乳清酸左卡尼汀對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠胃潰瘍的治療作用(一)

乳清酸左卡尼汀對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠胃潰瘍的治療作用(一)

作者：何健茹，王立軍，蘇玉虹【摘要】目的觀(guān)察乳清酸左卡尼汀對(duì)胃潰瘍的治療作用，并探討其抗?jié)兊南嚓P(guān)機(jī)制。方法大鼠胃潰瘍?cè)炷?應(yīng)用HE染色觀(guān)察大鼠胃潰瘍創(chuàng)面的愈合程度，Elisa法測(cè)胃潰瘍組織IL-8，IL-10的表達(dá)情況;應(yīng)用免疫組化法測(cè)胃潰瘍組織EGF的表達(dá)情況。結(jié)果乳清酸左卡尼汀低劑量組25mg/(kg·d)、乳清酸左卡尼汀中劑量組50mg/(kg·d)、乳清酸左卡尼汀高劑量組100mg/(kg·d)對(duì)胃潰瘍均有治療作用，中劑量效果接近于奧美拉唑。乳清酸左卡尼汀能夠降低組織MDA含量，增強(qiáng)SOD活性，通過(guò)抗氧化應(yīng)激治療潰瘍。乳清酸左卡尼汀通過(guò)抑制胃潰瘍組織炎癥因子IL-8,10表達(dá)而起到抗氧化作用。乳清酸左卡尼汀的抗?jié)冏饔门c其促進(jìn)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)表達(dá)有關(guān)。結(jié)論乳清酸左卡尼汀對(duì)胃潰瘍有治療作用，其機(jī)制可能與抗氧化應(yīng)激和促進(jìn)EGF表達(dá)有關(guān)。【關(guān)鍵詞】乳清酸左卡尼汀;胃潰瘍;抗氧化應(yīng)激;生長(zhǎng)因子;大鼠TheTreatmentEffectandMechanismResearchofCarnitine-orotateonGastricAcidLeftHEJianru1,WANGLijun2,SUYuhong1(1.LiaoningMedicalUniversity,Jinzhou121001China;2.ChongqingPoliceStation,Chongqing400020China)Abstract:ObjectiveToobservethetherapeuticeffectofCarnitine-orotateongastriculceranddiscusstherelevantmechanism.MethodsHEdyeingobservationwasappliedintotheratgastrichealingprocess.ElisatestIL-8,IL-10expression.ImmunohistochemicalmethodwasappliedtotesttheexpressionofEGF.Results①Carnitine-orotatecanhealgastriculcer.②Carnitine-orotatecanreduceMDAcontentoftheorganization,StrengthenSOD,Throughanti-oxidationstresstreatmentulcers.③Carnitine-orotateinhibitinflammatoryfactorIL-8,10expressionandplayaroleinanti-oxidation.④Carnitine-orotateresistanceandpromoteEGF.ConclusionsCarnitine-orotateiseffectivetotreatstomachulcersmainlythroughanti-oxidationstressesandpromotetheexpressionofEGF.Keywords:Carnitine-orotate;gastriculcer,antioxidantstress;growthfactor;rats左卡尼汀為一種氨基酸衍生物，是脂肪代謝必需的輔助因子，可促進(jìn)脂質(zhì)代謝，臨床上一直用于降血脂治療及調(diào)整胃腸道功能。隨著對(duì)該藥物研究的深入，近年研究發(fā)現(xiàn)，左卡尼汀有促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的作用，其機(jī)制為抗氧化作用。在此基礎(chǔ)上，我們?yōu)樽罂嵬〖尤肓艘粋€(gè)乳清酸基團(tuán)，形成了一種新的藥物乳清酸左卡尼汀或左卡尼汀乳清酸鹽。此藥還處于實(shí)驗(yàn)室研制階段，有研究發(fā)現(xiàn)左卡尼汀對(duì)急性肝損傷具有保護(hù)作用，但其作用于消化性潰瘍至今未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)大鼠消化性潰瘍動(dòng)物模型，觀(guān)察乳清酸左卡尼汀對(duì)消化性潰瘍的治療作用，并探討相關(guān)機(jī)制，從而為乳清酸左卡尼汀的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料與方法1.1材料1.1.1動(dòng)物與分組：健康SD雄性大鼠60只,體重為200g，由遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。按完全隨機(jī)設(shè)計(jì)法將其分成6組，每組10只,分別為：(1)正常對(duì)照組，無(wú)手術(shù)自由進(jìn)食水;(2)胃潰瘍模型組，手術(shù)后以1mL/100g生理鹽水灌胃;(3)乳清酸左卡尼汀低劑量組25mg/(kg·d);(4)乳清酸左卡尼汀中劑量組50mg/(kg·d);(5)乳清酸左卡尼汀高劑量組100mg/(kg·d);(6)奧美拉唑組14mg/(kg·d)。SD大鼠給藥劑量按動(dòng)物與人體的每千克體重等效劑量折算系數(shù)計(jì)算(公式：大鼠日服藥量=人日服藥量×0.16)，灌胃容積最大為2mL/100g。1.1.2主要試劑及藥品①乳清酸左卡尼汀，由錦州奧鴻藥業(yè)有限責(zé)任公司提供;②奧美拉唑，由錦州九泰藥業(yè)提供;③表皮生長(zhǎng)因子(Epidermisgrowthfactor，EGF)、過(guò)氧化物歧化酶(Proliferatingcellnuclearantigen，SOD)檢測(cè)試劑盒、丙二醛(MaleicDialdehyde，MDA)檢測(cè)試劑盒，由武漢博士德生物工程有限公司提供;④ELISA檢測(cè)試劑盒：上海西唐生物科技有限公司;⑤紫外分光光度計(jì)：日本島津。1.2方法1.2.1動(dòng)物造模：按照文獻(xiàn)用乙醚麻醉然后將固定于手術(shù)臺(tái)上,剪掉腹壁毛，常規(guī)消毒后，劍突下腹壁正中切口2～2.5cm暴露全胃，在胃體部與幽門(mén)竇交界處將微量注射器平刺入漿膜下0.4～0.5mm注入體積分?jǐn)?shù)為10%醋酸0.05mL形成丘疹,將胃送回腹腔,縫合腹壁，消毒傷口。術(shù)后2～3h內(nèi)均清醒過(guò)來(lái)，60只大鼠隨機(jī)分成6組(除外正常對(duì)照組)，造模周期為2天，第3天開(kāi)始給藥。乳清酸左卡尼汀高、中、低劑量治療組、奧美拉唑組分別以1mL/100g的容積按上述藥物劑量配成懸濁液給藥，模型組以1mL/100g的生理鹽水灌胃，正常對(duì)照組自由飲食，連續(xù)給藥10天。1.2.2取材：大鼠在連續(xù)灌胃給藥10天后，于末次給藥后禁食24小時(shí)，自由飲水，12天將大鼠麻醉后頸動(dòng)脈取血，分離血清并取材。以潰瘍部位為中心修剪胃壁組織，以潰瘍瘢痕平行于胃長(zhǎng)軸方向的最長(zhǎng)徑為中心取材，切取含潰瘍邊緣約3mm組織在內(nèi)的潰瘍組織塊(正常組在胃前壁近幽門(mén)處取組織)組織塊約1.0cm×1.2cm大小，分成兩部分。一部分體積分?jǐn)?shù)為0.10的中性甲醛固定，按照常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，5μm厚度連續(xù)切片，分別作HE染色和免疫組化使用;另一部分迅速放入EP管內(nèi)放入-80℃冰箱內(nèi)儲(chǔ)存，以備SOD、MDA和ELISA檢測(cè)IL-8，10表達(dá)的使用。1.2.3HE染色：取以上各組大鼠胃組織切片進(jìn)行HE染色，主要步驟如下:石蠟切片常規(guī)脫蠟至水(二甲苯I10min→二甲苯Ⅱ10min→體積分?jǐn)?shù)為1.00的乙醇I5min→體積分?jǐn)?shù)為1.00的乙醇Ⅱ5min→體積分?jǐn)?shù)為0.95的乙醇I5min→體積分?jǐn)?shù)為0.95的乙醇Ⅱ5min→體積分?jǐn)?shù)為0.90的乙醇5min→體積分?jǐn)?shù)為0.80的乙醇5min)→自來(lái)水沖洗1min→Harris蘇木素染液3～5min→流水沖洗1～2min→鹽酸酒精分化30～45s→流水沖洗10～20min至返藍(lán)→伊紅染液復(fù)染30～45s→梯度酒精脫水(體積分?jǐn)?shù)為0.80的乙醇5min→體積分?jǐn)?shù)為0.90的乙醇5min→體積分?jǐn)?shù)為0.95的乙醇I5min→體積分?jǐn)?shù)為0.95的乙醇Ⅱ5min→體積分?jǐn)?shù)為1.00的乙醇I5min→體積分?jǐn)?shù)為1.00的乙醇Ⅱ5min)，二甲苯透明(二甲苯I10min→二甲苯Ⅱ10min)，中性樹(shù)膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察各組的病理學(xué)變化。1.2.4免疫組織化學(xué)檢測(cè)EGF表達(dá)：取切片常規(guī)脫蠟按照免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，DAB顯色20min，自來(lái)水充分沖洗，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察。棕黃色顆粒狀為陽(yáng)性細(xì)胞。1.2.5組織中SOD、MDA含量測(cè)定：按SOD、MDA試劑盒操作。1.2.6酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定IL-8和IL-10的含量(enzyme-liknedimmunosobrentassay,ELISA)。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，形態(tài)學(xué)指標(biāo)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，進(jìn)行單因素方差分析及LSD檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1光鏡觀(guān)察結(jié)果2.1.1乳清酸左卡尼汀高劑量組100mg/(kg·d)、乳清酸左卡尼汀中劑量組50mg/(kg·d)、乳清酸左卡尼汀低劑量組25mg/(kg·d)、奧美拉唑組均可見(jiàn)不同程度的愈合，乳清酸左卡尼汀組的粘膜腺體排列較為整齊且密集，炎性細(xì)胞明顯減少，可見(jiàn)新生的腺體覆蓋潰瘍和增生的纖維結(jié)締組織，潰瘍底部有明顯肉芽組織形成，胃黏膜血管輕度擴(kuò)張、充血。乳清酸左卡尼汀低劑量組25mg/(kg·d)黏膜潰瘍清晰可見(jiàn)，愈合不是十分顯著。模型組部分區(qū)域黏膜壞死、脫落，局部腺體破壞明顯且排列極不規(guī)則，正常對(duì)照組大鼠的胃竇壁結(jié)構(gòu)完整，黏膜腺體排列整齊，見(jiàn)圖1。2.2EGF的陽(yáng)性表達(dá)EGF陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞膜、胞漿著色均為棕黃色，EGF主要定位于細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性表達(dá)以胃黏膜的壁細(xì)胞、頸部細(xì)胞為主。EGF免疫組化染色結(jié)果顯示，對(duì)照組EGF表達(dá)呈弱陽(yáng)性，奧美拉唑組表達(dá)為陽(yáng)性，乳清酸左卡尼汀高劑量組100mg/(kg·d)表達(dá)最強(qiáng)，未治療模型組與乳清酸左卡尼汀低劑量組25mg/(kg·d)表達(dá)最弱(圖2)。2.3大鼠胃組織和血清中丙二醛(MDA)含量從表1可見(jiàn)，空白對(duì)照組，乳清酸左卡尼汀高劑量組100mg/(kg·d)MDA含量與模型組比較差別有顯著性(P0.01)。2.4大鼠胃組織和血清中超氧化物歧化酶(SOD)含量3討論消化性潰瘍(PU)主要以上腹部反復(fù)疼痛，消化道粘膜、肌層和/或漿膜層受到損害為特征，包括胃潰瘍(Gastriculcer，GU)和十二指腸潰瘍(Duodenalulcer，DU)，發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，迄今仍末完全闡明，一般認(rèn)為主要與粘膜的防御因子(胃粘液-粘膜屏障、內(nèi)源性前列腺素、粘膜血流等)和攻擊因子(胃酸、胃蛋白酶、Helicobacterpylori幽門(mén)螺桿菌感染[1]、藥物)失衡有關(guān)。其中GU主要是防御因子削弱所致，而DU主要是攻擊因子增強(qiáng)造成。近年研究結(jié)果表明，體內(nèi)自由基過(guò)多可引起機(jī)體組織細(xì)胞損傷，導(dǎo)致多種疾病發(fā)生、發(fā)展甚至死亡。自由基是生物體產(chǎn)生并損害自身的毒性產(chǎn)物[2]，可引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化物，其中以MDA毒性作用最大，它的含量反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的速率及強(qiáng)度，可間接反應(yīng)組織受自由基損傷的程度，因此MDA是胃粘膜的攻擊因子之一。SOD是一種重要的抗氧化酶，可以清除超氧陰離子自由基，保護(hù)生物體免受自由基的攻擊，對(duì)機(jī)體的氧化及抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，因此SOD是胃粘膜的保護(hù)因子之一，其活力的高低間接反映了機(jī)體清除自由基的能力[3]。SOD和MDA可間接反應(yīng)自由基代謝水平。當(dāng)胃粘膜損傷時(shí)，表現(xiàn)為SOD的活性降低，MDA的含量升高。增強(qiáng)自由基清除能力，如增加SOD濃度或降低MDA含量，對(duì)胃粘膜可起到保護(hù)作用[4]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，乳清酸左卡尼汀能提高乙酸性胃潰瘍大鼠血清和胃組織中超氧化物歧化酶(SOD)的含量，降低MDA水平，從而消除氧自由基，消減過(guò)量的超氧陰離子對(duì)胃粘膜的損傷，提示該藥可提高機(jī)體抗氧化和清除自由基能力，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，改善自由基代謝，能有效地對(duì)乙酸誘發(fā)胃潰瘍大鼠粘膜起到促進(jìn)愈合作用，對(duì)于胃潰瘍病也是一種有效的制劑，這些結(jié)果為其用于治療消化性潰瘍提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究證實(shí)，乳清酸左卡尼汀將IL-8，10表達(dá)下調(diào)，通過(guò)抗氧化作用抑制了胃黏膜炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)了胃黏膜的屏障功能從而促進(jìn)潰瘍愈合，對(duì)潰瘍有明顯治療作用。分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)潰瘍的愈合是一個(gè)增殖或移形上皮細(xì)胞和結(jié)締組織成分去補(bǔ)充已損壞或壞死粘膜復(fù)雜的主動(dòng)過(guò)程[5]。要達(dá)到相當(dāng)?shù)臐冇腺|(zhì)量，將對(duì)治療藥物提出更高要求。而生長(zhǎng)因子就是其相對(duì)應(yīng)的受體結(jié)合從而刺激增殖、維持活力的一類(lèi)細(xì)胞因子[6]。EGF能明顯促進(jìn)表皮細(xì)胞生長(zhǎng)，還能刺激間質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)分化，在機(jī)體的整個(gè)生長(zhǎng)、發(fā)育和分化過(guò)程中都離不開(kāi)EGF的參與[7]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，乳清酸左卡尼汀將EGF表達(dá)上調(diào)。EGF對(duì)消化道粘膜有明顯保護(hù)作用，且通過(guò)促進(jìn)潰瘍邊緣上皮組織增殖、分化從而促進(jìn)潰瘍愈合，對(duì)潰瘍有明顯治療作用。本研究從分子生物學(xué)方面揭示了乳清酸左卡尼汀抗胃潰瘍到治療作用及其作用機(jī)制。由于消化性潰瘍病因極其復(fù)雜[8]，機(jī)體的精神因素、生活習(xí)慣都可導(dǎo)致胃潰瘍的發(fā)生[9]，乳清酸左卡尼汀是否抗HP，以及抗?jié)冏饔门c機(jī)體免疫功能調(diào)節(jié)有何關(guān)系等，還有待進(jìn)一步研究。【參考文獻(xiàn)】

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