Takara-實(shí)驗(yàn)技能講座之Western-blot課件

蛋白相關(guān)產(chǎn)品介紹--WesternBlot上海皓嘉科技發(fā)展有限公司蛋白相關(guān)產(chǎn)品介紹--WesternBlot上海皓嘉科技發(fā)展什么是Westernblot？2

免疫印跡（immunoblotting）又稱(chēng)蛋白質(zhì)印跡（westernblot），它是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合，檢測(cè)復(fù)雜樣品中的某種蛋白質(zhì)的方法。westernblot是在凝膠電泳和固相免疫測(cè)定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新的免疫生化技術(shù)。由于免疫印跡具有SDS的高分辨力和固相免疫測(cè)定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。用途：常用于鑒定某種蛋白，并能對(duì)蛋白的豐度進(jìn)行定性和半定量分析。HRP標(biāo)記的二抗HRP底物(Luminol)化學(xué)發(fā)光

信號(hào)什么是Westernblot？2免疫印跡（immunoWesternblot步驟3

Westernblot步驟3樣品制備4

細(xì)胞裂解蛋白純化蛋白定量樣品制備4細(xì)胞蛋白蛋白細(xì)胞裂解5

xTractorBuffer635656xTractorBufferKit635623裂解細(xì)胞種類(lèi)：Bacterialcells、MammaliancellsYeastcells、Baculovirus-infectedcellsYeastProteinExtractionReagent9780酵母總蛋白質(zhì)提取試劑簡(jiǎn)捷、快速的提取酵母菌總蛋白質(zhì)的試劑蛋白酶抑制劑ProteoGuard?EDTA-FreeProteaseInhibitorCocktail635672Calpastatin7316細(xì)胞裂解液Calpain競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑細(xì)胞裂解：比較常用超聲波破碎法和酶溶破碎法。細(xì)胞裂解5xTractorBuffer635656xTr6

蛋白純化高特異性的Co2+樹(shù)脂：TALON系列高產(chǎn)量的Ni2+樹(shù)脂：His60Ni系列6

組氨酸標(biāo)簽融合蛋白質(zhì)的純化6蛋白純化高特異性的Co2+樹(shù)脂：TALON系列6組氨酸蛋白定量方法靈敏度時(shí)間原理干擾物質(zhì)說(shuō)明產(chǎn)品紫外吸收法20-100mg/ml快速

5-10分鐘蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收各種嘌呤和嘧啶；各種核苷酸干擾物質(zhì)較多Bradford法1-1000μg/ml快速

5分鐘考馬斯染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后，溶液的顏色發(fā)生變化。這種顏色的變化與溶液中的蛋白質(zhì)濃度成正比。表面活性劑：TritonX-100；SDS操作簡(jiǎn)便；可對(duì)含有還原劑的樣品進(jìn)行測(cè)定；顏色穩(wěn)定；顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化。TaKaRaBradfordProteinAssayKit（T9310A）BCA法0.02-2mg/ml較快速

30分鐘內(nèi)二價(jià)銅離子(Cu+2)在堿性條件下被蛋白質(zhì)的肽鍵還原成一價(jià)銅離子(Cu+)，兩個(gè)分子的BCA絡(luò)合一個(gè)一價(jià)銅離子(Cu+)，形成一種在562nm處有強(qiáng)吸收值的紫色復(fù)合物。螯合劑、還原劑：EDTA、EGTA、β-巰基乙醇不受蛋白質(zhì)種類(lèi)的影響；對(duì)表面活性劑的干擾影響小。TaKaRaBCAProteinAssayKit（T9300A）7

蛋白定量方法靈敏度時(shí)間原理干擾物質(zhì)說(shuō)明產(chǎn)品紫外吸收法20-18

相關(guān)產(chǎn)品方法名稱(chēng)Code包裝量?jī)r(jià)格（元）特點(diǎn)BCA法TaKaRaBCAProteinAssayKitT9300A500次700不受蛋白質(zhì)種類(lèi)的影響，在0.02～2mg/ml濃度范圍內(nèi)蛋白質(zhì)濃度與吸光度值成線性關(guān)系；對(duì)表面活性劑的干擾影響?。?種操作方法（標(biāo)準(zhǔn)操作方法；低濃度測(cè)定操作方法）Bradford法TaKaRaBradfordProteinAssayKitT9310A500次500操作簡(jiǎn)便，可快速地對(duì)濃度范圍在1～1,000μg/ml的蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行定量。可對(duì)含有還原劑的樣品進(jìn)行測(cè)定；2種操作方法（標(biāo)準(zhǔn)操作方法；低濃度測(cè)定操作方法）8

8相關(guān)產(chǎn)品方法名稱(chēng)Code包裝量?jī)r(jià)格（元）特點(diǎn)BCA法Ta9

Westernblot步驟9

電泳9Westernblot步驟9電泳電泳(SDS)10

蛋白分子量膠濃度

40kDa～80kDa12.5%小于40kDa15%大于80kDa10%凝膠的選擇樣品制備還原處理的樣品和非還原處理的樣品同時(shí)電泳分子量Marker的選擇預(yù)染蛋白marker普通蛋白marker設(shè)立對(duì)照樣品設(shè)立比對(duì)樣品空質(zhì)粒對(duì)照樣品、整個(gè)菌液、上清、沉淀對(duì)比樣品與檢測(cè)樣品同時(shí)電泳SDS電泳中蛋白質(zhì)分子所帶的電荷差異對(duì)電泳的影響是微乎其微的，可以忽略不計(jì)。SDS電泳中白質(zhì)的遷移速度與其分子量大小成反比，分子量越小，遷移速度越快。電泳(SDS)10蛋白分子量膠濃度40kDa11

相關(guān)產(chǎn)品11

CLEARLYStainedProteinLadder3454ACLEARLYProteinLadder(Unstained)3453ATris-Glycine-SDSBuffer(TG-SDS)Powder,pH8.3T9101Tris-GlycineBuffer(TG)Powder,pH8.3T9102TaKaRaCBBProteinSafeStainT9320A以CBB為主要成分制備的蛋白質(zhì)高靈敏度染色液迅速（染色5分鐘后可確認(rèn)蛋白質(zhì)片段）使用安全不含有害物質(zhì)甲醇和乙酸可使用去離子水進(jìn)行脫色2×ProteinSDSPAGELoadingBuffer91724×ProteinSDSPAGELoadingBuffer9173上樣loading預(yù)染Marker與非預(yù)染Marker電泳緩沖液染色液11相關(guān)產(chǎn)品11CLEARLYStainedProt12

電泳儀12

垂直電泳系列產(chǎn)品詳情請(qǐng)見(jiàn)：/genepro/depshow.asp?id=1437雙向電泳系列產(chǎn)品詳情請(qǐng)見(jiàn)：/genepro/depshow.asp?id=143812電泳儀12垂直電泳系列產(chǎn)品詳情請(qǐng)見(jiàn)：http://wWesternblot步驟13

轉(zhuǎn)膜Westernblot步驟13轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜14

膜的選擇常用的轉(zhuǎn)移膜主要有PVDF膜（Polyvinylidene-Fluoride）和硝酸纖維素膜。PVDF膜與目的蛋白的結(jié)合能力高，靈敏度高，不易破碎，同時(shí)也適用于再次標(biāo)記(Reprobing)（為了增加PVD膜的親水性，膜使用前需浸泡在甲醇中）。而硝酸纖維素膜雖不需要浸泡但極易破碎。☆膜標(biāo)記好正反面轉(zhuǎn)膜緩沖液Tris-GlycineBuffer(TG)Powder,pH8.3T9102轉(zhuǎn)膜：蛋白質(zhì)從SDS聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移到膜上。轉(zhuǎn)膜14膜的選擇☆膜標(biāo)記好正反面轉(zhuǎn)膜緩沖液Tris-Gly15

轉(zhuǎn)膜儀（轉(zhuǎn)印儀）15

水平半干轉(zhuǎn)印系列產(chǎn)品詳情請(qǐng)見(jiàn)：/genepro/depshow.asp?id=1440轉(zhuǎn)膜儀的選擇分為半干轉(zhuǎn)膜儀和濕電轉(zhuǎn)膜儀。濕法轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜效率高且轉(zhuǎn)膜均勻，但使用的電轉(zhuǎn)液液量多，需邊冷卻邊轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間長(zhǎng)（過(guò)夜）。而半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)膜時(shí)間短，只需要少量的電轉(zhuǎn)液。15轉(zhuǎn)膜儀（轉(zhuǎn)印儀）15水平半干轉(zhuǎn)印系列產(chǎn)品詳情請(qǐng)見(jiàn)：hWesternblot步驟16

封閉Westernblot步驟16封閉封閉封閉劑的選擇有時(shí)特定的封閉劑達(dá)不到預(yù)期的封閉效果。另外封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)抑制抗原抗體反應(yīng)及標(biāo)記抗體的酶活性，應(yīng)準(zhǔn)備幾種封閉劑進(jìn)行點(diǎn)雜交預(yù)研討實(shí)驗(yàn)選擇合適的封閉劑。17

☆注意避免讓膜變干封閉的作用：為了防止蛋白檢測(cè)用抗體非特異性與膜結(jié)合，對(duì)未結(jié)合蛋白的膜區(qū)域進(jìn)行封閉很重要。封閉封閉劑的選擇17☆注意避免讓膜變干封閉的作用：為了防止18

相關(guān)產(chǎn)品18

WesternBLoTBlockingBuffer(FishGelatin)T7131AWesternBLoTBlockingBuffer(ProteinFree）T7132A在TBS-TBuffer含有魚(yú)源明膠的封閉緩沖液。同哺乳動(dòng)物來(lái)源的奶粉和BSA相比，不會(huì)與哺乳動(dòng)物來(lái)源抗體出現(xiàn)非特異性交叉反應(yīng)?？梢种票尘埃軌蛎鞔_地檢測(cè)出抗原。不含蛋白質(zhì)（ProteinFree）的化學(xué)成分封閉緩沖液。同一般的脫脂奶粉相比，可提高檢測(cè)靈敏度。有效地用于檢測(cè)磷酸化蛋白質(zhì)。18相關(guān)產(chǎn)品18WesternBLoTBlockin19

洗滌洗滌液的選擇一般使用PBS或TBS緩沖液。根據(jù)目的蛋白和檢測(cè)試劑選擇洗滌液。選擇不含抑制HRP的疊氮化鈉的洗滌液比較好。磷酸化蛋白質(zhì)適合使用TBS緩沖液或含Tween20的TBS緩沖液。19

TrisBufferedSalinewithTween?20(TBS-T)Tablets,pH7.6T9142

ELISA、WesternBlotting的清洗Buffer或封閉Buffer。

抗體稀釋。TrisBufferedSaline(TBS)Tablets,pH7.6T9141

ELISA、WesternBlotting、免疫組織染色用的清洗Buffer。

樣品稀釋。PhosphateBufferedSalinewithTween?20(PBS-T)Tablets,pH7.4T9183

ELISA、WesternBlotting的清洗Buffer或封閉Buffer。

抗體稀釋。PhosphateBufferedSaline(PBS)Tablets,pH7.4T9181

ELISA、WesternBlotting、免疫組織染色用的清洗Buffer。

清洗細(xì)胞。

樣品稀釋。WesternBlotting操作過(guò)程中需洗膜，洗膜可除去未反應(yīng)的試劑，抑制背景。19洗滌洗滌液的選擇19TrisBufferedSa20

Westernblot步驟20

一抗孵育二抗孵育20Westernblot步驟20一抗孵育二抗孵育一抗孵育一抗的選擇抗體有識(shí)別1個(gè)抗原決定簇的單克隆抗體和識(shí)別多個(gè)抗原決定簇的多克隆抗體。另外有的抗體識(shí)別一級(jí)結(jié)構(gòu)，有的抗體識(shí)別立體結(jié)構(gòu)，后者不能與變性或還原的蛋白質(zhì)結(jié)合。制備抗體時(shí)，如果免疫原是變性蛋白，那么制備的抗體只能與變性蛋白結(jié)合，不能與天然蛋白質(zhì)結(jié)合。用于WesternBlotting的一抗一般都有銷(xiāo)售。購(gòu)買(mǎi)抗體時(shí)要考慮以上幾點(diǎn)，選擇抗體時(shí)，對(duì)同一個(gè)抗原的不同類(lèi)型抗體在產(chǎn)品數(shù)據(jù)上進(jìn)行詳細(xì)調(diào)查后再購(gòu)買(mǎi)，盡量使用特異性高的單克隆抗體。反應(yīng)方法減少失敗的最好方法是將高度稀釋的低濃度抗體溶液添加到托盤(pán)中，放入膜后，4℃緩慢搖動(dòng)過(guò)夜孵育。如果抗體使用量有限制，建議使用雜交袋，使用雜交袋時(shí)要確保不能有氣泡。21

使用一抗進(jìn)行目的蛋白的檢測(cè)。一抗孵育一抗的選擇21使用一抗進(jìn)行目的蛋白的檢測(cè)?？贵w查詢(xún)22

http://www.takara-bio.co.jp/antibody_search/antibody_search.php抗體種類(lèi)細(xì)胞間連接、鈣粘著蛋白抗體細(xì)胞外基質(zhì)關(guān)聯(lián)骨代謝關(guān)聯(lián)血小板關(guān)聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo)關(guān)聯(lián)等疾病相關(guān)抗體（IBL）His標(biāo)簽抗體抗體查詢(xún)22http://www.takara-bio.c二抗孵育二抗的選擇可從不同宿主獲得的二抗，如果背景較高，使用另一種宿主的二抗可減少背景。還銷(xiāo)售宿主以外的對(duì)動(dòng)物種屬來(lái)源血清蛋白進(jìn)行吸收操作的抗體。確認(rèn)動(dòng)物種屬后根據(jù)檢測(cè)方法選擇合適的抗體。一般使用HRP（辣根過(guò)氧化物酶）標(biāo)記的二抗進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的方法。其它還有使用AP（堿性磷酸酶）標(biāo)記抗體（對(duì)發(fā)光物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)）、熒光物質(zhì)及放射性同位素標(biāo)記的二抗。23

使用二抗進(jìn)行一抗的檢測(cè)。二抗孵育前應(yīng)進(jìn)行點(diǎn)雜交預(yù)實(shí)驗(yàn)，研討二抗的正確使用量。二抗孵育二抗的選擇23使用二抗進(jìn)行一抗的檢測(cè)。二抗孵育前應(yīng)Westernblot快速檢出試劑（二抗替代物）

--WesternBLoTRapidDetectv2.024

短時(shí)間內(nèi)有效的進(jìn)行抗體反應(yīng)，可以使用Rapid操作方法提高檢出感度，

IgGDetector標(biāo)

記50個(gè)HRP分子

增加信號(hào)強(qiáng)度。動(dòng)物種HRP標(biāo)記二抗替代物（檢測(cè)MouseIgG時(shí)需要使用Enhancer，不能替代goatIgG、humanIgG3二抗）WesternBLoTRapidDetectv2.0T7122A50次3170元Westernblot快速檢出試劑（二抗替代物）

Westernblot步驟25

檢測(cè)化學(xué)發(fā)光

檢測(cè)Westernblot步驟25檢測(cè)化學(xué)發(fā)光

檢測(cè)檢測(cè)(化學(xué)發(fā)光?顯色)按照各試劑的操作流程進(jìn)行重復(fù)操作，研討最佳實(shí)驗(yàn)條件。將轉(zhuǎn)膜后的膜放置在保鮮膜上，將檢測(cè)試劑滴加在膜上，確保試劑均勻覆蓋在膜上。因目的蛋白的濃度和使用的抗體濃度不同，膠片曝光條件也不同，因此要進(jìn)行預(yù)研討實(shí)驗(yàn)。在發(fā)光持續(xù)時(shí)間內(nèi)可改變膠片曝光條件進(jìn)行多次檢測(cè)。26

檢測(cè)方法有化學(xué)發(fā)光法和顯色法。顯色法操作簡(jiǎn)便，但化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法檢測(cè)靈敏度高，一般經(jīng)常使用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)法是利用基質(zhì)被二抗的HRP分解時(shí)生成的有色物對(duì)目的蛋白的有無(wú)及蛋白量進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)(化學(xué)發(fā)光?顯色)按照各試劑的操作流程進(jìn)行重復(fù)操作，研討相關(guān)產(chǎn)品—化學(xué)發(fā)光27

產(chǎn)品名稱(chēng)Code包裝量?jī)r(jià)格（元）檢出靈敏度概要檢測(cè)方法WesternBLoTChemiluminescenceHRPSubstrateT7101A250ml1,600pg級(jí)其他公司同等產(chǎn)品發(fā)光強(qiáng)度比較XfilmWesternBLoTQuantHRPSubstrateT7102A100ml2,050低pg級(jí)發(fā)光持續(xù)而穩(wěn)定CCD成像、XfilmWesternBLoTHyperHRPSubstrateT7103A100ml2,500中fg級(jí)檢出靈敏度的比較CCD成像、XfilmWesternBLoTUltra

SensitiveHRPSubstrateT7104A100ml4,130低fg級(jí)檢出靈敏度和抗體用量CCD成像、Xfilm相關(guān)產(chǎn)品—化學(xué)發(fā)光27產(chǎn)品名稱(chēng)Code包裝量?jī)r(jià)格檢出靈敏度28

發(fā)光強(qiáng)度比較28

WesternBLoTChemiluminescentHRPSubstrate（Code：T7101A）同其他公司同等HRP反應(yīng)基質(zhì)制品比較，利用HRP標(biāo)記二抗（39~5,000pg）進(jìn)行slotblot檢測(cè)發(fā)光信號(hào)?？贵w：GoatAnti-MouseIgG(H+L)Peroxidaseconjugated膜：nitrocellulose使用WesternBLoTChemiluminescentHRPSubstrate可高靈敏度地檢測(cè)出清晰的信號(hào)（曝光時(shí)間：5秒、Xfilm。本公司數(shù)據(jù)）明亮的發(fā)光信號(hào)28發(fā)光強(qiáng)度比較28WesternBLoTChemi29

發(fā)光持續(xù)而穩(wěn)定29

穩(wěn)定發(fā)光持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)使用WesternBLoTQuantHRPSubstrate（制品Code：T7102A）利用slotblot方法可以確認(rèn)發(fā)光的持續(xù)性sample：人Transferrin，200ng起始2倍梯度稀釋一抗：Goatanti-HumanTransferrinAffinityPurified二抗：AffinityPurifiedAntibody-Anti-GoatIgG(H+L)Peroxidaselabeled從反應(yīng)開(kāi)始90min，發(fā)光還持續(xù)穩(wěn)定，一次反應(yīng)也可重復(fù)進(jìn)行曝光檢測(cè)。本公司數(shù)據(jù)29發(fā)光持續(xù)而穩(wěn)定29穩(wěn)定發(fā)光持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)使用Wester30

檢出靈敏度比較30

使用少量抗體，可進(jìn)行高靈敏度檢出HeLa細(xì)胞裂解液梯度稀釋后作為樣品，改變抗體使用量，western

blot檢測(cè)出GAPDH。sample：HeLa細(xì)胞裂解液總蛋白，從10μg起始2倍梯度稀釋一抗：Anti-Glyceraldehyde-3-PhosphateDehydrogenase,clone6C5（1mg/ml）二抗：PierceGoatAnti-MouseIgG(H+L)Peroxidaseconjugated（0.8mg/ml）<抗體的稀釋倍數(shù)>使用WesternBLoTHyper

Substrate（T7103A）更少的抗體量也可以檢出本公司數(shù)據(jù)30檢出靈敏度比較30使用少量抗體，可進(jìn)行高靈敏度檢出H31

檢出靈敏度和抗體使用量Hela細(xì)胞裂解液梯度稀釋的樣品，SDS電泳后，根據(jù)制品的靈敏度調(diào)整抗體稀釋倍數(shù)，Westernblot檢出GAPDH。31

Sample：HeLa細(xì)胞裂解液總蛋白，從10μg起始2倍梯度稀釋一抗：Anti-Glyceraldehyde-3-PhosphateDehydrogenase,clone6C5（1mg/ml）（MerckMillipore）二抗：PierceGoatAnti-MouseIgG(H+L)Peroxidaseconjugated（0.8mg/ml）使用WesternBLoTUltraSensitive即使減少抗體使用量也可進(jìn)行高靈敏度檢測(cè)本公司數(shù)據(jù)31檢出靈敏度和抗體使用量Hela細(xì)胞裂解液梯度稀釋的樣品32

檢測(cè)增強(qiáng)劑32

適用于包括Western印跡和ELISA在內(nèi)的各種免疫檢測(cè)可提高最終的檢測(cè)靈敏度(從數(shù)倍到數(shù)十倍)不影響辣根過(guò)氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)活性兼容于交聯(lián)二抗的酶和使用任何一種檢測(cè)方法(如：比色檢測(cè)法或發(fā)光檢測(cè)法)檢測(cè)HumanTransferrin（各種抗體稀釋液使用情況比較）1TBS-T2WesternBLoTImmunoBooster（code：T7111A）3A社反応促進(jìn)試薬4WesternBLoTImmunoBoosterPF（code：T7115A）抗體稀釋?zhuān)嚎贵w稀釋溶液情況如下：

ImmunoBooster本公司數(shù)據(jù)32檢測(cè)增強(qiáng)劑32適用于包括Western印跡和ELIS33

檢測(cè)系統(tǒng)33

生物發(fā)光檢測(cè)(冷光儀)系統(tǒng)詳情請(qǐng)見(jiàn)：/genepro/depshow.asp?id=145033檢測(cè)系統(tǒng)33生物發(fā)光檢測(cè)(冷光儀)系統(tǒng)詳情請(qǐng)見(jiàn)：洗膜·重新標(biāo)記34

Western進(jìn)行了膜上的一抗及二抗的消除試劑相對(duì)溫和的條件下（室溫，30分）的反應(yīng)WesternBLoTStrippingBuffer

T7135A1HeLaCellLysate10μg2HeLaCellLysate5μg3HeLaCellLysate2μg4HeLaCellLysate1.25μg5HeLaCellLysate0.625μg1．β-actinの検出（第一次抗原?抗體反應(yīng)）Stripping（條件:室溫、30分、0.25ml/cm2membrane）2．GAPDHの検出（第二次抗原?抗體反應(yīng)）Stripping（條件:室溫、30分、0.25ml/cm2membrane）3．α-Tubulinの検出（第三次抗原?抗體反應(yīng)）4．殘存抗體の検出Stripping（條件:室溫、30分、0.25ml/cm2membrane）本公司數(shù)據(jù)洗膜·重新標(biāo)記34Western進(jìn)行了膜上的一抗及二抗的消35

常見(jiàn)技術(shù)問(wèn)答有污漬或斑點(diǎn)，整體背景普遍偏高出現(xiàn)白色條帶出現(xiàn)非特異性條帶信號(hào)弱或無(wú)信號(hào)膜上部分無(wú)信號(hào)條帶擴(kuò)散35

35常見(jiàn)技術(shù)問(wèn)答有污漬或斑點(diǎn)，整體背景普遍偏高3536

洗膜不充分使用的膜有問(wèn)題封閉不充分使用的封閉劑不適合封閉劑與一抗或二抗有交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)器具有污染緩沖液有污染曝光時(shí)間過(guò)長(zhǎng)抗體濃度過(guò)高HRP標(biāo)記抗體發(fā)生

凝集使用雜交袋進(jìn)行抗體孵育時(shí)，雜交袋內(nèi)有殘留氣泡轉(zhuǎn)膜抗體封閉其他有污漬或斑點(diǎn)，整體背景普遍偏高36洗膜不充分封閉不充分實(shí)驗(yàn)器具有污染抗體濃度過(guò)高轉(zhuǎn)膜抗體37

20132015201401抗原、抗體檢測(cè)0203蛋白抗體量不充分標(biāo)記抗體失活膜上的抗原分解發(fā)光底物孵育時(shí)間過(guò)短曝光時(shí)間過(guò)短發(fā)光底物劣化蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜不成功目的蛋白質(zhì)量較差蛋白制備過(guò)程中降解膜上保存的蛋白質(zhì)分解目的蛋白blocking后被屏蔽洗膜、重新標(biāo)記洗膜、重新標(biāo)記信號(hào)弱或無(wú)信號(hào)WesternBLoTImmunoBooster（codeT7111A）WesternBLoTRapidDetectv2.0（codeT7122A）3720132015201401抗原、抗體檢測(cè)0203其他常見(jiàn)問(wèn)題38

膜上部分無(wú)信號(hào)轉(zhuǎn)膜不完全出現(xiàn)白色條帶抗體濃度過(guò)高出現(xiàn)非特異性條帶抗體濃度過(guò)高SDS對(duì)蛋白質(zhì)的非特異性吸附條帶擴(kuò)散抗體濃度過(guò)高電泳用的蛋白量過(guò)高其他問(wèn)題其他常見(jiàn)問(wèn)題38膜上部分無(wú)信號(hào)轉(zhuǎn)膜不完全出現(xiàn)白色條帶抗體濃相關(guān)產(chǎn)品方法名稱(chēng)Code包裝量?jī)r(jià)格（元）特點(diǎn)BCA法TaKaRaBCAProteinAssayKitT9300A500次700不受蛋白質(zhì)種類(lèi)的影響，在0.02～2mg/ml濃度范圍內(nèi)蛋白質(zhì)濃度與吸光度值成線性關(guān)系；對(duì)表面活性劑的干擾影響??；2種操作方法（標(biāo)準(zhǔn)操作方法；低濃度測(cè)定操作方法）Bradford法TaKaRaBradfordProteinAssayKitT9310A500次500操作簡(jiǎn)便，可快速地對(duì)濃度范圍在1～1,000μg/ml的蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行定量?？蓪?duì)含有還原劑的樣品進(jìn)行測(cè)定；2種操作方法（標(biāo)準(zhǔn)操作方法；低濃度測(cè)定操作方法）39

相關(guān)產(chǎn)品方法名稱(chēng)Code包裝量?jī)r(jià)格（元）特點(diǎn)BCA法TaKa特別推薦蛋白定量名稱(chēng)Code包裝量?jī)r(jià)格（元）優(yōu)惠價(jià)（元）TaKaRaBCAProteinAssayKitT9300A500次（1ml）2500次（0.2ml）700560TaKaRaBradfordProteinAssayKitT9310A500次（1ml）2500次（0.2ml）500400最佳拍檔WesternBLoTBlockingBuffer(ProteinFree） T7132A+WesternBLoTImmunoBoosterPF（code：T7115A）特別推薦蛋白定量名稱(chēng)Code包裝量?jī)r(jià)格（元）優(yōu)惠價(jià)（元）Ta特別推薦TaKaRaCBBProteinSafeStainT9320A安全：水脫色，不需配置脫色液快速：常規(guī)操作，1小時(shí)脫色SDS染色液抗體剝離劑WesternBLoTStrippingBuffer

T7135A特別推薦TaKaRaCBBProteinSafeSt特別推薦產(chǎn)品名稱(chēng)Code包裝量?jī)r(jià)格（元）檢出靈敏度概要檢測(cè)方法WesternBLoTChemiluminescenceHRPSubstrateT7101A250ml1,600pg級(jí)其他公司同等產(chǎn)品發(fā)光強(qiáng)度比較XfilmWesternBLoTQuantHRPSubstrateT7102A100ml2,050低pg級(jí)發(fā)光持續(xù)而穩(wěn)定CCD成像、XfilmWesternBLoTHyperHRPSubstrateT7103A100ml2,500中fg級(jí)檢出靈敏度的比較CCD成像、XfilmWesternBLoTUltra

SensitiveHRPSubstrateT7104A100ml4,130低fg級(jí)檢出靈敏度和抗體用量CCD成像、Xfilm特別推薦產(chǎn)品名稱(chēng)Code包裝量?jī)r(jià)格檢出靈敏度概要檢測(cè)方法WeTakara-實(shí)驗(yàn)技能講座之Western-blot課件蛋白相關(guān)產(chǎn)品介紹--WesternBlot上海皓嘉科技發(fā)展有限公司蛋白相關(guān)產(chǎn)品介紹--WesternBlot上海皓嘉科技發(fā)展什么是Westernblot？45

免疫印跡（immunoblotting）又稱(chēng)蛋白質(zhì)印跡（westernblot），它是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合，檢測(cè)復(fù)雜樣品中的某種蛋白質(zhì)的方法。westernblot是在凝膠電泳和固相免疫測(cè)定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新的免疫生化技術(shù)。由于免疫印跡具有SDS的高分辨力和固相免疫測(cè)定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。用途：常用于鑒定某種蛋白，并能對(duì)蛋白的豐度進(jìn)行定性和半定量分析。HRP標(biāo)記的二抗HRP底物(Luminol)化學(xué)發(fā)光

信號(hào)什么是Westernblot？2免疫印跡（immunoWesternblot步驟46

Westernblot步驟3樣品制備47

細(xì)胞裂解蛋白純化蛋白定量樣品制備4細(xì)胞蛋白蛋白細(xì)胞裂解48

xTractorBuffer635656xTractorBufferKit635623裂解細(xì)胞種類(lèi)：Bacterialcells、MammaliancellsYeastcells、Baculovirus-infectedcellsYeastProteinExtractionReagent9780酵母總蛋白質(zhì)提取試劑簡(jiǎn)捷、快速的提取酵母菌總蛋白質(zhì)的試劑蛋白酶抑制劑ProteoGuard?EDTA-FreeProteaseInhibitorCocktail635672Calpastatin7316細(xì)胞裂解液Calpain競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑細(xì)胞裂解：比較常用超聲波破碎法和酶溶破碎法。細(xì)胞裂解5xTractorBuffer635656xTr49

蛋白純化高特異性的Co2+樹(shù)脂：TALON系列高產(chǎn)量的Ni2+樹(shù)脂：His60Ni系列49

組氨酸標(biāo)簽融合蛋白質(zhì)的純化6蛋白純化高特異性的Co2+樹(shù)脂：TALON系列6組氨酸蛋白定量方法靈敏度時(shí)間原理干擾物質(zhì)說(shuō)明產(chǎn)品紫外吸收法20-100mg/ml快速

5-10分鐘蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收各種嘌呤和嘧啶；各種核苷酸干擾物質(zhì)較多Bradford法1-1000μg/ml快速

5分鐘考馬斯染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后，溶液的顏色發(fā)生變化。這種顏色的變化與溶液中的蛋白質(zhì)濃度成正比。表面活性劑：TritonX-100；SDS操作簡(jiǎn)便；可對(duì)含有還原劑的樣品進(jìn)行測(cè)定；顏色穩(wěn)定；顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化。TaKaRaBradfordProteinAssayKit（T9310A）BCA法0.02-2mg/ml較快速

30分鐘內(nèi)二價(jià)銅離子(Cu+2)在堿性條件下被蛋白質(zhì)的肽鍵還原成一價(jià)銅離子(Cu+)，兩個(gè)分子的BCA絡(luò)合一個(gè)一價(jià)銅離子(Cu+)，形成一種在562nm處有強(qiáng)吸收值的紫色復(fù)合物。螯合劑、還原劑：EDTA、EGTA、β-巰基乙醇不受蛋白質(zhì)種類(lèi)的影響；對(duì)表面活性劑的干擾影響小。TaKaRaBCAProteinAssayKit（T9300A）50

蛋白定量方法靈敏度時(shí)間原理干擾物質(zhì)說(shuō)明產(chǎn)品紫外吸收法20-151

相關(guān)產(chǎn)品方法名稱(chēng)Code包裝量?jī)r(jià)格（元）特點(diǎn)BCA法TaKaRaBCAProteinAssayKitT9300A500次700不受蛋白質(zhì)種類(lèi)的影響，在0.02～2mg/ml濃度范圍內(nèi)蛋白質(zhì)濃度與吸光度值成線性關(guān)系；對(duì)表面活性劑的干擾影響??；2種操作方法（標(biāo)準(zhǔn)操作方法；低濃度測(cè)定操作方法）Bradford法TaKaRaBradfordProteinAssayKitT9310A500次500操作簡(jiǎn)便，可快速地對(duì)濃度范圍在1～1,000μg/ml的蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行定量?？蓪?duì)含有還原劑的樣品進(jìn)行測(cè)定；2種操作方法（標(biāo)準(zhǔn)操作方法；低濃度測(cè)定操作方法）51

8相關(guān)產(chǎn)品方法名稱(chēng)Code包裝量?jī)r(jià)格（元）特點(diǎn)BCA法Ta52

Westernblot步驟52

電泳9Westernblot步驟9電泳電泳(SDS)53

蛋白分子量膠濃度

40kDa～80kDa12.5%小于40kDa15%大于80kDa10%凝膠的選擇樣品制備還原處理的樣品和非還原處理的樣品同時(shí)電泳分子量Marker的選擇預(yù)染蛋白marker普通蛋白marker設(shè)立對(duì)照樣品設(shè)立比對(duì)樣品空質(zhì)粒對(duì)照樣品、整個(gè)菌液、上清、沉淀對(duì)比樣品與檢測(cè)樣品同時(shí)電泳SDS電泳中蛋白質(zhì)分子所帶的電荷差異對(duì)電泳的影響是微乎其微的，可以忽略不計(jì)。SDS電泳中白質(zhì)的遷移速度與其分子量大小成反比，分子量越小，遷移速度越快。電泳(SDS)10蛋白分子量膠濃度40kDa54

相關(guān)產(chǎn)品54

CLEARLYStainedProteinLadder3454ACLEARLYProteinLadder(Unstained)3453ATris-Glycine-SDSBuffer(TG-SDS)Powder,pH8.3T9101Tris-GlycineBuffer(TG)Powder,pH8.3T9102TaKaRaCBBProteinSafeStainT9320A以CBB為主要成分制備的蛋白質(zhì)高靈敏度染色液迅速（染色5分鐘后可確認(rèn)蛋白質(zhì)片段）使用安全不含有害物質(zhì)甲醇和乙酸可使用去離子水進(jìn)行脫色2×ProteinSDSPAGELoadingBuffer91724×ProteinSDSPAGELoadingBuffer9173上樣loading預(yù)染Marker與非預(yù)染Marker電泳緩沖液染色液11相關(guān)產(chǎn)品11CLEARLYStainedProt55

電泳儀55

垂直電泳系列產(chǎn)品詳情請(qǐng)見(jiàn)：/genepro/depshow.asp?id=1437雙向電泳系列產(chǎn)品詳情請(qǐng)見(jiàn)：/genepro/depshow.asp?id=143812電泳儀12垂直電泳系列產(chǎn)品詳情請(qǐng)見(jiàn)：http://wWesternblot步驟56

轉(zhuǎn)膜Westernblot步驟13轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜57

膜的選擇常用的轉(zhuǎn)移膜主要有PVDF膜（Polyvinylidene-Fluoride）和硝酸纖維素膜。PVDF膜與目的蛋白的結(jié)合能力高，靈敏度高，不易破碎，同時(shí)也適用于再次標(biāo)記(Reprobing)（為了增加PVD膜的親水性，膜使用前需浸泡在甲醇中）。而硝酸纖維素膜雖不需要浸泡但極易破碎。☆膜標(biāo)記好正反面轉(zhuǎn)膜緩沖液Tris-GlycineBuffer(TG)Powder,pH8.3T9102轉(zhuǎn)膜：蛋白質(zhì)從SDS聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移到膜上。轉(zhuǎn)膜14膜的選擇☆膜標(biāo)記好正反面轉(zhuǎn)膜緩沖液Tris-Gly58

轉(zhuǎn)膜儀（轉(zhuǎn)印儀）58

水平半干轉(zhuǎn)印系列產(chǎn)品詳情請(qǐng)見(jiàn)：/genepro/depshow.asp?id=1440轉(zhuǎn)膜儀的選擇分為半干轉(zhuǎn)膜儀和濕電轉(zhuǎn)膜儀。濕法轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜效率高且轉(zhuǎn)膜均勻，但使用的電轉(zhuǎn)液液量多，需邊冷卻邊轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間長(zhǎng)（過(guò)夜）。而半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)膜時(shí)間短，只需要少量的電轉(zhuǎn)液。15轉(zhuǎn)膜儀（轉(zhuǎn)印儀）15水平半干轉(zhuǎn)印系列產(chǎn)品詳情請(qǐng)見(jiàn)：hWesternblot步驟59

封閉Westernblot步驟16封閉封閉封閉劑的選擇有時(shí)特定的封閉劑達(dá)不到預(yù)期的封閉效果。另外封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)抑制抗原抗體反應(yīng)及標(biāo)記抗體的酶活性，應(yīng)準(zhǔn)備幾種封閉劑進(jìn)行點(diǎn)雜交預(yù)研討實(shí)驗(yàn)選擇合適的封閉劑。60

☆注意避免讓膜變干封閉的作用：為了防止蛋白檢測(cè)用抗體非特異性與膜結(jié)合，對(duì)未結(jié)合蛋白的膜區(qū)域進(jìn)行封閉很重要。封閉封閉劑的選擇17☆注意避免讓膜變干封閉的作用：為了防止61

相關(guān)產(chǎn)品61

WesternBLoTBlockingBuffer(FishGelatin)T7131AWesternBLoTBlockingBuffer(ProteinFree）T7132A在TBS-TBuffer含有魚(yú)源明膠的封閉緩沖液。同哺乳動(dòng)物來(lái)源的奶粉和BSA相比，不會(huì)與哺乳動(dòng)物來(lái)源抗體出現(xiàn)非特異性交叉反應(yīng)?？梢种票尘埃軌蛎鞔_地檢測(cè)出抗原。不含蛋白質(zhì)（ProteinFree）的化學(xué)成分封閉緩沖液。同一般的脫脂奶粉相比，可提高檢測(cè)靈敏度。有效地用于檢測(cè)磷酸化蛋白質(zhì)。18相關(guān)產(chǎn)品18WesternBLoTBlockin62

洗滌洗滌液的選擇一般使用PBS或TBS緩沖液。根據(jù)目的蛋白和檢測(cè)試劑選擇洗滌液。選擇不含抑制HRP的疊氮化鈉的洗滌液比較好。磷酸化蛋白質(zhì)適合使用TBS緩沖液或含Tween20的TBS緩沖液。62

TrisBufferedSalinewithTween?20(TBS-T)Tablets,pH7.6T9142

ELISA、WesternBlotting的清洗Buffer或封閉Buffer。

抗體稀釋。TrisBufferedSaline(TBS)Tablets,pH7.6T9141

ELISA、WesternBlotting、免疫組織染色用的清洗Buffer。

樣品稀釋。PhosphateBufferedSalinewithTween?20(PBS-T)Tablets,pH7.4T9183

ELISA、WesternBlotting的清洗Buffer或封閉Buffer。

抗體稀釋。PhosphateBufferedSaline(PBS)Tablets,pH7.4T9181

ELISA、WesternBlotting、免疫組織染色用的清洗Buffer。

清洗細(xì)胞。

樣品稀釋。WesternBlotting操作過(guò)程中需洗膜，洗膜可除去未反應(yīng)的試劑，抑制背景。19洗滌洗滌液的選擇19TrisBufferedSa63

Westernblot步驟63

一抗孵育二抗孵育20Westernblot步驟20一抗孵育二抗孵育一抗孵育一抗的選擇抗體有識(shí)別1個(gè)抗原決定簇的單克隆抗體和識(shí)別多個(gè)抗原決定簇的多克隆抗體。另外有的抗體識(shí)別一級(jí)結(jié)構(gòu)，有的抗體識(shí)別立體結(jié)構(gòu)，后者不能與變性或還原的蛋白質(zhì)結(jié)合。制備抗體時(shí)，如果免疫原是變性蛋白，那么制備的抗體只能與變性蛋白結(jié)合，不能與天然蛋白質(zhì)結(jié)合。用于WesternBlotting的一抗一般都有銷(xiāo)售。購(gòu)買(mǎi)抗體時(shí)要考慮以上幾點(diǎn)，選擇抗體時(shí)，對(duì)同一個(gè)抗原的不同類(lèi)型抗體在產(chǎn)品數(shù)據(jù)上進(jìn)行詳細(xì)調(diào)查后再購(gòu)買(mǎi)，盡量使用特異性高的單克隆抗體。反應(yīng)方法減少失敗的最好方法是將高度稀釋的低濃度抗體溶液添加到托盤(pán)中，放入膜后，4℃緩慢搖動(dòng)過(guò)夜孵育。如果抗體使用量有限制，建議使用雜交袋，使用雜交袋時(shí)要確保不能有氣泡。64

使用一抗進(jìn)行目的蛋白的檢測(cè)。一抗孵育一抗的選擇21使用一抗進(jìn)行目的蛋白的檢測(cè)。抗體查詢(xún)65

http://www.takara-bio.co.jp/antibody_search/antibody_search.php抗體種類(lèi)細(xì)胞間連接、鈣粘著蛋白抗體細(xì)胞外基質(zhì)關(guān)聯(lián)骨代謝關(guān)聯(lián)血小板關(guān)聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo)關(guān)聯(lián)等疾病相關(guān)抗體（IBL）His標(biāo)簽抗體抗體查詢(xún)22http://www.takara-bio.c二抗孵育二抗的選擇可從不同宿主獲得的二抗，如果背景較高，使用另一種宿主的二抗可減少背景。還銷(xiāo)售宿主以外的對(duì)動(dòng)物種屬來(lái)源血清蛋白進(jìn)行吸收操作的抗體。確認(rèn)動(dòng)物種屬后根據(jù)檢測(cè)方法選擇合適的抗體。一般使用HRP（辣根過(guò)氧化物酶）標(biāo)記的二抗進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的方法。其它還有使用AP（堿性磷酸酶）標(biāo)記抗體（對(duì)發(fā)光物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)）、熒光物質(zhì)及放射性同位素標(biāo)記的二抗。66

使用二抗進(jìn)行一抗的檢測(cè)。二抗孵育前應(yīng)進(jìn)行點(diǎn)雜交預(yù)實(shí)驗(yàn)，研討二抗的正確使用量。二抗孵育二抗的選擇23使用二抗進(jìn)行一抗的檢測(cè)。二抗孵育前應(yīng)Westernblot快速檢出試劑（二抗替代物）

--WesternBLoTRapidDetectv2.067

短時(shí)間內(nèi)有效的進(jìn)行抗體反應(yīng)，可以使用Rapid操作方法提高檢出感度，

IgGDetector標(biāo)

記50個(gè)HRP分子

增加信號(hào)強(qiáng)度。動(dòng)物種HRP標(biāo)記二抗替代物（檢測(cè)MouseIgG時(shí)需要使用Enhancer，不能替代goatIgG、humanIgG3二抗）WesternBLoTRapidDetectv2.0T7122A50次3170元Westernblot快速檢出試劑（二抗替代物）

Westernblot步驟68

檢測(cè)化學(xué)發(fā)光

檢測(cè)Westernblot步驟25檢測(cè)化學(xué)發(fā)光

檢測(cè)檢測(cè)(化學(xué)發(fā)光?顯色)按照各試劑的操作流程進(jìn)行重復(fù)操作，研討最佳實(shí)驗(yàn)條件。將轉(zhuǎn)膜后的膜放置在保鮮膜上，將檢測(cè)試劑滴加在膜上，確保試劑均勻覆蓋在膜上。因目的蛋白的濃度和使用的抗體濃度不同，膠片曝光條件也不同，因此要進(jìn)行預(yù)研討實(shí)驗(yàn)。在發(fā)光持續(xù)時(shí)間內(nèi)可改變膠片曝光條件進(jìn)行多次檢測(cè)。69

檢測(cè)方法有化學(xué)發(fā)光法和顯色法。顯色法操作簡(jiǎn)便，但化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法檢測(cè)靈敏度高，一般經(jīng)常使用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)法是利用基質(zhì)被二抗的HRP分解時(shí)生成的有色物對(duì)目的蛋白的有無(wú)及蛋白量進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)(化學(xué)發(fā)光?顯色)按照各試劑的操作流程進(jìn)行重復(fù)操作，研討相關(guān)產(chǎn)品—化學(xué)發(fā)光70

產(chǎn)品名稱(chēng)Code包裝量?jī)r(jià)格（元）檢出靈敏度概要檢測(cè)方法WesternBLoTChemiluminescenceHRPSubstrateT7101A250ml1,600pg級(jí)其他公司同等產(chǎn)品發(fā)光強(qiáng)度比較XfilmWesternBLoTQuantHRPSubstrateT7102A100ml2,050低pg級(jí)發(fā)光持續(xù)而穩(wěn)定CCD成像、XfilmWesternBLoTHyperHRPSubstrateT7103A100ml2,500中fg級(jí)檢出靈敏度的比較CCD成像、XfilmWesternBLoTUltra

SensitiveHRPSubstrateT7104A100ml4,130低fg級(jí)檢出靈敏度和抗體用量CCD成像、Xfilm相關(guān)產(chǎn)品—化學(xué)發(fā)光27產(chǎn)品名稱(chēng)Code包裝量?jī)r(jià)格檢出靈敏度71

發(fā)光強(qiáng)度比較71

WesternBLoTChemiluminescentHRPSubstrate（Code：T7101A）同其他公司同等HRP反應(yīng)基質(zhì)制品比較，利用HRP標(biāo)記二抗（39~5,000pg）進(jìn)行slotblot檢測(cè)發(fā)光信號(hào)?？贵w：GoatAnti-MouseIgG(H+L)Peroxidaseconjugated膜：nitrocellulose使用WesternBLoTChemiluminescentHRPSubstrate可高靈敏度地檢測(cè)出清晰的信號(hào)（曝光時(shí)間：5秒、Xfilm。本公司數(shù)據(jù)）明亮的發(fā)光信號(hào)28發(fā)光強(qiáng)度比較28WesternBLoTChemi72

發(fā)光持續(xù)而穩(wěn)定72

穩(wěn)定發(fā)光持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)使用WesternBLoTQuantHRPSubstrate（制品Code：T7102A）利用slotblot方法可以確認(rèn)發(fā)光的持續(xù)性sample：人Transferrin，200ng起始2倍梯度稀釋一抗：Goatanti-HumanTransferrinAffinityPurified二抗：AffinityPurifiedAntibody-Anti-GoatIgG(H+L)Peroxidaselabeled從反應(yīng)開(kāi)始90min，發(fā)光還持續(xù)穩(wěn)定，一次反應(yīng)也可重復(fù)進(jìn)行曝光檢測(cè)。本公司數(shù)據(jù)29發(fā)光持續(xù)而穩(wěn)定29穩(wěn)定發(fā)光持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)使用Wester73

檢出靈敏度比較73

使用少量抗體，可進(jìn)行高靈敏度檢出HeLa細(xì)胞裂解液梯度稀釋后作為樣品，改變抗體使用量，western

blot檢測(cè)出GAPDH。sample：HeLa細(xì)胞裂解液總蛋白，從10μg起始2倍梯度稀釋一抗：Anti-Glyceraldehyde-3-PhosphateDehydrogenase,clone6C5（1mg/ml）二抗：PierceGoatAnti-MouseIgG(H+L)Peroxidaseconjugated（0.8mg/ml）<抗體的稀釋倍數(shù)>使用WesternBLoTHyper

Substrate（T7103A）更少的抗體量也可以檢出本公司數(shù)據(jù)30檢出靈敏度比較30使用少量抗體，可進(jìn)行高靈敏度檢出H74

檢出靈敏度和抗體使用量Hela細(xì)胞裂解液梯度稀釋的樣品，SDS電泳后，根據(jù)制品的靈敏度調(diào)整抗體稀釋倍數(shù)，Westernblot檢出GAPDH。74

Sample：HeLa細(xì)胞裂解液總蛋白，從10μg起始2倍梯度稀釋一抗：Anti-Glyceraldehyde-3-PhosphateDehydrogenase,clone6C5（1mg/ml）（MerckMillipore）二抗：PierceGoatAnti-MouseIgG(H+L)Peroxidaseconjugated（0.8mg/ml）使用WesternBLoTUltraSensitive即使減少抗體使用量也可進(jìn)行高靈敏度檢測(cè)本公司數(shù)據(jù)31檢出靈敏度和抗體使用量Hela細(xì)胞裂解液梯度稀釋的樣品75

檢測(cè)增強(qiáng)劑75

適用于包括Western印跡和ELISA在內(nèi)的各種免疫檢測(cè)可提高最終的檢測(cè)靈敏度(從數(shù)倍到數(shù)十倍)不影響辣根過(guò)氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)活性兼容于交聯(lián)二抗的酶和使用任何一種檢測(cè)方法(如：比色檢測(cè)法或發(fā)光檢測(cè)法)檢測(cè)HumanTransferrin（各種抗體稀釋液使用情況比較）1TBS-T2WesternBLoTImmunoBooster（code：T7111A）3A社反応促進(jìn)試薬4WesternBLoTImmunoBoosterPF（code：T7115A）抗體稀釋?zhuān)嚎贵w稀釋溶液情況如下：

ImmunoBooster本公司數(shù)據(jù)32檢測(cè)增強(qiáng)劑32適用于包括Western印跡和ELIS76

檢測(cè)系統(tǒng)76

生物發(fā)光檢測(cè)(冷光儀)系統(tǒng)詳情請(qǐng)見(jiàn)：/genepro/depshow.asp?id=145033檢測(cè)系統(tǒng)33生物發(fā)光檢測(cè)(冷光儀)系統(tǒng)詳情請(qǐng)見(jiàn)：洗膜·重新標(biāo)記77

Western進(jìn)行了膜上的一抗及二抗的消除試劑相對(duì)溫和的條件下（室溫，30分）的反應(yīng)WesternBLoTStrippingBuffer

T7135A1HeLaCellLysate10μg2HeLaCellLysate5μg3HeLaCellLysate2μg4HeLaCellLysate1.25μg5HeLaCellLysate0.625μg1．β-actinの検出（第一次抗原?抗體反應(yīng)）Stripping（條件:室溫、30分、0.25ml/cm2membrane）2．GAPDHの検出（第二次抗原?抗體反應(yīng)）Stripping（