一般采用鹽析、凝膠過濾、離子交換層析和辛酸提取等，現(xiàn)在最有效的方法是親和純化法，常用SPA或抗小鼠免疫球蛋白抗體與載體交聯(lián)。稱為Sepharose柱，抗體結(jié)合上去，然后洗脫。第三十頁，共六十八頁，2022年，8月28日

三、單克隆抗體的性質(zhì)鑒定

鑒定的方法很多，用已知抗原測定抗體，幾乎所有的抗原抗體反應試驗都可以作，如陽性，再定量，確定工作濃度。第三十一頁，共六十八頁，2022年，8月28日第三節(jié)基因工程抗體技術(shù)

雜交瘤單克隆抗體在診斷、治療、預防和蛋白質(zhì)提純應用中非常廣泛，但對人是異源性，人抗小鼠抗體，應用基因工程技術(shù)減少小鼠源成分，保留原有的抗體特異性。第三十二頁，共六十八頁，2022年，8月28日一、人源化抗體

人源化抗體主要指鼠源性單克隆抗體的基因克隆及DNA重組技術(shù)改造，重新表達的抗體。其大部分氨基酸序列為人源序列所取代，既基本保留親代鼠單克隆抗體的親和力和特異性，又降低了鼠異源性。第三十三頁，共六十八頁，2022年，8月28日

（一）人-鼠嵌合抗體

通過基因工程技術(shù)將人IgGC區(qū)與鼠IgGV區(qū)連接，導入細胞內(nèi)表達制備的抗體稱為嵌合抗體，因IgG的抗原性在C區(qū)，來自人，故抗原性降低，且半衰期明顯延長，在介導CDC及ADCC亦明顯增強。

第三十四頁，共六十八頁，2022年，8月28日

1.鼠單克隆抗體可變區(qū)基因克隆用探針從該雜交瘤細胞的基因組文庫中調(diào)取。用PCR方法從該細胞的RNA中擴增VH

及VL

基因。第三十五頁，共六十八頁，2022年，8月28日

2.表達載體的構(gòu)建人-鼠嵌合抗體的表達載體基因依可變區(qū)基因克隆的表達方式不同而分為兩類，從基因文庫所克隆的可變區(qū)基因帶有上游的轉(zhuǎn)錄調(diào)控組件及內(nèi)含子剪接信號，因此載體只需要包括細胞內(nèi)增殖所必須的抗生素抗性基因和質(zhì)粒復制的起始序列以及在真核細胞進行選擇的顯性標記基因。

第三十六頁，共六十八頁，2022年，8月28日

將載體DNA導入真核細胞稱為轉(zhuǎn)染。導入的DNA整合至細胞基因組DNA中得到轉(zhuǎn)染子，要得到穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子需利用真核細胞的顯性選擇標記基因，這些標記基因使細胞獲得對某些細胞毒物質(zhì)的抗體，在培養(yǎng)液中加入相應的細胞毒物質(zhì)可殺死轉(zhuǎn)染不成功的細胞，達到選擇的目的。第三十七頁，共六十八頁，2022年，8月28日

3.表達用哺乳動物細胞或大腸桿菌表達量較少，而應用二氫葉酸還原酶（dhfr）擴增系統(tǒng)使抗體表達增強。dhfr是正常核酸代謝必須的酶，缺乏該酶的中華倉鼠卵細胞（CHO））需在有次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷條件下利用DNA合成，因此,dhfr作CHO的顯性選擇標記基因，在無次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷的情況下，只有導入dhfr基因，細胞才能存活。該糸統(tǒng)可用來擴增導入的目的基因。第三十八頁，共六十八頁，2022年，8月28日

(二)改形抗體（reshapedantibody,RAB）應用基因工程技術(shù)在嵌合抗體基礎(chǔ)上用人抗體可變區(qū)序列取代鼠源單抗CDR以外的骨架序列，重新構(gòu)成既有鼠源單抗的特異性又保持抗體親和力的人源化抗體，該抗體對人無免疫原性。第三十九頁，共六十八頁，2022年，8月28日

（三）抗體的表面修飾

人和鼠IgV區(qū)來自不同的種屬，輕鏈不同型別，互補性決定區(qū)(complementaritydeterminingregion,CDR)的長度可不一致，但暴露于表面的AA殘基的位置數(shù)量都很保守，通過改變表面殘基使其人源化，降低鼠可變區(qū)的異源性，將Fv的表面人源化，消除其免疫原性而不影響Fv

的整體空間構(gòu)象。第四十頁，共六十八頁，2022年，8月28日

（四）雙特異性抗體雙特異性抗體（bispecificantibody,BsAb）又稱雙功能抗體。兩個抗原結(jié)合部位具有不同的特異性，可以同時與兩種不同特異性抗原發(fā)生結(jié)合。第四十一頁，共六十八頁，2022年，8月28日

1.化學交聯(lián)BsAb分別分離純化兩種抗原的單抗，先使Ig解離后，獲得單價抗體，再使兩種不同抗原特異性的單價抗體或其片段交聯(lián)起來。該方法易致抗體失活，其產(chǎn)物也難以保證均質(zhì)性。第四十二頁，共六十八頁，2022年，8月28日

2.細胞工程BsAb將二種雜交瘤細胞進行融合產(chǎn)生雜交瘤，核酸隨機組合多種多樣。第四十三頁，共六十八頁，2022年，8月28日

3.基因工程BsAb用抗體分子片段如ScFv或Fab等，經(jīng)基因操作修飾后，或體外組裝成為BsAb，或直接導入受體細胞表達分泌BsAb。在免疫檢測、腫瘤放射免疫顯象、藥物剎傷、介導細胞剎傷效應起重要作用。第四十四頁，共六十八頁，2022年，8月28日

二、小分子抗體

具有結(jié)合抗原功能的分子片段稱為小分子抗體。其優(yōu)點：1）可在原核細胞表達，生產(chǎn)成本低;2）易于穿透血管或組織到靶細胞部位，有利于疾病的治療；3）不含F(xiàn)c段，副作用??；4）半衰期短，有利于毒素中和及清除。

第四十五頁，共六十八頁，2022年，8月28日

小分子抗體包括：抗原結(jié)合片段（fragmentofantigenbinding,Fab），可變區(qū)片段（fragmentofvariableregion,Fv）,單鏈抗體（singlechainFv,ScFv），單區(qū)抗體。另有VH和VL。第四十六頁，共六十八頁，2022年，8月28日

1.Fab

由一條完整的L鏈和約為1/2的H鏈組成，是完整抗體的1/3，只有一個Ag結(jié)合位點，它是將McAb重鏈V區(qū)和CH1區(qū)cDNA與完整輕鏈cDNA連接，在細胞啟動子的控制下分泌表達。第四十七頁，共六十八頁，2022年，8月28日

2.Fv和單鏈抗體（ScFv）

Fv由VH和VL構(gòu)成，非共價鍵結(jié)合，為完整抗體的1/6，單一抗原結(jié)合位點，VH和VL連接有三種方法：1）用戊二醛處理，使之交聯(lián)；2）引入半胱氨酸殘基，使VH和VL之間形成二硫鍵；3）把VH和VL用一段適當?shù)墓押塑账岱肿舆B接起來，表達成一個單鏈，稱為ScFv。第四十八頁，共六十八頁，2022年，8月28日

3.單區(qū)抗體及最小識別單位根據(jù)抗體分子的結(jié)構(gòu)，一般將Fv

稱為抗體的最小單位，但有些更小亞單位仍結(jié)合抗原，如單獨重鏈VH仍可保留相當程度抗原結(jié)合能力，其作用比VL大，稱為單區(qū)抗體（singledomainantibody），其親和力低于完整的Fv，因單區(qū)抗體的疏水區(qū)的暴露，增加了非特異性吸附，水溶性減低，其應用受到限制，但分子量小，單位體積濃度高，副作用小，是很有前景的抗體部分。第四十九頁，共六十八頁，2022年，8月28日

將抗體分子片段與其他蛋白融合，可得到有多樣性生物功能的融合蛋白，有幾種構(gòu)建方式：

1）將Fab或ScFv與其他生物活性蛋白融合，建成生物導彈。

三、抗體融合蛋白第五十頁，共六十八頁，2022年，8月28日2）在融合時可根據(jù)某些恒定區(qū)，可使某些生物活性與抗體的生物學效應功能聯(lián)結(jié)在一起。

3）將ScFv與某些細胞膜蛋白融合，形成嵌合受體，使細胞結(jié)合抗原。第五十一頁，共六十八頁，2022年，8月28日

（一）含F(xiàn)v片段的抗體融合蛋白將Fv

與某些毒素、酶及細胞因子等的基因連接，能編碼Fv

與毒素、酶及細胞因子復合物，即生物導彈，主要在于抗腫瘤。第五十二頁，共六十八頁，2022年，8月28日

（二）嵌合受體將ScFv與某些細胞膜蛋白分子融合，形成的融合蛋白可表達于細胞表面。其抗體部分與相應抗原特異性結(jié)合。如將抗體的可變區(qū)基因與TCR的α鏈和β鏈恒定區(qū)融合，將融合基因?qū)隩細胞，既表達特異性抗體，又表達TCR，該TCR不受MHC分子限制。第五十三頁，共六十八頁，2022年，8月28日

（三）含F(xiàn)c的抗體融合蛋白如將CD4分子細胞膜外部分與Fc融合后用真核細胞表達，由二硫鍵連接成雙體，分泌到細胞外，產(chǎn)生二種功能：1）延長在血循環(huán)中的半衰期；2）通過功能蛋白與配體分子的作用，將Fc的生物學效應引導至特定目的，如CD4與Fc融合蛋白，CD4是T輔助細胞表面糖蛋白，是HIV的受體，該融合蛋白能競爭結(jié)合HIV，可阻斷HIV對TH的感染，可介導ADCC及CDC，可通過胎盤。第五十四頁，共六十八頁，2022年，8月28日

小分子抗體都是單價，不能偶聯(lián)。將特異性不同的兩個小分子抗體連接在一起可獲得雙特異性抗體。（bispecificantibody,BsAb），雙價ScFv與抗原結(jié)合比單價敏感性高，親和力大，結(jié)構(gòu)和功能上都更接近親本抗體。BsAb分子片段可從Fab、Fv

或ScFv

組建，可在體內(nèi)或體外連接。四、雙特異性抗體第五十五頁，共六十八頁，2022年，8月28日

在小分子抗體的羧基端設計半胱氨酸殘基，如帶鉸鏈區(qū)的Fab段或帶半胱氨酸殘基尾巴的ScFv，可在體外通過化學交聯(lián)成為雙價抗體分子，亮氨酸鉸鏈也可用來構(gòu)建，兩個不同抗體連接成為功能抗體。如抗體CD3和抗IL-2R的Fab在體外直接介導T細胞對表達IL-2的細胞有殺傷作用。

（一）雙價抗體分子的構(gòu)建1.體外構(gòu)建第五十六頁，共六十八頁，2022年，8月28日

對小分子抗體基因的改造修飾，使細胞直接表達雙抗體分子，比體外組建更有效，現(xiàn)有以下幾種方法:

2.雙抗體分子的細胞內(nèi)組建第五十七頁，共六十八頁，2022年，8月28日（1）設計促進雙聚體形成的結(jié)構(gòu)域，半胱氨酸是促進雙聚體形成的結(jié)構(gòu)域，使小分子抗體在大腸桿菌的分泌型表達過程中形成雙體，亮氨酸拉鏈和甲基（CH3）亦有螺旋—轉(zhuǎn)角—螺旋結(jié)構(gòu)，使之成為雙體。（2）在基因構(gòu)建上直接將兩個抗體分子片段融合。（3）雙體分子兩個ScFv的VH

和VL

相互配對，可產(chǎn)生雙價的雙抗體分子。第五十八頁，共六十八頁，2022年，8月28日

能同時結(jié)合兩種不同抗原，因而可介導標記物與靶抗原的結(jié)合，或某些高級分子定位于靶細胞。在臨床上有以下應用：

（二）雙特異性抗體的應用第五十九頁，共六十八頁，2022年，8月28日1.在免疫檢測中的應用一個臂結(jié)合靶抗原，另一個臂結(jié)合酶，不需用酶標記抗體，避免在標記過程中降低酶及抗體的活性。

2.在腫瘤放射免疫顯像中的應用一個臂結(jié)合腫瘤細胞，另一個臂結(jié)合半抗原螯合劑，半抗原螯合劑能選擇與放射性核素結(jié)合。放射免疫顯像，清晰度和靈敏度高。第六十頁，共六十八頁，2022年，8月28日

3.雙特異性抗體介導的藥物殺傷效應