SIRT1在賁門(mén)癌中的表達(dá)及臨床病理學(xué)意義研究

SIRT1在賁門(mén)癌中的表達(dá)及臨床病理學(xué)意義研究sirt1在賁門(mén)癌中的表達(dá)及臨床病理學(xué)意義研究【本文關(guān)鍵詞語(yǔ)】sirt1；賁門(mén)癌；預(yù)后【內(nèi)容摘要】目的研究sirt1表達(dá)與賁門(mén)癌臨床病理學(xué)間的關(guān)系及對(duì)預(yù)后的影響。方法應(yīng)用組織芯片技術(shù)和免疫組化方法檢測(cè)176例賁門(mén)癌組織和32例正常賁門(mén)組織中sirt1、p53、ki67蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果sirt1在賁門(mén)癌中的陽(yáng)性表達(dá)率高于正常賁門(mén)中的陽(yáng)性表達(dá)率〔p0.01〕；176例賁門(mén)癌中，sirt1在淋逢迎有轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)高于淋逢迎無(wú)轉(zhuǎn)移組〔p0.01〕;且sirt1表達(dá)與賁門(mén)癌tnm分期呈正相關(guān)〔p0.05〕。sirt1陽(yáng)性組的ki67蛋白水平高于sirt1陰性組〔p0.05〕。其中90例有隨訪資料的賁門(mén)癌病例中，sirt1陽(yáng)性患者的3年生存率及平均生存時(shí)間，低于sirt1陰性表達(dá)患者〔p0.05〕。結(jié)論sirt1在賁門(mén)癌組織中存在過(guò)表達(dá)，與淋逢迎轉(zhuǎn)移、tnm分期、腫瘤增殖狀況以及預(yù)后相關(guān)，可能成為斷定賁門(mén)癌惡性水平及評(píng)估預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)?！颈疚年P(guān)鍵詞語(yǔ)】sirt1；賁門(mén)癌；預(yù)后studyontheclinicopathologicsignificanceandexpressionofsirt1fenganning,fanxiangshan,huangqin,etal.departmentofpathology,gulouclinicalmedicalcollegeaffiliatedtonanjingmedicaluniversity,nanjing210008,china【abstract】objectivetoinvestigatetheexpressionofsirt1ingastriccardiacarcinomaanditscorrelationwithclinicopathologicfeaturesandpatients'prognosis.methodstissuemicroarray(tma)techniqueandimmunohistochemistrystainwereusedtodetecttheexpressionofsirt1,p53,andki67in176casesofgastriccardiacarcinomatissuesand32casesofnormalgastriccardiacregionsthepositiverateofsirt1expressioningastriccardiacarcinomacaseswassignificantlyhigherthanthatinnormalgastriccardiacregiontissues(p0.01);inthe176casesofgastriccardiacarcinoma,theexpressionofsirt1inlymphnodemetastasisgroupwassignificantlyhigherthanthatinthegroupwithoutlymphnodemetastasis(p0.01),whichwaspositivelycorrelatedtotnmstage(p0.05);theproteinlevelsofki67insirt1positivegroupweresignificantlyhigherthanthoseinsirt1negativegroup(p0.05).inthe90patientswithcompletefollowupinformation,thethree-yearsurvivalrateandmeansurvivaltimeofpatientswithpositivesirt1expressionweresignificantlylowerthanthoseofpatientswithnegativesirt1expression(p0.05).conclusionthereexistsoverexpressionofsirt1ingastriccardiacarcinoma,andthehighexpressionofsirt1iscorrelatedwithlymphaticmetastasis,tnmstage,proliferativestatusandpatients’prognosis.sirt1maybeabiologicalparametertoevaluatethemalignantdegreeofgastriccardiacarcinomaandtoforecastthepatients'prognosisofgastriccardiacarcinoma.【keywords】sirt1;gastriccardiacarcinoma;prognosis緘默信息調(diào)節(jié)因子2〔silentinformationregulator2,sir2〕是依靠于尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸〔nicotinmideadentinedinucleotide,nad+〕的組蛋白去乙?；?，屬第ⅲ類去乙?；?。t1是sir2的哺乳動(dòng)物同源物，在體內(nèi)可將組蛋白及多種非組蛋白去乙?；?，調(diào)節(jié)基因表達(dá)及蛋白質(zhì)功能，與神經(jīng)變性疾?。?］、代謝相關(guān)疾病［2］的發(fā)生有關(guān)。最近研究顯示，sirt1在很多人類惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)［3，4］，提示其可能參與了腫瘤的構(gòu)成及進(jìn)展經(jīng)過(guò)。賁門(mén)癌是發(fā)生于胃食管連接部〔gastroesophagealjunction,gej〕的惡性腫瘤，近年來(lái)因其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)而遭到更多的關(guān)注。本研究以組織芯片技術(shù)及免疫組化染色方法，檢測(cè)sirt1、p53和ki67在賁門(mén)癌以及正常賁門(mén)部黏膜中的表達(dá)情況，分析sirt1表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)以及預(yù)后間的關(guān)系，討論sirt1在賁門(mén)癌發(fā)生進(jìn)展中可能起到的作用。1資料與方法1.1一般資料標(biāo)原來(lái)源于南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院2005至2007年賁門(mén)癌存檔標(biāo)本176例，患者均為初次發(fā)現(xiàn)賁門(mén)癌，術(shù)前未經(jīng)任何治療。176例患者中男132例，女44例；年齡41～90歲，平均年齡64歲；腫瘤最大直徑≥5cm89例，＜5cm87例；有淋逢迎轉(zhuǎn)移128例，無(wú)淋逢迎轉(zhuǎn)移48例。tnm分期ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ期分別為17、31、103、25例。按組織學(xué)類型分類，高分化腺癌1例，中分化腺癌79例，低分化腺癌79例,粘液細(xì)胞癌7例,粘液腺癌10例，所有病例資料完好，標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛溶液固定，慣例處理后石蠟包埋。對(duì)照組為賁門(mén)部正常胃黏膜組織32例，均經(jīng)鏡下證明未被腫瘤細(xì)胞侵襲。176例中有90例具有3年隨訪資料。1.2組織芯片構(gòu)建組織微陣列打孔系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)beecherinstrument公司。所有病例復(fù)診后根據(jù)he切片標(biāo)記出典型病變范圍，應(yīng)用組織微陣列打孔儀在每例組織典型病變處取樣，分別移植至受體蠟塊上，取樣針直徑1mm，制成13×16個(gè)點(diǎn)的組織芯片蠟塊，連續(xù)4μm厚切片；按同樣方法構(gòu)建另一個(gè)包括一樣病例且陣列設(shè)計(jì)一樣的組織芯片蠟塊以便實(shí)驗(yàn)反復(fù)。1.3免疫組化染色組織芯片脫蠟至水，0.01mol/ledta〔ph=8〕高壓抗原修復(fù)，按照envision試劑盒說(shuō)明書(shū)行免疫組化法染色。所用sirt1〔克隆號(hào):e104〕購(gòu)自美國(guó)sigma公司；p53〔克隆號(hào)：do7〕，ki67(克隆號(hào)：7b11)購(gòu)自北京中杉公司。染色中采取pbs代替一抗作為陰性對(duì)照，已經(jīng)知道陽(yáng)性切片為陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)檢測(cè)指標(biāo)均在另一張組織芯片上反復(fù)1次。1.4結(jié)果斷定無(wú)背景著色情況下以胞核出現(xiàn)黃色或棕色顆粒者為陽(yáng)性染色。如染色不連續(xù)，明顯減弱或缺失，則被斷定為不正常染色。對(duì)同一病例的腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性染色數(shù)量取2張組織芯片染色結(jié)果的平均值，并作為該病例最終評(píng)分。sirt1、p53結(jié)果斷定標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤細(xì)胞中陽(yáng)性染色數(shù)量≥30%為陽(yáng)性結(jié)果，＜30%為陰性結(jié)果［5］；ki67結(jié)果斷定標(biāo)準(zhǔn)：記數(shù)陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞數(shù)所占的比例，以5%為單位進(jìn)行半定量評(píng)估［6］。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用spss15.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采取χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性采取spearman相關(guān)分析，生存數(shù)據(jù)進(jìn)行kaplanmeier分析，并繪制生存曲線圖，應(yīng)用logrank檢驗(yàn)差別性，p0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1sirt1在賁門(mén)癌組織和賁門(mén)部正常胃黏膜組織中的表達(dá)sirt1陽(yáng)性著色定位于胞核，呈黃色或棕黃色〔圖1〕。176例賁門(mén)癌中呈陽(yáng)性表達(dá)81例〔46.02%〕，32例賁門(mén)部正常黏膜中呈陽(yáng)性表達(dá)6例〔18.75%〕，2組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔p0.01〕。2.2sirt1在賁門(mén)癌組織中表達(dá)與賁門(mén)癌臨床病理學(xué)參數(shù)間的關(guān)系176例賁門(mén)癌組織中，sirt1的表達(dá)在性別、年齡、腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、組織學(xué)分化中差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔p＞0.05〕，在淋逢迎轉(zhuǎn)移、分期方面差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔p0.05或0.01〕，sirt1表達(dá)與賁門(mén)癌分期呈正相關(guān)〔rs=0.159,p0.05〕。見(jiàn)表1。表1sirt在賁門(mén)癌中的表達(dá)及其臨床病理學(xué)聯(lián)絡(luò)〔略〕2.3賁門(mén)癌中sirt1表達(dá)與p53及ki67表達(dá)的關(guān)系sirt1陽(yáng)性表達(dá)病例中，p53陽(yáng)性表達(dá)率為45.68%〔37/81〕，與sirt1陰性病例中的p53陽(yáng)性率50.53%(48/95)相比，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔p0.05〕。ki67的li指數(shù)在sirt1陽(yáng)性病例中平均值為46.1728,sirt1陰性病例中均值為38.0000，sirt1陽(yáng)性病例中ki67的li均數(shù)高于sirt1陰性病例，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔p=0.041〕。賁門(mén)癌中p53及ki67表達(dá)情況見(jiàn)圖2、3，sirt1與ki67及p53表達(dá)水平間的關(guān)系。見(jiàn)表2。表2賁門(mén)癌中sirt1的表達(dá)與p53，ki67之間的關(guān)系例〔略〕2.4sirt1的表達(dá)與賁門(mén)癌預(yù)后之間的關(guān)系176例賁門(mén)癌病例中，失訪86例。90例隨訪資料完好病例sirt1陽(yáng)性者46例，1、2、3年生存率(survivalrate)分別為80.4%，59.7%,48.6%,平均生存時(shí)間(meansurvivaltime)為29.9個(gè)月；44例sirt1陰性表達(dá)病例的1、2、3年生存率分別為88.6%，78.6%,71%,平均生存時(shí)間為39.8個(gè)月。經(jīng)logrank分析差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔p0.024〕。生存曲線見(jiàn)圖4。3討論本研究結(jié)果提示，sirt1可能參與了賁門(mén)癌的構(gòu)成和增殖，并可能成為判定腫瘤惡性水平及預(yù)后的指標(biāo)。sirt1與細(xì)胞存活，分化,代謝，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期等相關(guān)。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證明sirt1參與了腫瘤細(xì)胞的放化療耐受［7］，提示sirt1可能在腫瘤發(fā)生及進(jìn)展中起到促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示sirt1可能參與了賁門(mén)癌的發(fā)生和進(jìn)展，其效應(yīng)可能為促進(jìn)作用。原由于：〔1〕sirt1在賁門(mén)癌組織中表達(dá)增高；〔2〕sirt1的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞中的ki67水平呈正相關(guān)；〔3〕sirt1陽(yáng)性病例比sirt1陰性病例預(yù)后差，且sirt1表達(dá)與腫瘤分期、淋逢迎轉(zhuǎn)移相關(guān)。但也有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠結(jié)腸癌模型中，sirt1起到的作用是一個(gè)腫瘤抑制因子而非促進(jìn)因子［8］，另外亦有研究發(fā)現(xiàn)sirt1在乳腺癌中表達(dá)為降低而非增高［9］，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反。以上互相矛盾結(jié)論產(chǎn)生的原因可能是由于不同組織中sirt1表達(dá)含量及蛋白活性有差別，且sirt1的底物諸多，很多底物還尚待證明。p53在體內(nèi)有野生型和突變型兩種。野生型p53蛋白具有抑癌作用，突變型p53編碼的蛋白由于喪失其抑癌功能，可導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)限增殖而引發(fā)腫瘤。sirt1能通過(guò)對(duì)野生型p53蛋白第283位賴氨酸殘基的去乙酰化來(lái)下調(diào)p53活性，以減少dna損傷或應(yīng)激條件下的細(xì)胞凋亡［10］，陳虹等［11］研究發(fā)現(xiàn)，p53基因的突變與食管賁門(mén)部多源癌的發(fā)生具有相關(guān)性。近年研究發(fā)現(xiàn)，p53突變與sirt1也有一定關(guān)系。jang等［5］用免疫組化方法檢測(cè)104例彌漫大b細(xì)胞淋巴瘤的p53和sirt1表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)p53和sirt1水平存在相關(guān)性，且都與生存率及生存期相關(guān)。由于免疫組化檢測(cè)到的都是突變型p53蛋白，由此結(jié)果揣測(cè)sirt1與p53突變?cè)趶浡骲細(xì)胞淋巴瘤的預(yù)后中可能存在互相影響的協(xié)同作用。除此之外，突變型p53還可間接調(diào)控sirt1的表達(dá)，機(jī)制是通過(guò)調(diào)節(jié)mirna中的mir34a的水平，其中mir34a是非編碼rna中的一類，可影響sirt1基因的轉(zhuǎn)錄［12］。由以上研究結(jié)論揣測(cè)，突變型p53與sirt1之間可能存在著一種負(fù)反應(yīng)聯(lián)絡(luò)，在無(wú)p53突變的腫瘤中，sirt1可能在癌變及進(jìn)展中起到了關(guān)鍵作用。然而本實(shí)驗(yàn)中，p53和sirt1的核染色情況未見(jiàn)顯著相關(guān)性，揣測(cè)在賁門(mén)癌中，sirt1與p53突變間的互相作用并不是其參與腫瘤構(gòu)成的重要作用。可能是由于sirt1在p53和sirt1表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制復(fù)雜，且腫瘤組織類型不同其發(fā)生機(jī)制也不同。當(dāng)前研究支持sirt1促進(jìn)了細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)，機(jī)制為通過(guò)調(diào)控ras促分裂原活化蛋白激酶〔rasmitogenactivatedproteinkinase,rasmapk)［13］、erk/s6k1等［14］細(xì)胞信號(hào)通路的活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此結(jié)論一致。ki67是增殖細(xì)胞核抗原，其陽(yáng)性著色的細(xì)胞百分比可用來(lái)客觀評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖狀況。本實(shí)驗(yàn)中,賁門(mén)癌組織中sirt1陽(yáng)性組的ki67水平明顯高于sirt1陰性組，表示清楚在sirt1陽(yáng)性病例中，更多的腫瘤細(xì)胞處于增殖活潑踴躍狀況。此結(jié)果提示sirt1參與了賁門(mén)癌細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)，效應(yīng)可能是促進(jìn)作用而非抑制造用。近年來(lái)越來(lái)越多的關(guān)于賁門(mén)部腫瘤的研究被各國(guó)研究者報(bào)道，賁門(mén)癌在組織學(xué)、生長(zhǎng)方式、表型、細(xì)胞分化等方面上具有多樣性特征［15］。和非賁門(mén)部癌相比，賁門(mén)癌多有淋逢迎轉(zhuǎn)移，預(yù)后更差［16］。至今尚無(wú)用于評(píng)估賁門(mén)癌預(yù)后的單獨(dú)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，sirt1在有淋逢迎轉(zhuǎn)移病例中的陽(yáng)性表達(dá)率，較無(wú)淋逢迎轉(zhuǎn)移病例中的陽(yáng)性表達(dá)率高，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且sirt1水平與tnm分期呈正相關(guān)，分期越高的賁門(mén)癌組織中sirt1陽(yáng)性病例數(shù)越多，揣測(cè)sirt1可能通過(guò)某種機(jī)制促進(jìn)腫瘤淋逢迎轉(zhuǎn)移，進(jìn)而影響到腫瘤分期。另外，生存分析結(jié)果提示，sirt1陽(yáng)性表達(dá)的病例其總生存期、3年生存率均低于sirt1陰性病例，提示sirt1陽(yáng)性表達(dá)的腫瘤其惡性水平更高層次，預(yù)后較差。以上結(jié)果顯示，sirt1可能作為用來(lái)評(píng)估賁門(mén)癌惡性水平及臨床預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)記物?！疽韵聻閰⒖嘉墨I(xiàn)】1arakit,sasakiy,milbrandtj.increasednuclearnadbiosynthesisandsirt1activationpreventaxonaldegeneration.science,2004,305:10101013.2bordonel,mottamc,picardf,etal.sirt1regulatesinsulinsecretionbyrepressingucp2inpancreaticbetacells.plosbiol,2006,4:31.3junghynesb,nihalm,zhongw,etal.roleofsirtuinhistonedeacetylasesirt1inprostatecancer.atargetforprostatecancermanagementviaitsinhibition.jbiolchem,2009,284:38233832.4hiday,kuboy,muraok,etal.strongexpressionofalongevityrelatedprotein,sirt1,inbowen’sdisease.archdermatolres,2007,299:103106.5jangky,hwangsh,kwonks,etal.sirt1expressionisassociatedwithpoorprognosisofdiffuselargebcelllymphoma.amjsurgpathol,2008,32:15231531.6gaedckej,traubf,mildes,etal.predominanceofthebasaltypeandher2/neutypeinbrainmetastasisfrombreastcancer.modpathol,2007,20:864870.7chuf,choupm,zhengx,etal.controlofmultidrugresistancegenemdr1andcancerresistancetochemotherapybythelongevitygenesirt1.cancerres,2005,65:1018310187.8firesteinr,blanderg,michans,etal.thesirt1deacetylasesuppressesintestinaltumorigenesisandcoloncancergrowth.plosone,2008,3:2020.9wangrh,senguptak,lic,etal.impaireddnadamageresponse,genomeinstability,andtumorigenesisinsirt1mutantmice.cancercell,2008,14:312323.10luoj,nikolaevay,imais,etal.negativecontrolofp53bysir2alphapromotescellsurvivalunderstress.cell,2001,107:137148.11陳虹，王立東