《微生物遺傳與變異》課件

第九章微生物遺傳與變異

通過(guò)本章的學(xué)習(xí)，要求掌握：1、細(xì)菌基因重組的原理和方法。2、真菌基因重組的原理和方法。3、微生物誘變育種的原理和方法。重點(diǎn)：細(xì)菌的基因重組難點(diǎn)：低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)，高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)，準(zhǔn)性生殖第九章微生物遺傳與變異通過(guò)本章的學(xué)習(xí)，要求掌握：1微生物是理想的遺傳學(xué)研究材料：①物種及代謝類型的多樣性；②個(gè)體體制簡(jiǎn)單，營(yíng)養(yǎng)體多為單倍體，基因組??；③繁殖快，易于累積不同的最終代謝產(chǎn)物及中間代謝物；④菌落形態(tài)特征的可見(jiàn)性與多樣性；⑤環(huán)境條件對(duì)微生物群體中各個(gè)體作用的直接和均勻；⑥易變異、易得到營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株；⑦一般都有相應(yīng)的噬菌體；⑧存在著處于進(jìn)化進(jìn)程中的多種原始方式的有性生殖類等。微生物是理想的遺傳學(xué)研究材料：2基因組genome：一種生物的全套基因。表現(xiàn)型phenotype：生物可見(jiàn)的或可測(cè)定的性狀遺傳型genotype：決定生物表現(xiàn)型的遺傳因子同樣遺傳型的生物在不同外界條件下，會(huì)顯現(xiàn)不同表現(xiàn)型，但遺傳型并非改變，這種變異為非遺傳性變異，只能稱適應(yīng)或飾變(modification)；只有遺傳型改變，從而引起表型變化才稱為變異，它發(fā)生在基因水平上，可以遺傳給子代?；蚪Mgenome：一種生物的全套基因。3Serretiamarcescens在25℃下培養(yǎng)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生一種深紅色的靈桿菌素，把菌落染成鮮紅色。可是，當(dāng)培養(yǎng)在37℃下時(shí)，群體中所有細(xì)胞都不產(chǎn)色素。如果重新降溫至25℃，產(chǎn)色素能力又得到恢復(fù)。Serretiamarcescens在25℃下培養(yǎng)時(shí)，會(huì)產(chǎn)4第一節(jié)生物遺傳信息的載體證明DNA是遺傳物質(zhì)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)①1928年，F(xiàn).Griffith；1944年O.T.Avery肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae）轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。②1952年，A.D.Hershy、M.Chase的噬菌體感染實(shí)驗(yàn)。③1956年，H.Fraenkel-Conrat的TMV拆開(kāi)和重建實(shí)驗(yàn)。第一節(jié)生物遺傳信息的載體證明DNA是遺傳物質(zhì)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)5Griffith的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)Griffith的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)6轉(zhuǎn)化因子的本質(zhì)的闡明轉(zhuǎn)化因子的本質(zhì)的闡明7Hershey-Chase的噬菌體實(shí)驗(yàn)用35S和32P去分別標(biāo)記大腸桿菌，然后再用T2噬菌體感染，即可分別得到標(biāo)有35S和T2和32P的T2噬菌體。把標(biāo)記噬菌體與其宿主大腸桿菌混合，經(jīng)短時(shí)間(如10min)保溫后，使T2完成吸附和侵入過(guò)程。在組織搗碎器中劇烈攪拌，以使吸附在菌體外表的T2蛋白外殼脫離細(xì)胞并均勻分布。進(jìn)行離心沉淀，再分別測(cè)定沉淀物和上清液中的同位素標(biāo)記。Hershey-Chase的噬菌體實(shí)驗(yàn)8《微生物遺傳與變異》課件9結(jié)果發(fā)現(xiàn)，幾乎全部的32P都和細(xì)菌一起出現(xiàn)在沉淀物中，而幾乎全部33S都在上清液中。這意味著噬菌體的蛋白外殼經(jīng)自然分離后仍留在細(xì)胞外部，只有核酸芯子才進(jìn)入宿主體內(nèi)；同時(shí)，由于最終能釋放出一群具有與親代同樣蛋白外殼的完整的子代噬菌體，說(shuō)明只有核酸才是其全部遺體信息的載體。后來(lái)通過(guò)電子顯微鏡的觀察也證實(shí)了這個(gè)論點(diǎn)。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，幾乎全部的32P都和細(xì)菌一起出現(xiàn)在沉淀物中，而幾乎10TMV重建實(shí)驗(yàn)TMV重建實(shí)驗(yàn)11遺傳物質(zhì)在細(xì)胞中的存在方式①真核生物DNA分子與組蛋白結(jié)合構(gòu)成染色體，每條染色體有單一線性雙鏈DNA分子。一個(gè)真核生物細(xì)胞內(nèi)有多條染色體（脈孢菌7條，人23條）。高等生物中有2至多套染色體（動(dòng)物2倍，水稻4倍），真菌有雙倍體，但多數(shù)微生物是單倍體。真核細(xì)胞核物質(zhì)外有核膜包圍，形成完整細(xì)胞核。遺傳物質(zhì)在細(xì)胞中的存在方式12②原核生物DNA不與組蛋白結(jié)合，染色體僅由一條DNA組成，DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀雙鏈，一個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有一條染色體（單倍體haploid）。無(wú)核膜膜包圍，只在細(xì)胞中央形成核區(qū)。③質(zhì)粒plasmid原核生物中，除染色體以外，能夠自主復(fù)制的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA分子。它們攜帶少量遺傳基因，決定細(xì)胞的某些性狀，并非細(xì)菌生活必需。②原核生物13DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)圖DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)圖14遺傳信息的傳遞和基因表達(dá)基因geneDNA分子的一定區(qū)段，攜帶特定的遺傳信息，是具有自主復(fù)制能力的遺傳功能單位。遺傳信息通過(guò)DNA連上的核苷酸排列順序表現(xiàn)出來(lái)。結(jié)構(gòu)基因決定多肽形成的堿基順序稱結(jié)構(gòu)基因，一個(gè)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)后，產(chǎn)生一個(gè)多肽；即“一個(gè)基因一個(gè)酶”。調(diào)節(jié)基因?qū)Y(jié)構(gòu)基因起調(diào)節(jié)控制作用的稱調(diào)節(jié)基因。操縱子學(xué)說(shuō)遺傳信息的傳遞和基因表達(dá)15基因的表達(dá)以DNA為模板，通過(guò)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄出mRNA，然后將mRNA包含的堿基順序在核糖體中翻譯成相應(yīng)氨基酸序列的多肽。①轉(zhuǎn)錄（transcription）雙鏈DNA→單鏈，以其中一條為模板→互補(bǔ)mRNA②翻譯(translation)mRNA→多肽基因的表達(dá)16第二節(jié)原核微生物的基因重組克隆clone不經(jīng)過(guò)有性細(xì)胞的結(jié)合，由體細(xì)胞發(fā)育成新個(gè)體，即無(wú)性繁殖。基因重組generecombination兩個(gè)不同來(lái)源的遺傳物質(zhì)進(jìn)行交換，經(jīng)過(guò)基因的重新組合，形成新的基因型的過(guò)程。重組獲得的后代具有新的基因組合，表現(xiàn)出不同于親本的新性狀。原核微生物沒(méi)有有性生殖，其基因重組通過(guò)轉(zhuǎn)化、接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)方式進(jìn)行。第二節(jié)原核微生物的基因重組17《微生物遺傳與變異》課件18轉(zhuǎn)化Transformation

定義不經(jīng)其它媒介，來(lái)自供體（donor）的DNA片段或質(zhì)粒DNA直接進(jìn)入受體菌（recipient或receptor），并在受體中復(fù)制、表達(dá)的過(guò)程。轉(zhuǎn)化過(guò)程①受體細(xì)胞呈現(xiàn)感受態(tài)，即容易接受外源DNA的生理狀態(tài)。②外源DNA與感受態(tài)細(xì)胞結(jié)合并被吸收。③外源DNA整合到受體菌中，成為受體菌染色體的一部分。轉(zhuǎn)染transfection指用提純的病毒核酸去感染其宿主細(xì)胞或原生質(zhì)體，可增殖出一群正常病毒后代的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)化Transformation19轉(zhuǎn)化示意圖轉(zhuǎn)化示意圖20轉(zhuǎn)導(dǎo)transduction

定義通過(guò)完全缺陷或部分缺陷噬菌體為媒介，把一個(gè)供體細(xì)胞的DNA片段轉(zhuǎn)移到另一個(gè)受體細(xì)胞中，并使后者發(fā)生遺傳變異的過(guò)程。通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得供體細(xì)胞部分遺傳性狀的重組受體細(xì)胞，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子（transductant）。攜帶供體部分遺傳物質(zhì)（DNA片段）的噬菌體稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體或轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒。轉(zhuǎn)導(dǎo)transduction211952年Zinder和Lederberg在驗(yàn)證Salmonellatyphimurium是否也存在接合現(xiàn)象時(shí)發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。S.typhimurium：LT22A(trp-)；LT2(his-)LT22溶原性→噬菌體P22→感染LT2（非溶原性）→可能釋放帶trp+的P22→LT22A(trp-)→呈原養(yǎng)型。1952年Zinder和Lederberg在驗(yàn)證S22普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)(generalizedtransduction)噬菌體可誤包供體菌中的任何基因(包括質(zhì)粒)，并使受體菌實(shí)現(xiàn)各種性狀的轉(zhuǎn)導(dǎo)完全普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)completetransduction形成了遺傳性穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子(transductant)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)(generalizedtransduction)23流產(chǎn)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)簡(jiǎn)稱流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)(abortivetransduction)，在許多獲得供體菌DNA片段的受體菌內(nèi)，如果轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA不能進(jìn)行重組和復(fù)制，其上的基因僅經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄而得到了表達(dá)。能在選擇性培養(yǎng)基平板上形成微小菌落成了流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)的特點(diǎn)。流產(chǎn)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)24局限轉(zhuǎn)導(dǎo)specialized

transduction當(dāng)溶原菌群經(jīng)誘導(dǎo)后，其中極少數(shù)前噬菌體從宿主染色體脫落時(shí)產(chǎn)主錯(cuò)誤切割，從而把宿主的某些基因（λ前噬菌體位點(diǎn)兩端是細(xì)菌染色體的gal＋和bio＋，故形成的轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體通常帶有g(shù)a1＋或bio＋）整合到噬菌體的基因組上，當(dāng)這樣的噬菌體侵染另一宿主菌時(shí)，噬菌體DNA與受體菌的DNA同源區(qū)段配對(duì)，通過(guò)雙交換而整合到受體菌的染色體組上，使受體菌獲得了供體的這部分遺傳特性，而形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子（缺陷溶源菌）。局限轉(zhuǎn)導(dǎo)specializedtransduction25λ噬菌體DNA的不正常切割λ噬菌體DNA的不正常切割26丟失了自身部分基因，并被同等長(zhǎng)度的宿主基因所取代的噬菌體稱為缺陷噬菌體（defectivephage）。如λdgal或λdbio。低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（1owfrequancytransduction,LFT），形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子的頻率很低，只有10-4~10-6。高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（highfrequancytransduction,HFT），形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子的頻率很高,理論上可達(dá)50%。丟失了自身部分基因，并被同等長(zhǎng)度的宿主基因所取代的噬菌體稱為27高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)是雙重溶源的結(jié)果：

λ─┐│＋E.colik12→[E.coliK12(λ/λdgal)F]λdgal┘ ↓UV轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體（λgal）→轉(zhuǎn)導(dǎo)子菌落 輔助噬菌體（λ）→噬菌斑

高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)是雙重溶源的結(jié)果：28溶源轉(zhuǎn)變(lysonenicconversion)當(dāng)溫和噬菌體感染其宿主而使之發(fā)生溶源化時(shí)，因噬菌體的基因整合到宿主的基因組上，而使后者獲得了除免疫性以外的新性狀的現(xiàn)象。當(dāng)宿主喪失這一噬菌體時(shí)，通過(guò)溶源轉(zhuǎn)變而獲得的性狀也同時(shí)消失。溶源轉(zhuǎn)變與轉(zhuǎn)導(dǎo)有本質(zhì)上的不同，首先是它的溫和噬菌體不攜帶任何供體菌的基因；其次，這種噬菌體是完整的，而不是缺陷的。溶源轉(zhuǎn)變的典型例子是不產(chǎn)毒素的白喉棒桿菌(Corynebacteriumdiphtheriae)菌株在被β噬菌體感染而發(fā)生溶源化時(shí)，會(huì)變成產(chǎn)白喉毒素的致病菌株。溶源轉(zhuǎn)變(lysonenicconversion)29接合conjugation通過(guò)供體菌與受體菌間細(xì)胞相接觸而傳遞大段DNA的過(guò)程。1946年，Lederberg和Tatum的E.colik12營(yíng)養(yǎng)缺陷型株混合培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)。E.colik12兩個(gè)突變株①bio-met-the+leu+②bio+met+the-leu-兩種菌混合培養(yǎng)后，出現(xiàn)原養(yǎng)菌（bio+met+the+leu+）可在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。接合conjugation30細(xì)菌接合現(xiàn)象研究得最清楚的是大腸桿菌。大腸桿菌是有性別分化的。決定它們性別的因子稱為F因子(即致育因子或稱性質(zhì)粒)，呈超螺旋狀態(tài)，具有自主的與染色體進(jìn)行同步復(fù)制和轉(zhuǎn)移到其他細(xì)胞中去的能力。也可插入(即整合)到染色體組上；它既可經(jīng)過(guò)接合作用而獲得，也可通過(guò)一些理化因素(如吖啶橙、Ni2+、Co2+、絲裂霉素C、硫酸十二酯鈉、亞硝基胍、利福平、溴化乙錠、環(huán)己亞胺和加熱等)的處理，而從細(xì)胞中消失。F因子的分子量為5×107。在大腸桿菌中，F(xiàn)因子的DNA含量約占總?cè)旧w含量的2%。細(xì)菌接合現(xiàn)象研究得最清楚的是大腸桿菌。大腸桿菌是有性別分化的31F因子的存在方式及其相互關(guān)系

F因子的存在方式及其相互關(guān)系32F+菌株含F(xiàn)質(zhì)粒，細(xì)胞表面產(chǎn)生性毛(sexpili)，與F-細(xì)胞相連，在接合后轉(zhuǎn)移DNA。F-菌株無(wú)F質(zhì)粒，不產(chǎn)生性毛，可接受外來(lái)F質(zhì)粒。F+菌株33《微生物遺傳與變異》課件34Hfr菌株高頻重組菌株（highfrequencyrecombination）。與F-接合后，重組頻率比F+高幾百倍。在Hfr細(xì)胞中，存在與染色體特定位點(diǎn)相整合的F因子(產(chǎn)生頻率約10-5)。當(dāng)它與F-菌株發(fā)生接合時(shí)，Hfr染色體在F因子處發(fā)生斷裂，由環(huán)狀變成線狀。整段線狀染色體轉(zhuǎn)移至F-細(xì)胞的全過(guò)程約需100min。在轉(zhuǎn)移時(shí)，由于斷裂發(fā)生在F因子中，所以必然要等Hfr的整條染色體組全部轉(zhuǎn)移完成后，F(xiàn)因子才能完全進(jìn)入F-細(xì)胞。但轉(zhuǎn)移過(guò)程中斷，所以越在前端的基因，進(jìn)入的機(jī)會(huì)就越多，故在F-中出現(xiàn)重組子的時(shí)間就越早，頻率也高。Hfr菌株35F’菌株當(dāng)Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離其染色體組時(shí)，可形成游離的攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱F’因子。攜帶有F’因子的菌株，其性狀介于F+與Hfr之間，這就是初生F’菌株。初生F’菌株與F-菌株接合，可使后者轉(zhuǎn)變成F’菌株，這就是次生F’菌株，它既獲得了F因子，又獲得了來(lái)自初生F’菌株的若干遺傳性狀。以這種接合來(lái)傳遞供體菌基因的方式，稱為F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)(F-duction)、性導(dǎo)(sexduction)

。在次生的F’群體中，大約有10%的F’因子重新整合到染色體組上，而恢復(fù)成Hfr菌。F’菌株36原生質(zhì)體融合

通過(guò)人工的方法，使遺傳性狀不同的兩細(xì)胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合并產(chǎn)生重組體的過(guò)程稱為原生質(zhì)體融合（protoplastfusion）。微生物細(xì)胞融合的研究開(kāi)始于1976年。其一般原理和主要過(guò)程是：先準(zhǔn)備兩個(gè)有選擇性遺傳標(biāo)記的突變株，在高滲溶液中，用適當(dāng)?shù)拿摫诿溉コ?xì)胞壁，再將形成的原生質(zhì)體離心聚集，并加入促融合劑PEG(聚乙二醇)促進(jìn)融合，然后在高滲溶液中稀釋，涂在能使其再生細(xì)胞壁或進(jìn)行分裂的培養(yǎng)基上，待形成菌落后，通過(guò)影印接種法，將其接種到各種選擇性培養(yǎng)基上，最后鑒定它們是否是重組子。原生質(zhì)體融合37基因轉(zhuǎn)座genetransposition轉(zhuǎn)座子的特征是在兩端有IR序列，分兩類：Ⅰ型Compoundtransposons：兩端為IS，抗性基因居中。如Tn5、Tn9、Tn10、Tn4001、Tn4003。Ⅱ型Complextransposons：兩端為IR(30~50bp)，中間為轉(zhuǎn)座基因和抗性基因。如Tn1、Tn3、Tn21、Tn1721、Tn551?；蜣D(zhuǎn)座genetransposition38第三節(jié)真核微生物的基因重組

有性雜交準(zhǔn)性生殖準(zhǔn)性生殖是一種類似于有性生殖，但比它更為原始的一種生殖方式，它可使同種生物不同菌株的體細(xì)胞發(fā)生融合，不經(jīng)過(guò)減數(shù)分裂的方式而導(dǎo)致低頻率的基因重組并產(chǎn)生重組子。第三節(jié)真核微生物的基因重組39粗糙脈孢菌的有性雜交粗糙脈孢菌的有性雜交40準(zhǔn)性生殖：準(zhǔn)性生殖包括下面四個(gè)過(guò)程①菌絲聯(lián)結(jié)，②異核體形成，③核配④體細(xì)胞交換和單倍體化四個(gè)階段。準(zhǔn)性生殖：41第四節(jié)微生物基因突變和誘變育種

基因突變突變（mutation）指DNA順序上核苷酸發(fā)生置換或其它順序上的改變。突變類型①堿基對(duì)置換substitution轉(zhuǎn)換transition：顛換transversion：②移碼突變frame-shiftmutant③染色體畸變chromosomalaberrationdeletion、duplication、insertion、translocation、inversion第四節(jié)微生物基因突變和誘變育種基因突變42基因突變表型形態(tài)突變型生化突變型營(yíng)養(yǎng)缺陷型auxotroph；抗性突變型；抗原突變型致死突變型條件致死突變型其他突變型如毒力、糖發(fā)酵能力、代謝產(chǎn)物的種類和產(chǎn)量以及對(duì)某種藥物的依賴性突變型等?；蛲蛔儽硇?3基因突變的特點(diǎn)不對(duì)應(yīng)性自發(fā)性稀有性獨(dú)立性誘變性穩(wěn)定性可逆性正向突變(forwardmutation)回復(fù)突變(backmatation或reversemutation）基因突變的特點(diǎn)44基因突變的自發(fā)性和不對(duì)應(yīng)性的證明一種觀點(diǎn)認(rèn)為，突變的原因和突變的性狀間是相對(duì)應(yīng)的，并認(rèn)為這就是“定向變異”、“馴化”。另一種觀點(diǎn)認(rèn)為，基因突變是自發(fā)的。實(shí)驗(yàn)證明：1943年S.E.Luria與M.Dlbruck進(jìn)行了Fluctuationtest。1949年H.B.Newcombe的Respredingplatedincubacion。1952年J.Lederberg夫婦用Replica-plating結(jié)束了爭(zhēng)論?；蛲蛔兊淖园l(fā)性和不對(duì)應(yīng)性的證明45《微生物遺傳與變異》課件46《微生物遺傳與變異》課件47《微生物遺傳與變異》課件48《微生物遺傳與變異》課件49DNA的損傷及其修復(fù)光復(fù)活作用(photoreactivation)切除修復(fù)作用(excisionrepair)。重組修復(fù)SOS修復(fù)DNA的損傷及其修復(fù)50化學(xué)誘變亞硝酸引起DNA的堿基轉(zhuǎn)換化學(xué)誘變亞硝酸引起DNA的堿基轉(zhuǎn)換515-BU尿嘧啶引起堿基的轉(zhuǎn)換5-BU尿嘧啶引起堿基的轉(zhuǎn)換52《微生物遺傳與變異》課件53微生物育種①自發(fā)突變育種breedingbyspontaneousmutation生產(chǎn)育種定向培育②誘變育種breedingbyinducedmutation用物理（X-ray、UV等）化學(xué)（吖啶、亞硝酸、堿基類似物）因素誘變育種，獲得突變機(jī)率提高。微生物育種54

基因工程geneengineering是用人為方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質(zhì)--DNA大分子提取出來(lái)，在離體條件下用適當(dāng)?shù)墓ぞ呙高M(jìn)行切割后，把它與作為載體(vector)的DNA分子連接起來(lái)，然后與載體一起導(dǎo)入某一更易生長(zhǎng)、繁殖的受體細(xì)胞中，以讓外源遺傳物質(zhì)在其中“安家落戶”，進(jìn)行正常的復(fù)制和表達(dá)，從而獲得新物種的一種嶄新的育種技術(shù)?；蚬こ蘥eneengineering55過(guò)程①基因分離：②體外重組：外源DNA與載體連接③載體傳遞：導(dǎo)入受體，使外源DNA在受體中表達(dá)④復(fù)制、表達(dá)⑤篩選、繁殖：對(duì)重組后的大量重組子性狀進(jìn)行篩選，從中選出所需性狀重組子，并使之穩(wěn)定繁殖。過(guò)程56《微生物遺傳與變異》課件57微生物在基因工程中的作用：微生物作為克隆載體；微生物生產(chǎn)基因工程工具酶；1、限制性核酸內(nèi)切酶2、DNA連接酶微生物作為克隆載體的宿主；1、原核生物宿主大腸桿菌枯草芽孢桿菌2、真核生物宿主釀酒酵母微生物作為表達(dá)載體。微生物在基因工程中的作用：58DNA的體外擴(kuò)增穆利斯發(fā)明了聚和酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction,PCR），這是一種在體外快速擴(kuò)增特定DNA序列的新技術(shù)。PCR擴(kuò)增的條件：要有DNA摸板要有引物要有脫氧核苷三（dNTP）磷酸要有DNA聚合酶要有擴(kuò)增緩沖液要有鈣離子PCR由3個(gè)基本反應(yīng)步驟：1、變性（denaturation）2、退火（annealing）3、延伸（extension）

DNA的體外擴(kuò)增PCR由3個(gè)基本反應(yīng)步驟：59第九章微生物遺傳與變異

通過(guò)本章的學(xué)習(xí)，要求掌握：1、細(xì)菌基因重組的原理和方法。2、真菌基因重組的原理和方法。3、微生物誘變育種的原理和方法。重點(diǎn)：細(xì)菌的基因重組難點(diǎn)：低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)，高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)，準(zhǔn)性生殖第九章微生物遺傳與變異通過(guò)本章的學(xué)習(xí)，要求掌握：60微生物是理想的遺傳學(xué)研究材料：①物種及代謝類型的多樣性；②個(gè)體體制簡(jiǎn)單，營(yíng)養(yǎng)體多為單倍體，基因組小；③繁殖快，易于累積不同的最終代謝產(chǎn)物及中間代謝物；④菌落形態(tài)特征的可見(jiàn)性與多樣性；⑤環(huán)境條件對(duì)微生物群體中各個(gè)體作用的直接和均勻；⑥易變異、易得到營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株；⑦一般都有相應(yīng)的噬菌體；⑧存在著處于進(jìn)化進(jìn)程中的多種原始方式的有性生殖類等。微生物是理想的遺傳學(xué)研究材料：61基因組genome：一種生物的全套基因。表現(xiàn)型phenotype：生物可見(jiàn)的或可測(cè)定的性狀遺傳型genotype：決定生物表現(xiàn)型的遺傳因子同樣遺傳型的生物在不同外界條件下，會(huì)顯現(xiàn)不同表現(xiàn)型，但遺傳型并非改變，這種變異為非遺傳性變異，只能稱適應(yīng)或飾變(modification)；只有遺傳型改變，從而引起表型變化才稱為變異，它發(fā)生在基因水平上，可以遺傳給子代?；蚪Mgenome：一種生物的全套基因。62Serretiamarcescens在25℃下培養(yǎng)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生一種深紅色的靈桿菌素，把菌落染成鮮紅色?？墒?，當(dāng)培養(yǎng)在37℃下時(shí)，群體中所有細(xì)胞都不產(chǎn)色素。如果重新降溫至25℃，產(chǎn)色素能力又得到恢復(fù)。Serretiamarcescens在25℃下培養(yǎng)時(shí)，會(huì)產(chǎn)63第一節(jié)生物遺傳信息的載體證明DNA是遺傳物質(zhì)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)①1928年，F(xiàn).Griffith；1944年O.T.Avery肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae）轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。②1952年，A.D.Hershy、M.Chase的噬菌體感染實(shí)驗(yàn)。③1956年，H.Fraenkel-Conrat的TMV拆開(kāi)和重建實(shí)驗(yàn)。第一節(jié)生物遺傳信息的載體證明DNA是遺傳物質(zhì)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)64Griffith的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)Griffith的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)65轉(zhuǎn)化因子的本質(zhì)的闡明轉(zhuǎn)化因子的本質(zhì)的闡明66Hershey-Chase的噬菌體實(shí)驗(yàn)用35S和32P去分別標(biāo)記大腸桿菌，然后再用T2噬菌體感染，即可分別得到標(biāo)有35S和T2和32P的T2噬菌體。把標(biāo)記噬菌體與其宿主大腸桿菌混合，經(jīng)短時(shí)間(如10min)保溫后，使T2完成吸附和侵入過(guò)程。在組織搗碎器中劇烈攪拌，以使吸附在菌體外表的T2蛋白外殼脫離細(xì)胞并均勻分布。進(jìn)行離心沉淀，再分別測(cè)定沉淀物和上清液中的同位素標(biāo)記。Hershey-Chase的噬菌體實(shí)驗(yàn)67《微生物遺傳與變異》課件68結(jié)果發(fā)現(xiàn)，幾乎全部的32P都和細(xì)菌一起出現(xiàn)在沉淀物中，而幾乎全部33S都在上清液中。這意味著噬菌體的蛋白外殼經(jīng)自然分離后仍留在細(xì)胞外部，只有核酸芯子才進(jìn)入宿主體內(nèi)；同時(shí)，由于最終能釋放出一群具有與親代同樣蛋白外殼的完整的子代噬菌體，說(shuō)明只有核酸才是其全部遺體信息的載體。后來(lái)通過(guò)電子顯微鏡的觀察也證實(shí)了這個(gè)論點(diǎn)。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，幾乎全部的32P都和細(xì)菌一起出現(xiàn)在沉淀物中，而幾乎69TMV重建實(shí)驗(yàn)TMV重建實(shí)驗(yàn)70遺傳物質(zhì)在細(xì)胞中的存在方式①真核生物DNA分子與組蛋白結(jié)合構(gòu)成染色體，每條染色體有單一線性雙鏈DNA分子。一個(gè)真核生物細(xì)胞內(nèi)有多條染色體（脈孢菌7條，人23條）。高等生物中有2至多套染色體（動(dòng)物2倍，水稻4倍），真菌有雙倍體，但多數(shù)微生物是單倍體。真核細(xì)胞核物質(zhì)外有核膜包圍，形成完整細(xì)胞核。遺傳物質(zhì)在細(xì)胞中的存在方式71②原核生物DNA不與組蛋白結(jié)合，染色體僅由一條DNA組成，DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀雙鏈，一個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有一條染色體（單倍體haploid）。無(wú)核膜膜包圍，只在細(xì)胞中央形成核區(qū)。③質(zhì)粒plasmid原核生物中，除染色體以外，能夠自主復(fù)制的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA分子。它們攜帶少量遺傳基因，決定細(xì)胞的某些性狀，并非細(xì)菌生活必需。②原核生物72DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)圖DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)圖73遺傳信息的傳遞和基因表達(dá)基因geneDNA分子的一定區(qū)段，攜帶特定的遺傳信息，是具有自主復(fù)制能力的遺傳功能單位。遺傳信息通過(guò)DNA連上的核苷酸排列順序表現(xiàn)出來(lái)。結(jié)構(gòu)基因決定多肽形成的堿基順序稱結(jié)構(gòu)基因，一個(gè)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)后，產(chǎn)生一個(gè)多肽；即“一個(gè)基因一個(gè)酶”。調(diào)節(jié)基因?qū)Y(jié)構(gòu)基因起調(diào)節(jié)控制作用的稱調(diào)節(jié)基因。操縱子學(xué)說(shuō)遺傳信息的傳遞和基因表達(dá)74基因的表達(dá)以DNA為模板，通過(guò)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄出mRNA，然后將mRNA包含的堿基順序在核糖體中翻譯成相應(yīng)氨基酸序列的多肽。①轉(zhuǎn)錄（transcription）雙鏈DNA→單鏈，以其中一條為模板→互補(bǔ)mRNA②翻譯(translation)mRNA→多肽基因的表達(dá)75第二節(jié)原核微生物的基因重組克隆clone不經(jīng)過(guò)有性細(xì)胞的結(jié)合，由體細(xì)胞發(fā)育成新個(gè)體，即無(wú)性繁殖?；蛑亟Mgenerecombination兩個(gè)不同來(lái)源的遺傳物質(zhì)進(jìn)行交換，經(jīng)過(guò)基因的重新組合，形成新的基因型的過(guò)程。重組獲得的后代具有新的基因組合，表現(xiàn)出不同于親本的新性狀。原核微生物沒(méi)有有性生殖，其基因重組通過(guò)轉(zhuǎn)化、接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)方式進(jìn)行。第二節(jié)原核微生物的基因重組76《微生物遺傳與變異》課件77轉(zhuǎn)化Transformation

定義不經(jīng)其它媒介，來(lái)自供體（donor）的DNA片段或質(zhì)粒DNA直接進(jìn)入受體菌（recipient或receptor），并在受體中復(fù)制、表達(dá)的過(guò)程。轉(zhuǎn)化過(guò)程①受體細(xì)胞呈現(xiàn)感受態(tài)，即容易接受外源DNA的生理狀態(tài)。②外源DNA與感受態(tài)細(xì)胞結(jié)合并被吸收。③外源DNA整合到受體菌中，成為受體菌染色體的一部分。轉(zhuǎn)染transfection指用提純的病毒核酸去感染其宿主細(xì)胞或原生質(zhì)體，可增殖出一群正常病毒后代的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)化Transformation78轉(zhuǎn)化示意圖轉(zhuǎn)化示意圖79轉(zhuǎn)導(dǎo)transduction

定義通過(guò)完全缺陷或部分缺陷噬菌體為媒介，把一個(gè)供體細(xì)胞的DNA片段轉(zhuǎn)移到另一個(gè)受體細(xì)胞中，并使后者發(fā)生遺傳變異的過(guò)程。通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得供體細(xì)胞部分遺傳性狀的重組受體細(xì)胞，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子（transductant）。攜帶供體部分遺傳物質(zhì)（DNA片段）的噬菌體稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體或轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒。轉(zhuǎn)導(dǎo)transduction801952年Zinder和Lederberg在驗(yàn)證Salmonellatyphimurium是否也存在接合現(xiàn)象時(shí)發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。S.typhimurium：LT22A(trp-)；LT2(his-)LT22溶原性→噬菌體P22→感染LT2（非溶原性）→可能釋放帶trp+的P22→LT22A(trp-)→呈原養(yǎng)型。1952年Zinder和Lederberg在驗(yàn)證S81普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)(generalizedtransduction)噬菌體可誤包供體菌中的任何基因(包括質(zhì)粒)，并使受體菌實(shí)現(xiàn)各種性狀的轉(zhuǎn)導(dǎo)完全普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)completetransduction形成了遺傳性穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子(transductant)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)(generalizedtransduction)82流產(chǎn)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)簡(jiǎn)稱流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)(abortivetransduction)，在許多獲得供體菌DNA片段的受體菌內(nèi)，如果轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA不能進(jìn)行重組和復(fù)制，其上的基因僅經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄而得到了表達(dá)。能在選擇性培養(yǎng)基平板上形成微小菌落成了流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)的特點(diǎn)。流產(chǎn)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)83局限轉(zhuǎn)導(dǎo)specialized

transduction當(dāng)溶原菌群經(jīng)誘導(dǎo)后，其中極少數(shù)前噬菌體從宿主染色體脫落時(shí)產(chǎn)主錯(cuò)誤切割，從而把宿主的某些基因（λ前噬菌體位點(diǎn)兩端是細(xì)菌染色體的gal＋和bio＋，故形成的轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體通常帶有g(shù)a1＋或bio＋）整合到噬菌體的基因組上，當(dāng)這樣的噬菌體侵染另一宿主菌時(shí)，噬菌體DNA與受體菌的DNA同源區(qū)段配對(duì)，通過(guò)雙交換而整合到受體菌的染色體組上，使受體菌獲得了供體的這部分遺傳特性，而形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子（缺陷溶源菌）。局限轉(zhuǎn)導(dǎo)specializedtransduction84λ噬菌體DNA的不正常切割λ噬菌體DNA的不正常切割85丟失了自身部分基因，并被同等長(zhǎng)度的宿主基因所取代的噬菌體稱為缺陷噬菌體（defectivephage）。如λdgal或λdbio。低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（1owfrequancytransduction,LFT），形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子的頻率很低，只有10-4~10-6。高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（highfrequancytransduction,HFT），形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子的頻率很高,理論上可達(dá)50%。丟失了自身部分基因，并被同等長(zhǎng)度的宿主基因所取代的噬菌體稱為86高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)是雙重溶源的結(jié)果：

λ─┐│＋E.colik12→[E.coliK12(λ/λdgal)F]λdgal┘ ↓UV轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體（λgal）→轉(zhuǎn)導(dǎo)子菌落 輔助噬菌體（λ）→噬菌斑

高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)是雙重溶源的結(jié)果：87溶源轉(zhuǎn)變(lysonenicconversion)當(dāng)溫和噬菌體感染其宿主而使之發(fā)生溶源化時(shí)，因噬菌體的基因整合到宿主的基因組上，而使后者獲得了除免疫性以外的新性狀的現(xiàn)象。當(dāng)宿主喪失這一噬菌體時(shí)，通過(guò)溶源轉(zhuǎn)變而獲得的性狀也同時(shí)消失。溶源轉(zhuǎn)變與轉(zhuǎn)導(dǎo)有本質(zhì)上的不同，首先是它的溫和噬菌體不攜帶任何供體菌的基因；其次，這種噬菌體是完整的，而不是缺陷的。溶源轉(zhuǎn)變的典型例子是不產(chǎn)毒素的白喉棒桿菌(Corynebacteriumdiphtheriae)菌株在被β噬菌體感染而發(fā)生溶源化時(shí)，會(huì)變成產(chǎn)白喉毒素的致病菌株。溶源轉(zhuǎn)變(lysonenicconversion)88接合conjugation通過(guò)供體菌與受體菌間細(xì)胞相接觸而傳遞大段DNA的過(guò)程。1946年，Lederberg和Tatum的E.colik12營(yíng)養(yǎng)缺陷型株混合培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)。E.colik12兩個(gè)突變株①bio-met-the+leu+②bio+met+the-leu-兩種菌混合培養(yǎng)后，出現(xiàn)原養(yǎng)菌（bio+met+the+leu+）可在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。接合conjugation89細(xì)菌接合現(xiàn)象研究得最清楚的是大腸桿菌。大腸桿菌是有性別分化的。決定它們性別的因子稱為F因子(即致育因子或稱性質(zhì)粒)，呈超螺旋狀態(tài)，具有自主的與染色體進(jìn)行同步復(fù)制和轉(zhuǎn)移到其他細(xì)胞中去的能力。也可插入(即整合)到染色體組上；它既可經(jīng)過(guò)接合作用而獲得，也可通過(guò)一些理化因素(如吖啶橙、Ni2+、Co2+、絲裂霉素C、硫酸十二酯鈉、亞硝基胍、利福平、溴化乙錠、環(huán)己亞胺和加熱等)的處理，而從細(xì)胞中消失。F因子的分子量為5×107。在大腸桿菌中，F(xiàn)因子的DNA含量約占總?cè)旧w含量的2%。細(xì)菌接合現(xiàn)象研究得最清楚的是大腸桿菌。大腸桿菌是有性別分化的90F因子的存在方式及其相互關(guān)系

F因子的存在方式及其相互關(guān)系91F+菌株含F(xiàn)質(zhì)粒，細(xì)胞表面產(chǎn)生性毛(sexpili)，與F-細(xì)胞相連，在接合后轉(zhuǎn)移DNA。F-菌株無(wú)F質(zhì)粒，不產(chǎn)生性毛，可接受外來(lái)F質(zhì)粒。F+菌株92《微生物遺傳與變異》課件93Hfr菌株高頻重組菌株（highfrequencyrecombination）。與F-接合后，重組頻率比F+高幾百倍。在Hfr細(xì)胞中，存在與染色體特定位點(diǎn)相整合的F因子(產(chǎn)生頻率約10-5)。當(dāng)它與F-菌株發(fā)生接合時(shí)，Hfr染色體在F因子處發(fā)生斷裂，由環(huán)狀變成線狀。整段線狀染色體轉(zhuǎn)移至F-細(xì)胞的全過(guò)程約需100min。在轉(zhuǎn)移時(shí)，由于斷裂發(fā)生在F因子中，所以必然要等Hfr的整條染色體組全部轉(zhuǎn)移完成后，F(xiàn)因子才能完全進(jìn)入F-細(xì)胞。但轉(zhuǎn)移過(guò)程中斷，所以越在前端的基因，進(jìn)入的機(jī)會(huì)就越多，故在F-中出現(xiàn)重組子的時(shí)間就越早，頻率也高。Hfr菌株94F’菌株當(dāng)Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離其染色體組時(shí)，可形成游離的攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱F’因子。攜帶有F’因子的菌株，其性狀介于F+與Hfr之間，這就是初生F’菌株。初生F’菌株與F-菌株接合，可使后者轉(zhuǎn)變成F’菌株，這就是次生F’菌株，它既獲得了F因子，又獲得了來(lái)自初生F’菌株的若干遺傳性狀。以這種接合來(lái)傳遞供體菌基因的方式，稱為F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)(F-duction)、性導(dǎo)(sexduction)

。在次生的F’群體中，大約有10%的F’因子重新整合到染色體組上，而恢復(fù)成Hfr菌。F’菌株95原生質(zhì)體融合

通過(guò)人工的方法，使遺傳性狀不同的兩細(xì)胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合并產(chǎn)生重組體的過(guò)程稱為原生質(zhì)體融合（protoplastfusion）。微生物細(xì)胞融合的研究開(kāi)始于1976年。其一般原理和主要過(guò)程是：先準(zhǔn)備兩個(gè)有選擇性遺傳標(biāo)記的突變株，在高滲溶液中，用適當(dāng)?shù)拿摫诿溉コ?xì)胞壁，再將形成的原生質(zhì)體離心聚集，并加入促融合劑PEG(聚乙二醇)促進(jìn)融合，然后在高滲溶液中稀釋，涂在能使其再生細(xì)胞壁或進(jìn)行分裂的培養(yǎng)基上，待形成菌落后，通過(guò)影印接種法，將其接種到各種選擇性培養(yǎng)基上，最后鑒定它們是否是重組子。原生質(zhì)體融合96基因轉(zhuǎn)座genetransposition轉(zhuǎn)座子的特征是在兩端有IR序列，分兩類：Ⅰ型Compoundtransposons：兩端為IS，抗性基因居中。如Tn5、Tn9、Tn10、Tn4001、Tn4003。Ⅱ型Complextransposons：兩端為IR(30~50bp)，中間為轉(zhuǎn)座基因和抗性基因。如Tn1、Tn3、Tn21、Tn1721、Tn551?；蜣D(zhuǎn)座genetransposition97第三節(jié)真核微生物的基因重組

有性雜交準(zhǔn)性生殖準(zhǔn)性生殖是一種類似于有性生殖，但比它更為原始的一種生殖方式，它可使同種生物不同菌株的體細(xì)胞發(fā)生融合，不經(jīng)過(guò)減數(shù)分裂的方式而導(dǎo)致低頻率的基因重組并產(chǎn)生重組子。第三節(jié)真核微生物的基因重組98粗糙脈孢菌的有性雜交粗糙脈孢菌的有性雜交99準(zhǔn)性生殖：準(zhǔn)性生殖包括下面四個(gè)過(guò)程①菌絲聯(lián)結(jié)，②異核體形成，③核配④體細(xì)胞交換和單倍體化四個(gè)階段。準(zhǔn)性生殖：100第四節(jié)微生物基因突變和誘變育種

基因突變突變（mutation）指DNA順序上核苷酸發(fā)生置換或其它順序上的改變。突變類型①堿基對(duì)置換substitution轉(zhuǎn)換transition：顛換transversion：②移碼突變frame-shiftmutant③染色體畸變chromosomalaberrationdeletion、duplication、insertion、translocation、inversion第四節(jié)微生物基因突變和誘變育種基因突變101基因突變表型形態(tài)突變型生化突變型營(yíng)養(yǎng)缺陷型auxotroph；抗性突變型