Western-blotting蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)課件

蛋白免疫印跡（WesternBlot）生物實(shí)驗(yàn)培訓(xùn)系列之三蛋白免疫印跡生物實(shí)驗(yàn)培訓(xùn)系列之三

WB的基礎(chǔ)一目錄2

實(shí)驗(yàn)步驟與結(jié)果分析三實(shí)驗(yàn)室常見問(wèn)題解答四試劑與設(shè)備二WB的基礎(chǔ)一目錄2目錄31.WB的概念2.WB的應(yīng)用3.WB的原理4.WB的特點(diǎn)

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實(shí)驗(yàn)步驟與結(jié)果分析三實(shí)驗(yàn)室常見問(wèn)題解答四試劑與設(shè)備二目錄31.WB的概念WB的基礎(chǔ)一1.1蛋白免疫印跡的概念是將電泳分離后的總蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特異性抗體檢測(cè)某特定抗原的一種蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)。41.1蛋白免疫印跡的概念是將電泳分離后的總蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移1.2蛋白免疫印跡的應(yīng)用基因在蛋白水平的表達(dá)研究例：吳德平,王穎等.立氏立克次體蛋白抗原基因的表達(dá)和重組蛋白抗原的免疫印跡分析[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2009,25(10):931-934.抗體活性檢測(cè)例：胡紀(jì)文，馬東禮.免疫印跡法檢測(cè)血清幽門螺桿菌抗體的應(yīng)用價(jià)值[J].

熱帶醫(yī)學(xué)雜志,2013,13(8):952-956.疾病早期診斷例：諸延慧，容瓘等.酶聯(lián)免疫印跡術(shù)(EITB)在小鼠日本血吸蟲感染早期診斷中的應(yīng)用[J].

中國(guó)人獸共患病雜志,1993,9(3):26-29.51.2蛋白免疫印跡的應(yīng)用基因在蛋白水平的表達(dá)研究51.2蛋白免疫印跡的應(yīng)用檢測(cè)樣品中特異性蛋白質(zhì)是否存在例：李桂波.利用免疫印跡法釣取PC3M細(xì)胞中與人前列腺癌高轉(zhuǎn)移相關(guān)特異性短肽結(jié)合蛋白的研究[D].吉林:吉林大學(xué),2007.對(duì)特異性蛋白質(zhì)進(jìn)行半定量分析例：61.2蛋白免疫印跡的應(yīng)用檢測(cè)樣品中特異性蛋白質(zhì)是否存在61.3WB的原理WB采用的是聚丙烯酰氨凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。通過(guò)特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過(guò)的蛋白質(zhì)進(jìn)行著色。通過(guò)分析著色的位置和著色的深度獲得特定的蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況的信息。71.3WB的原理WB采用的是聚丙烯酰氨凝膠電泳，被檢測(cè)物是1.4WB的特點(diǎn)WB是在蛋白質(zhì)電泳分離和抗原、抗體檢測(cè)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的檢測(cè)蛋白質(zhì)的技術(shù)SDS凝膠電泳：高分辨率抗原抗體反應(yīng)：特異性轉(zhuǎn)膜：靈敏度81.4WB的特點(diǎn)WB是在蛋白質(zhì)電泳分離和抗原、抗體檢測(cè)基礎(chǔ)目錄91.試劑2.耗材3.設(shè)備

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實(shí)驗(yàn)步驟與結(jié)果分析三實(shí)驗(yàn)室常見問(wèn)題解答四試劑與設(shè)備二目錄91.試劑WB的基礎(chǔ)一2.1試劑甲叉雙丙烯酰胺TrisHCLSDS102.1試劑甲叉雙丙烯酰胺TrisHCLSDS10丙烯酰胺過(guò)硫酸銨TEMED2.1試劑11丙烯酰胺過(guò)硫酸銨TEMED2.1試劑11RIPA裂解液SDSloadingBuffer封閉液ECL顯影液2.1試劑12RIPA裂解液SDSloadingBuffer2.1試劑配置聚丙烯酰胺儲(chǔ)存液：29g丙稀酰胺、1gN,N-亞甲叉雙丙稀酰胺、加H2O至100mL。注意事項(xiàng):應(yīng)以溫?zé)岬娜ルx子水配制儲(chǔ)于棕色瓶，4℃避光保存。嚴(yán)格核實(shí)pH不得超過(guò)7.0，因光催化或堿催化可以發(fā)生脫氨基反應(yīng)。使用期不得超過(guò)兩個(gè)月，隔幾個(gè)月須重新配制。如有沉淀，可以過(guò)濾。132.1試劑配置聚丙烯酰胺儲(chǔ)存液：132.1試劑配置分離膠緩沖液(1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8)):18.15gTris和48mL1mol/LHCL混合加水稀釋到100mL終體積。濃縮膠緩沖液(0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mLH2O中，用約48mL1mol/LHCL調(diào)至pH6.8加水稀釋到100mL終體積。注意事項(xiàng):過(guò)濾后4℃保存。這兩種緩沖液必須使用Tris堿制備，再用HCL調(diào)節(jié)pH值，而不用Tris-HCL。轉(zhuǎn)移緩沖液：

2.9g甘氨酸、5.8gTris堿、0.37gSDS，并加入200mL甲醇，加水至總量1L。142.1試劑配置分離膠緩沖液(1.5mmol/LTris-H2.1試劑配置SDS蛋白上樣緩沖液:pH6.8的0.5mol/LTris緩沖液8mL，甘油6.4mL，10%SDS12.8mL，巰基乙醇3.2mL，0.05%溴酚藍(lán)1.6mL，H2O32mL混勻備用。按1:1或1:2比例與蛋白質(zhì)樣品混合，沸水煮3min，混勻后再上樣，一般為20-25μL，總蛋白量100μg。Tris緩沖鹽溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LNaCl。Tris-甘氨酸電泳緩沖液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸餾水溶解至1000mL，臨用前稀釋10倍。152.1試劑配置SDS蛋白上樣緩沖液:152.2耗材移液槍/槍頭濾紙藍(lán)蓋玻璃瓶量筒容量瓶離心管燒杯96孔板PVDF膜海綿墊162.2耗材移液槍/槍頭離心管162.3設(shè)備垂直電泳儀化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)臺(tái)式離心機(jī)172.3設(shè)備垂直電泳儀化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)臺(tái)式離心機(jī)172.3設(shè)備高壓滅菌鍋電子天平電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱182.3設(shè)備高壓滅菌鍋電子天平電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱182.3設(shè)備磁力攪拌器4℃、-20℃冰箱192.3設(shè)備磁力攪拌器4℃、-20℃冰箱19目錄201.實(shí)驗(yàn)步驟2.結(jié)果分析3.注意事項(xiàng)

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實(shí)驗(yàn)步驟與結(jié)果分析三實(shí)驗(yàn)室常見問(wèn)題解答四試劑與設(shè)備二目錄201.實(shí)驗(yàn)步驟WB的基礎(chǔ)一3.1實(shí)驗(yàn)步驟蛋白樣品制備蛋白含量測(cè)定213.1實(shí)驗(yàn)步驟蛋白樣品制備蛋白含量測(cè)定213.1.1蛋白樣品制備在六孔板中，按照一個(gè)孔添加150μL的比例添加適量RIPA裂解液，用槍吹打均勻以充分接觸細(xì)胞。樣品放置冰上30min（中間混勻5-6次）直至裂解完全。充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作22裂解液用量說(shuō)明：通常6孔板每孔細(xì)胞加入150μL裂解液，若細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液用量至200μL或250μL。3.1.1蛋白樣品制備在六孔板中，按照一個(gè)孔添加150μLa).配制BCA工作液：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，按50體積試劑A,1體積試劑B配制適量BCA工作液，充分混勻。b).將標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品和工作液按下表加入到96孔板中，混勻。23管號(hào)試劑(μL)空白管標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定管×21×32×33x34×35×36×3蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液(1mg/mL)01246810—蒸餾水(μL)10986420—待測(cè)樣(μL)———————10BCA工作液(μL)2002002002002002002002003.1.2蛋白含量測(cè)定a).配制BCA工作液：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，按50體積試劑3.1.2蛋白含量測(cè)定c).混勻后，在37℃烘箱中溫浴30min，冷卻至室溫。d).酶標(biāo)儀562nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。e).以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。f).用測(cè)定孔平均光吸收值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量。243.1.2蛋白含量測(cè)定c).混勻后，在37℃烘箱中溫浴303.1.3聚丙烯酰氨凝膠電泳所帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，從而消除了不同分子之間原有的電荷差異。25上樣緩沖液的作用SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)在強(qiáng)還原劑（β-巰基乙醇）作用下，使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂蛋白質(zhì)(SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物)-3.1.3聚丙烯酰氨凝膠電泳所帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分3.1.3聚丙烯酰氨凝膠電泳PAGE膠的聚合原理：甲叉雙丙烯酰胺和丙烯酰胺在過(guò)硫酸銨的作用下聚合，形成膠。分子篩效應(yīng)263.1.3聚丙烯酰氨凝膠電泳PAGE膠的聚合原理：甲叉雙丙清洗玻璃板配膠上樣電泳停止電泳27玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊，然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠配分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。待膠面升到玻璃板3/4位置時(shí)即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。（加水液封時(shí)要很慢，否則膠會(huì)被沖變型。）當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說(shuō)明膠已凝了。倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。配濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其撥出。（插梳子時(shí)要使梳子保持水平。）用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。（小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外。）3.1.3聚丙烯酰氨凝膠電泳清洗玻璃板配膠上樣電泳停止電泳27玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊，清洗玻璃板配膠上樣電泳停止電泳28測(cè)完蛋白含量后，計(jì)算含50mg蛋白的溶液體積即為上樣量。適量蛋白加入4：15*LoadingBuffer于離心管，100℃水中煮5min使蛋白變性。放置冰上3min，離心15min，13000rpm，4℃。加足夠的1*電泳緩沖液后開始準(zhǔn)備上樣。（電泳液至少要漫過(guò)內(nèi)測(cè)的小玻璃板。）用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。）3.1.3聚丙烯酰氨凝膠電泳清洗玻璃板配膠上樣電泳停止電泳28測(cè)完蛋白含量后，計(jì)算含50清洗玻璃板配膠上樣電泳停止電泳濃縮膠80V電壓跑20分鐘，可多跑幾分鐘；分離膠180V電壓跑至底端。純水沖洗玻璃板，取膠，清洗切去濃縮膠，在Marker下方切角做標(biāo)記，將膠泡在清水中。293.1.3聚丙烯酰氨凝膠電泳清洗玻璃板配膠上樣電泳停止電泳濃縮膠80V電壓跑20分鐘，可3.1.3聚丙烯酰氨凝膠電泳30清洗玻璃板配膠上樣電泳停止電泳3.1.3聚丙烯酰氨凝膠電泳30清洗玻璃板配膠上樣電泳停止3.1.4轉(zhuǎn)膜剪PVDF膜，并提前切個(gè)角，甲醇中泡約30秒，在放入蒸餾水中2min。將膜、海綿、濾紙一起泡入1*轉(zhuǎn)膜液中，平衡至少5min。（轉(zhuǎn)膜液可回收）打開電轉(zhuǎn)印夾，在黑色面一次放入海綿墊、三層濾紙、凝膠、PVDF膜、三層濾紙、海綿墊31轉(zhuǎn)膜條件：45V，1.5h3.1.4轉(zhuǎn)膜剪PVDF膜，并提前切個(gè)角，甲醇中泡約30秒3.1.5封閉用1×TBS漂洗一次。加入封閉緩沖液,置于振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行封閉(26℃,80rpm/min,2-4h)。323.1.5封閉用1×TBS漂洗一次。加入封閉緩沖液,置于振3.1.6一抗雜交棄封閉液，加入用Western一抗稀釋液稀釋的一抗雜交溶液,置于4℃雜交過(guò)夜或在振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行雜交(26℃,80rpm/min,1h)333.1.6一抗雜交棄封閉液，加入用Western一抗稀釋液3.1.7二抗雜交回收一抗雜交液，用TBST洗膜3次(置于振蕩培養(yǎng)箱中,26℃,80rpm/min,10min/每次)棄TBST，加入用封閉緩沖液稀釋的二抗雜交溶液,置于振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行雜交(26℃,80rpm/min,1h);343.1.7二抗雜交回收一抗雜交液，用TBST洗膜3次(置于WB顯色的分類放射自顯影底物化學(xué)發(fā)光ECL底物熒光ECF底物呈色DAB35WB顯色的分類放射自顯影底物化學(xué)發(fā)光ECL底物熒光ECF底物放射自顯影原理：利用放射性核素發(fā)射的射線，使感光材料中的鹵化銀等感光，顯出影像后進(jìn)行放射性標(biāo)記物的定位和定量測(cè)量的技術(shù)。特點(diǎn)：靈敏度高、分辨率好、保存時(shí)間長(zhǎng)久，但由于實(shí)驗(yàn)所用方式性物質(zhì)對(duì)人體有輻射作用。應(yīng)用：多用于研究標(biāo)記化合物在機(jī)體、組織和細(xì)胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機(jī)理、作用部位等等。放射自顯影原理：利用放射性核素發(fā)射的射線，使感光材料中的鹵化底物化學(xué)發(fā)光ECL原理:化學(xué)發(fā)光是在一些特殊的化學(xué)反應(yīng)中吸收了反應(yīng)釋放的化學(xué)能,而處于電子激發(fā)態(tài)的反應(yīng)中間體或反應(yīng)產(chǎn)物由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)所產(chǎn)生的一種光輻射,化學(xué)發(fā)光分析是根據(jù)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物的光輻射(化學(xué)發(fā)光)確定物質(zhì)含量的一種痕量分析方法。特點(diǎn):靈敏度高和線性范圍寬，不需要任何光源。底物化學(xué)發(fā)光ECL原理:化學(xué)發(fā)光是在一些特殊的化學(xué)反應(yīng)中吸收底物熒光ECF原理：是利用的熒光染料（如Cy2,Cy3,Cy5）標(biāo)記二抗，標(biāo)記熒光染料的二抗分別對(duì)應(yīng)相應(yīng)的目的蛋白，以此實(shí)現(xiàn)通過(guò)檢測(cè)熒光染料的信號(hào)強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)種蛋白信號(hào)的檢測(cè)，以進(jìn)行精確的定量分析。熒光檢測(cè)WesternBlot本來(lái)不是檢測(cè)的主流方法，不過(guò)熒光法檢測(cè)允許在同一張轉(zhuǎn)印膜上用不同顏色的熒光底物同時(shí)檢測(cè)不同的目標(biāo)。底物熒光ECF原理：是利用的熒光染料（如Cy2,Cy3,底物DAB呈色原理：二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine,DAB）是辣根過(guò)氧化物酶最敏感、最常用的顯色底物，反應(yīng)產(chǎn)物因不溶于水、二甲苯和醇的棕色沉淀物而被廣泛地用于蛋白印跡（WesternBlot,WB)、免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry,IHC)和免疫細(xì)胞化學(xué)(Immunocytochemistry,ICC)、斑點(diǎn)印跡(Dotblot)和生物芯片(Biochip)等的染色和顯色反應(yīng)。用之進(jìn)行對(duì)底物顯色即被稱為底物DAB呈色法。此技術(shù)成本低，操作也較簡(jiǎn)單是常用的westernblot成像分析技術(shù)之一，不過(guò)由于其靈敏度稍低，在目的蛋白表達(dá)量較少的情況下可能沒有理想的結(jié)果應(yīng)慎用。底物DAB呈色原理：二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzid3.1.8顯影檢測(cè)棄二抗溶液，用TBST洗膜3次（置于振蕩培養(yǎng)箱中，26℃，80rpm/min,10min/每次）；ECL工作液的配制：等體積混合Detectionreagent1和Detectionreagent2，現(xiàn)配現(xiàn)用。根據(jù)膜的大小，按每10平方厘米膜加1mLECL工作液，滴加ECL工作液工作液到膜上，確保使工作液均勻覆蓋在膜上，放置1分鐘。

利用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)采集圖像和進(jìn)行圖像分析。403.1.8顯影檢測(cè)棄二抗溶液，用TBST洗膜3次（置于振蕩3.2結(jié)果分析413.2結(jié)果分析413.3注意事項(xiàng)42電泳結(jié)束后，應(yīng)及時(shí)用清洗干凈玻璃板，清洗時(shí)應(yīng)使用海綿擦布，切勿使用刷子，以免刮花玻璃板；并及時(shí)沖洗電泳槽，以免鹽離子沉積，導(dǎo)致電泳絲腐蝕；注意海綿墊，濾紙（轉(zhuǎn)膜專用濾紙），轉(zhuǎn)印膜，膠的疊放位置，以保證正確的轉(zhuǎn)印方向；注意海綿墊，濾紙（轉(zhuǎn)膜專用濾紙），轉(zhuǎn)印膜，膠的相對(duì)大小，以免造成短路；轉(zhuǎn)印結(jié)束后，應(yīng)及時(shí)取出轉(zhuǎn)印膜，并立即用TBST漂洗1-2遍，并立即加入封閉液，這樣可以避免膜上的雜質(zhì)殘留或膜變干導(dǎo)致背景高的問(wèn)題；3.3注意事項(xiàng)42電泳結(jié)束后，應(yīng)及時(shí)用清洗干凈玻璃板，清洗

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實(shí)驗(yàn)步驟與結(jié)果分析三實(shí)驗(yàn)室常見問(wèn)題解答四試劑與設(shè)備二WB的基礎(chǔ)一目錄43常見問(wèn)題解答沒信號(hào)膜一片空白，沒有任何條帶，陽(yáng)性對(duì)照樣品也無(wú)條帶：實(shí)驗(yàn)失??？抗體失效？重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，重新稀釋抗體；膜一片空白，沒有任何條帶，陽(yáng)性對(duì)照樣品有條帶：實(shí)驗(yàn)樣品降解？實(shí)驗(yàn)樣品無(wú)該蛋白的表達(dá)？轉(zhuǎn)膜效率過(guò)低？重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，復(fù)核查找上述原因，以尋找對(duì)策。背景過(guò)高目的條帶以外的區(qū)域有信號(hào)，如果是片狀，甚至整塊膜，一般是封閉不好，膜變干，一抗非特異雜交或二抗的非特異雜交導(dǎo)致；如果是條紋狀，一般是由于膜上有壓痕導(dǎo)致，如果是點(diǎn)狀，一般是膜上有雜質(zhì)，或泡膜時(shí)膜沒有充分浸泡；轉(zhuǎn)膜效率過(guò)低。44常見問(wèn)題解答沒信號(hào)膜一片空白，沒有任何條帶，陽(yáng)性對(duì)照樣品也無(wú)常見問(wèn)題解答一抗效價(jià)低：提高一抗稀釋比例，提高雜交時(shí)間，減少洗膜次數(shù)，提高曝光時(shí)間，提高上樣量；轉(zhuǎn)膜效率低：檢測(cè)轉(zhuǎn)膜試劑和耗材，優(yōu)化轉(zhuǎn)膜條件；在目的帶以外的信號(hào)條帶為雜帶，一般由于一抗的特異性不好所導(dǎo)致，如果目的帶比雜帶信號(hào)強(qiáng)，可通過(guò)減低一抗的稀釋比例，并縮短雜交時(shí)間解決；如果目的帶比雜帶信號(hào)弱，在不減低一抗的稀釋比例的前提下，縮短雜交時(shí)間；并提高TBST緩沖液的NaCl的濃度提高到500nM；雜帶如果與目的帶的位置相距較遠(yuǎn)，可以不優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，直接裁剪即可，雜帶如果與目的帶的位置相距較進(jìn)，應(yīng)調(diào)整膠濃度，并延長(zhǎng)電泳時(shí)間。有雜帶目的帶弱45常見問(wèn)題解答一抗效價(jià)低：提高一抗稀釋比例，提高雜交時(shí)間，減少兩塊玻璃板之間灌膠,膠為什么總是不平?

46玻璃未洗凈過(guò)硫酸銨和TEMED加量過(guò)多可導(dǎo)致膠凝固過(guò)快而使膠不平加入試劑后未搖勻，導(dǎo)致局部聚合劑濃度過(guò)高，聚合較快而使膠不平加入不均勻，應(yīng)注意手法灌膠后應(yīng)進(jìn)行壓膠(可用水或正丁醇)溫度會(huì)影響膠聚合，若受熱不均勻，也會(huì)影響膠聚合不均勻。兩塊玻璃板之間灌膠,膠為什么總是不平?

46玻璃未洗凈過(guò)硫酸為什么會(huì)有“微笑”和“倒微笑”這樣的效果呢？

47微笑"是因?yàn)楣嗄z的時(shí)候冷卻不均勻，中間部分冷卻不好，導(dǎo)致凝膠中的分子有不同的遷移率所致。這種情況在較厚的凝膠以及垂直電泳時(shí)常常發(fā)生。“倒微笑“也稱“皺眉”現(xiàn)象常常是由于垂直電泳時(shí)電泳槽的裝置不合適引起的，特別是當(dāng)凝膠和玻璃板組成的三明治底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不完全便會(huì)產(chǎn)生這種現(xiàn)象

；中間部分和兩端受熱不一樣而致成了“倒微笑”可能是因?yàn)閮啥说哪z凝的不好，加APS和TEMED后應(yīng)該混合均勻。為什么會(huì)有“微笑”和“倒微笑”這樣的效果呢？

47Western-blot

制膠時(shí)好多泡泡怎么辦？48玻璃板需用洗潔精洗后再用雙蒸水沖洗，晾干配膠時(shí)應(yīng)沿管壁緩緩加入各成分，用手輕輕搖勻；若用槍頭吹打需緩慢且不要打到頭倒膠時(shí)，用槍沿一側(cè)緩緩加入，不要打到底，以免帶入氣泡封膠時(shí)，可用200μL槍加水，減小壓力，以免把膠沖起室溫制膠時(shí)，由于溫差及凝膠聚合反應(yīng)放熱可產(chǎn)生氣泡分離膠凝好后，倒掉里面的水，用吸水紙吸干，再加濃縮膠，迅速插梳子Western-blot

制膠時(shí)好多泡泡怎么辦？48玻璃板需問(wèn)答時(shí)間49問(wèn)答時(shí)間49WB標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)-試劑耗材與設(shè)備試劑：SDSRIPA裂解液丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺TEMEDECL顯影液封閉液TrisHCL過(guò)硫酸銨SDSloadingBuffer50耗材：離心管燒杯96孔板PVDF膜海綿墊移液槍/槍頭濾紙藍(lán)蓋玻璃瓶量筒容量瓶設(shè)備：臺(tái)式離心機(jī)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)垂直電泳儀電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱電子天平高壓滅菌鍋磁力攪拌器4℃、-20℃冰箱WB標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)-試劑耗材與設(shè)備試劑：50耗材：設(shè)備：WB標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)-試劑配置聚丙烯酰胺儲(chǔ)存液：29g丙稀酰胺、1gN,N-亞甲叉雙丙稀酰胺、加H2O至100ml。分離膠緩沖液(1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8)):18.15gTris和48mL1mol/LHCL混合加水稀釋到100mL終體積。濃縮膠緩沖液(0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mLH2O中，用約48mL1mol/LHCL調(diào)至pH6.8加水稀釋到100mL終體積。轉(zhuǎn)移緩沖液：

2.9g甘氨酸、5.8gTris堿、0.37gSDS，并加入200mL甲醇，加水至總量1L。51WB標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)-試劑配置聚丙烯酰胺儲(chǔ)存液：51SDS蛋白上樣緩沖液:pH6.8的0.5mol/LTris緩沖液8mL，甘油6.4mL，10%SDS12.8mL，巰基乙醇3.2mL，0.05%溴酚藍(lán)1.6mL，H2O32mL混勻備用。按1:1或1:2比例與蛋白質(zhì)樣品混合，沸水煮3min，混勻后再上樣，一般為20-25μL，總蛋白量100μg。Tris緩沖鹽溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LNaCl。10xTris-甘氨酸電泳緩沖液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸餾水溶解至1000mL。

臨用前稀釋10倍。52WB標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)-試劑配置SDS蛋白上樣緩沖液:52WB標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)-試劑配置WB標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程在六孔板中，按照一個(gè)孔添加150μL的比例添加適量RIPA裂解液，用槍吹打均勻以充分接觸細(xì)胞。樣品放置冰上30min（中間混勻5-6次）直至裂解完全。充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作53樣品制備WB標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程在六孔板中，按照一個(gè)孔添加150μL的比例添WB標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程54含量測(cè)定管號(hào)試劑(μL)空白管標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定管×21×32×33x34×35×36×3蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液(1mg/ml)01246810—蒸餾水(μL)10986420—待測(cè)樣(μL)———————10BCA工作液(μL)200200200200200200200200配制BCA工作液：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，按50體積試劑A,1體積試劑B配制適量BCA工作液，充分混勻。將標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品和工作液按表1加入到96孔板中，混勻。在37℃烘箱中溫浴30min，冷卻至室溫。酶標(biāo)儀562nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用測(cè)定孔平均光吸收值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量WB標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程54含量測(cè)定管號(hào)空白管標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定管1×32×清洗玻璃板配膠上樣電泳玻璃板對(duì)齊放入夾中卡緊，垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠配分離膠，加入TEMED立即搖勻即可灌膠。待膠面升到玻璃板3/4位置，膠上加一層水，液封后膠凝的更快。（加水液封時(shí)要很慢，否則膠會(huì)被沖變形）當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說(shuō)明膠已凝了。倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。配濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠后將梳子插入濃縮膠中。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。（插梳子時(shí)要使梳子保持水平）用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。（小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外。）測(cè)完蛋白含量后，計(jì)算含50mg蛋白的溶液體積即為上樣量。適量蛋白加入4：15*LoadingBuffer于離心管，100℃水中煮5min使蛋白變性。放置冰上3min，離心15min，13000rpm，4℃。加足夠的1*電泳緩沖液后開始準(zhǔn)備上樣。（電泳液至少要漫過(guò)內(nèi)測(cè)的小玻璃板。）用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。）停止電泳濃縮膠80V電壓跑20分鐘，可多跑幾分鐘；分離膠180V電壓跑至底端。純水沖洗玻璃板，取膠，清洗切去濃縮膠，在Marker下方切角做標(biāo)記，將膠泡在清水中。55WB標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程聚丙烯酰氨凝膠電泳清洗玻璃板配膠上樣電泳玻璃板對(duì)齊放入夾中卡緊，垂直卡在架子上ComponentVolumeddH2O3.3ml30%丙烯酰胺溶液4.0mlTris-HCl(1.5M,pH8.8)2.5ml10%SDS0.1ml10%AP0.1mlTEMED0.004mlTotal10ml12%分離膠配方ComponentVolumeddH2O2.7ml30%丙烯酰胺溶液0.67mlTris-HCl(1.0M,pH6.8)0.5ml10%SDS0.04ml10%AP0.04mlTEMED0.004mlTotal4.0ml5%濃縮膠配方WB標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程56ComponentVolumeddH2O3.3ml30%丙烯剪PVDF膜，并提前切個(gè)角，甲醇中泡約30秒，在放入蒸餾水中2min。將膜、海綿、濾紙一起泡入1*轉(zhuǎn)膜液中，平衡至少5min。（轉(zhuǎn)膜液可回收。）打開電轉(zhuǎn)印夾，在黑色面一次放入海綿墊、三層濾紙、凝膠、PVDF膜、三層濾紙、海綿墊57WB標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程轉(zhuǎn)膜一抗雜交封閉用1×TBS漂洗一次。加入封閉緩沖液,置于振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行封閉(26℃,80rpm/min,2-4h)。棄封閉液，加入用Western一抗稀釋液稀釋的一抗雜交溶液,置于4℃雜交過(guò)夜或在振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行雜交(26℃,80rpm/min,1h)轉(zhuǎn)膜條件：45V，1.5h剪PVDF膜，并提前切個(gè)角，甲醇中泡約30秒，在放入蒸餾水中58WB標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程二抗雜交回收一抗雜交液，用TBST洗膜3次(置于振蕩培養(yǎng)箱中，26℃，80rpm/min，10min/每次)棄TBST，加入用封閉緩沖液稀釋的二抗雜交溶液,置于振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行雜交(26℃，80rpm/min，1h)顯影檢測(cè)棄二抗溶液，用TBST洗膜3次（置于振蕩培養(yǎng)箱中，26℃，80rpm/min,10min/每次）；ECL工作液的配制：等體積混合Detectionreagent1和Detectionreagent2現(xiàn)配現(xiàn)用。根據(jù)膜的大小，按每10平方厘米膜加1mlECL工作液，滴加ECL工作液工作液到膜上，確保使工作液均勻覆蓋在膜上，放置1分鐘。利用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)采集圖像和進(jìn)行圖像分析。58WB標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程二抗雜交回收一抗雜交液，用TBST洗膜3謝謝聆聽！59謝謝聆聽！59蛋白免疫印跡（WesternBlot）生物實(shí)驗(yàn)培訓(xùn)系列之三蛋白免疫印跡生物實(shí)驗(yàn)培訓(xùn)系列之三

WB的基礎(chǔ)一目錄61

實(shí)驗(yàn)步驟與結(jié)果分析三實(shí)驗(yàn)室常見問(wèn)題解答四試劑與設(shè)備二WB的基礎(chǔ)一目錄2目錄621.WB的概念2.WB的應(yīng)用3.WB的原理4.WB的特點(diǎn)

WB的基礎(chǔ)一

實(shí)驗(yàn)步驟與結(jié)果分析三實(shí)驗(yàn)室常見問(wèn)題解答四試劑與設(shè)備二目錄31.WB的概念WB的基礎(chǔ)一1.1蛋白免疫印跡的概念是將電泳分離后的總蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特異性抗體檢測(cè)某特定抗原的一種蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)。631.1蛋白免疫印跡的概念是將電泳分離后的總蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移1.2蛋白免疫印跡的應(yīng)用基因在蛋白水平的表達(dá)研究例：吳德平,王穎等.立氏立克次體蛋白抗原基因的表達(dá)和重組蛋白抗原的免疫印跡分析[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2009,25(10):931-934.抗體活性檢測(cè)例：胡紀(jì)文，馬東禮.免疫印跡法檢測(cè)血清幽門螺桿菌抗體的應(yīng)用價(jià)值[J].

熱帶醫(yī)學(xué)雜志,2013,13(8):952-956.疾病早期診斷例：諸延慧，容瓘等.酶聯(lián)免疫印跡術(shù)(EITB)在小鼠日本血吸蟲感染早期診斷中的應(yīng)用[J].

中國(guó)人獸共患病雜志,1993,9(3):26-29.641.2蛋白免疫印跡的應(yīng)用基因在蛋白水平的表達(dá)研究51.2蛋白免疫印跡的應(yīng)用檢測(cè)樣品中特異性蛋白質(zhì)是否存在例：李桂波.利用免疫印跡法釣取PC3M細(xì)胞中與人前列腺癌高轉(zhuǎn)移相關(guān)特異性短肽結(jié)合蛋白的研究[D].吉林:吉林大學(xué),2007.對(duì)特異性蛋白質(zhì)進(jìn)行半定量分析例：651.2蛋白免疫印跡的應(yīng)用檢測(cè)樣品中特異性蛋白質(zhì)是否存在61.3WB的原理WB采用的是聚丙烯酰氨凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。通過(guò)特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過(guò)的蛋白質(zhì)進(jìn)行著色。通過(guò)分析著色的位置和著色的深度獲得特定的蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況的信息。661.3WB的原理WB采用的是聚丙烯酰氨凝膠電泳，被檢測(cè)物是1.4WB的特點(diǎn)WB是在蛋白質(zhì)電泳分離和抗原、抗體檢測(cè)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的檢測(cè)蛋白質(zhì)的技術(shù)SDS凝膠電泳：高分辨率抗原抗體反應(yīng)：特異性轉(zhuǎn)膜：靈敏度671.4WB的特點(diǎn)WB是在蛋白質(zhì)電泳分離和抗原、抗體檢測(cè)基礎(chǔ)目錄681.試劑2.耗材3.設(shè)備

WB的基礎(chǔ)一

實(shí)驗(yàn)步驟與結(jié)果分析三實(shí)驗(yàn)室常見問(wèn)題解答四試劑與設(shè)備二目錄91.試劑WB的基礎(chǔ)一2.1試劑甲叉雙丙烯酰胺TrisHCLSDS692.1試劑甲叉雙丙烯酰胺TrisHCLSDS10丙烯酰胺過(guò)硫酸銨TEMED2.1試劑70丙烯酰胺過(guò)硫酸銨TEMED2.1試劑11RIPA裂解液SDSloadingBuffer封閉液ECL顯影液2.1試劑71RIPA裂解液SDSloadingBuffer2.1試劑配置聚丙烯酰胺儲(chǔ)存液：29g丙稀酰胺、1gN,N-亞甲叉雙丙稀酰胺、加H2O至100mL。注意事項(xiàng):應(yīng)以溫?zé)岬娜ルx子水配制儲(chǔ)于棕色瓶，4℃避光保存。嚴(yán)格核實(shí)pH不得超過(guò)7.0，因光催化或堿催化可以發(fā)生脫氨基反應(yīng)。使用期不得超過(guò)兩個(gè)月，隔幾個(gè)月須重新配制。如有沉淀，可以過(guò)濾。722.1試劑配置聚丙烯酰胺儲(chǔ)存液：132.1試劑配置分離膠緩沖液(1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8)):18.15gTris和48mL1mol/LHCL混合加水稀釋到100mL終體積。濃縮膠緩沖液(0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mLH2O中，用約48mL1mol/LHCL調(diào)至pH6.8加水稀釋到100mL終體積。注意事項(xiàng):過(guò)濾后4℃保存。這兩種緩沖液必須使用Tris堿制備，再用HCL調(diào)節(jié)pH值，而不用Tris-HCL。轉(zhuǎn)移緩沖液：

2.9g甘氨酸、5.8gTris堿、0.37gSDS，并加入200mL甲醇，加水至總量1L。732.1試劑配置分離膠緩沖液(1.5mmol/LTris-H2.1試劑配置SDS蛋白上樣緩沖液:pH6.8的0.5mol/LTris緩沖液8mL，甘油6.4mL，10%SDS12.8mL，巰基乙醇3.2mL，0.05%溴酚藍(lán)1.6mL，H2O32mL混勻備用。按1:1或1:2比例與蛋白質(zhì)樣品混合，沸水煮3min，混勻后再上樣，一般為20-25μL，總蛋白量100μg。Tris緩沖鹽溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LNaCl。Tris-甘氨酸電泳緩沖液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸餾水溶解至1000mL，臨用前稀釋10倍。742.1試劑配置SDS蛋白上樣緩沖液:152.2耗材移液槍/槍頭濾紙藍(lán)蓋玻璃瓶量筒容量瓶離心管燒杯96孔板PVDF膜海綿墊752.2耗材移液槍/槍頭離心管162.3設(shè)備垂直電泳儀化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)臺(tái)式離心機(jī)762.3設(shè)備垂直電泳儀化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)臺(tái)式離心機(jī)172.3設(shè)備高壓滅菌鍋電子天平電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱772.3設(shè)備高壓滅菌鍋電子天平電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱182.3設(shè)備磁力攪拌器4℃、-20℃冰箱782.3設(shè)備磁力攪拌器4℃、-20℃冰箱19目錄791.實(shí)驗(yàn)步驟2.結(jié)果分析3.注意事項(xiàng)

WB的基礎(chǔ)一

實(shí)驗(yàn)步驟與結(jié)果分析三實(shí)驗(yàn)室常見問(wèn)題解答四試劑與設(shè)備二目錄201.實(shí)驗(yàn)步驟WB的基礎(chǔ)一3.1實(shí)驗(yàn)步驟蛋白樣品制備蛋白含量測(cè)定803.1實(shí)驗(yàn)步驟蛋白樣品制備蛋白含量測(cè)定213.1.1蛋白樣品制備在六孔板中，按照一個(gè)孔添加150μL的比例添加適量RIPA裂解液，用槍吹打均勻以充分接觸細(xì)胞。樣品放置冰上30min（中間混勻5-6次）直至裂解完全。充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作81裂解液用量說(shuō)明：通常6孔板每孔細(xì)胞加入150μL裂解液，若細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液用量至200μL或250μL。3.1.1蛋白樣品制備在六孔板中，按照一個(gè)孔添加150μLa).配制BCA工作液：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，按50體積試劑A,1體積試劑B配制適量BCA工作液，充分混勻。b).將標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品和工作液按下表加入到96孔板中，混勻。82管號(hào)試劑(μL)空白管標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定管×21×32×33x34×35×36×3蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液(1mg/mL)01246810—蒸餾水(μL)10986420—待測(cè)樣(μL)———————10BCA工作液(μL)2002002002002002002002003.1.2蛋白含量測(cè)定a).配制BCA工作液：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，按50體積試劑3.1.2蛋白含量測(cè)定c).混勻后，在37℃烘箱中溫浴30min，冷卻至室溫。d).酶標(biāo)儀562nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。e).以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。f).用測(cè)定孔平均光吸收值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量。833.1.2蛋白含量測(cè)定c).混勻后，在37℃烘箱中溫浴303.1.3聚丙烯酰氨凝膠電泳所帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，從而消除了不同分子之間原有的電荷差異。84上樣緩沖液的作用SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)在強(qiáng)還原劑（β-巰基乙醇）作用下，使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂蛋白質(zhì)(SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物)-3.1.3聚丙烯酰氨凝膠電泳所帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分3.1.3聚丙烯酰氨凝膠電泳PAGE膠的聚合原理：甲叉雙丙烯酰胺和丙烯酰胺在過(guò)硫酸銨的作用下聚合，形成膠。分子篩效應(yīng)853.1.3聚丙烯酰氨凝膠電泳PAGE膠的聚合原理：甲叉雙丙清洗玻璃板配膠上樣電泳停止電泳86玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊，然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠配分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。待膠面升到玻璃板3/4位置時(shí)即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。（加水液封時(shí)要很慢，否則膠會(huì)被沖變型。）當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說(shuō)明膠已凝了。倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。配濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其撥出。（插梳子時(shí)要使梳子保持水平。）用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。（小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外。）3.1.3聚丙烯酰氨凝膠電泳清洗玻璃板配膠上樣電泳停止電泳27玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊，清洗玻璃板配膠上樣電泳停止電泳87測(cè)完蛋白含量后，計(jì)算含50mg蛋白的溶液體積即為上樣量。適量蛋白加入4：15*LoadingBuffer于離心管，100℃水中煮5min使蛋白變性。放置冰上3min，離心15min，13000rpm，4℃。加足夠的1*電泳緩沖液后開始準(zhǔn)備上樣。（電泳液至少要漫過(guò)內(nèi)測(cè)的小玻璃板。）用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。）3.1.3聚丙烯酰氨凝膠電泳清洗玻璃板配膠上樣電泳停止電泳28測(cè)完蛋白含量后，計(jì)算含50清洗玻璃板配膠上樣電泳停止電泳濃縮膠80V電壓跑20分鐘，可多跑幾分鐘；分離膠180V電壓跑至底端。純水沖洗玻璃板，取膠，清洗切去濃縮膠，在Marker下方切角做標(biāo)記，將膠泡在清水中。883.1.3聚丙烯酰氨凝膠電泳清洗玻璃板配膠上樣電泳停止電泳濃縮膠80V電壓跑20分鐘，可3.1.3聚丙烯酰氨凝膠電泳89清洗玻璃板配膠上樣電泳停止電泳3.1.3聚丙烯酰氨凝膠電泳30清洗玻璃板配膠上樣電泳停止3.1.4轉(zhuǎn)膜剪PVDF膜，并提前切個(gè)角，甲醇中泡約30秒，在放入蒸餾水中2min。將膜、海綿、濾紙一起泡入1*轉(zhuǎn)膜液中，平衡至少5min。（轉(zhuǎn)膜液可回收）打開電轉(zhuǎn)印夾，在黑色面一次放入海綿墊、三層濾紙、凝膠、PVDF膜、三層濾紙、海綿墊90轉(zhuǎn)膜條件：45V，1.5h3.1.4轉(zhuǎn)膜剪PVDF膜，并提前切個(gè)角，甲醇中泡約30秒3.1.5封閉用1×TBS漂洗一次。加入封閉緩沖液,置于振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行封閉(26℃,80rpm/min,2-4h)。913.1.5封閉用1×TBS漂洗一次。加入封閉緩沖液,置于振3.1.6一抗雜交棄封閉液，加入用Western一抗稀釋液稀釋的一抗雜交溶液,置于4℃雜交過(guò)夜或在振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行雜交(26℃,80rpm/min,1h)923.1.6一抗雜交棄封閉液，加入用Western一抗稀釋液3.1.7二抗雜交回收一抗雜交液，用TBST洗膜3次(置于振蕩培養(yǎng)箱中,26℃,80rpm/min,10min/每次)棄TBST，加入用封閉緩沖液稀釋的二抗雜交溶液,置于振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行雜交(26℃,80rpm/min,1h);933.1.7二抗雜交回收一抗雜交液，用TBST洗膜3次(置于WB顯色的分類放射自顯影底物化學(xué)發(fā)光ECL底物熒光ECF底物呈色DAB94WB顯色的分類放射自顯影底物化學(xué)發(fā)光ECL底物熒光ECF底物放射自顯影原理：利用放射性核素發(fā)射的射線，使感光材料中的鹵化銀等感光，顯出影像后進(jìn)行放射性標(biāo)記物的定位和定量測(cè)量的技術(shù)。特點(diǎn)：靈敏度高、分辨率好、保存時(shí)間長(zhǎng)久，但由于實(shí)驗(yàn)所用方式性物質(zhì)對(duì)人體有輻射作用。應(yīng)用：多用于研究標(biāo)記化合物在機(jī)體、組織和細(xì)胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機(jī)理、作用部位等等。放射自顯影原理：利用放射性核素發(fā)射的射線，使感光材料中的鹵化底物化學(xué)發(fā)光ECL原理:化學(xué)發(fā)光是在一些特殊的化學(xué)反應(yīng)中吸收了反應(yīng)釋放的化學(xué)能,而處于電子激發(fā)態(tài)的反應(yīng)中間體或反應(yīng)產(chǎn)物由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)所產(chǎn)生的一種光輻射,化學(xué)發(fā)光分析是根據(jù)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物的光輻射(化學(xué)發(fā)光)確定物質(zhì)含量的一種痕量分析方法。特點(diǎn):靈敏度高和線性范圍寬，不需要任何光源。底物化學(xué)發(fā)光ECL原理:化學(xué)發(fā)光是在一些特殊的化學(xué)反應(yīng)中吸收底物熒光ECF原理：是利用的熒光染料（如Cy2,Cy3,Cy5）標(biāo)記二抗，標(biāo)記熒光染料的二抗分別對(duì)應(yīng)相應(yīng)的目的蛋白，以此實(shí)現(xiàn)通過(guò)檢測(cè)熒光染料的信號(hào)強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)種蛋白信號(hào)的檢測(cè)，以進(jìn)行精確的定量分析。熒光檢測(cè)WesternBlot本來(lái)不是檢測(cè)的主流方法，不過(guò)熒光法檢測(cè)允許在同一張轉(zhuǎn)印膜上用不同顏色的熒光底物同時(shí)檢測(cè)不同的目標(biāo)。底物熒光ECF原理：是利用的熒光染料（如Cy2,Cy3,底物DAB呈色原理：二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine,DAB）是辣根過(guò)氧化物酶最敏感、最常用的顯色底物，反應(yīng)產(chǎn)物因不溶于水、二甲苯和醇的棕色沉淀物而被廣泛地用于蛋白印跡（WesternBlot,WB)、免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry,IHC)和免疫細(xì)胞化學(xué)(Immunocytochemistry,ICC)、斑點(diǎn)印跡(Dotblot)和生物芯片(Biochip)等的染色和顯色反應(yīng)。用之進(jìn)行對(duì)底物顯色即被稱為底物DAB呈色法。此技術(shù)成本低，操作也較簡(jiǎn)單是常用的westernblot成像分析技術(shù)之一，不過(guò)由于其靈敏度稍低，在目的蛋白表達(dá)量較少的情況下可能沒有理想的結(jié)果應(yīng)慎用。底物DAB呈色原理：二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzid3.1.8顯影檢測(cè)棄二抗溶液，用TBST洗膜3次（置于振蕩培養(yǎng)箱中，26℃，80rpm/min,10min/每次）；ECL工作液的配制：等體積混合Detectionreagent1和Detectionreagent2，現(xiàn)配現(xiàn)用。根據(jù)膜的大小，按每10平方厘米膜加1mLECL工作液，滴加ECL工作液工作液到膜上，確保使工作液均勻覆蓋在膜上，放置1分鐘。

利用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)采集圖像和進(jìn)行圖像分析。993.1.8顯影檢測(cè)棄二抗溶液，用TBST洗膜3次（置于振蕩3.2結(jié)果分析1003.2結(jié)果分析413.3注意事項(xiàng)101電泳結(jié)束后，應(yīng)及時(shí)用清洗干凈玻璃板，清洗時(shí)應(yīng)使用海綿擦布，切勿使用刷子，以免刮花玻璃板；并及時(shí)沖洗電泳槽，以免鹽離子沉積，導(dǎo)致電泳絲腐蝕；注意海綿墊，濾紙（轉(zhuǎn)膜專用濾紙），轉(zhuǎn)印膜，膠的疊放位置，以保證正確的轉(zhuǎn)印方向；注意海綿墊，濾紙（轉(zhuǎn)膜專用濾紙），轉(zhuǎn)印膜，膠的相對(duì)大小，以免造成短路；轉(zhuǎn)印結(jié)束后，應(yīng)及時(shí)取出轉(zhuǎn)印膜，并立即用TBST漂洗1-2遍，并立即加入封閉液，這樣可以避免膜上的雜質(zhì)殘留或膜變干導(dǎo)致背景高的問(wèn)題；3.3注意事項(xiàng)42電泳結(jié)束后，應(yīng)及時(shí)用清洗干凈玻璃板，清洗

WB的基礎(chǔ)一目錄102

實(shí)驗(yàn)步驟與結(jié)果分析三實(shí)驗(yàn)室常見問(wèn)題解答四試劑與設(shè)備二WB的基礎(chǔ)一目錄43常見問(wèn)題解答沒信號(hào)膜一片空白，沒有任何條帶，陽(yáng)性對(duì)照樣品也無(wú)條帶：實(shí)驗(yàn)失??？抗體失效？重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，重新稀釋抗體；膜一片空白，沒有任何條帶，陽(yáng)性對(duì)照樣品有條帶：實(shí)驗(yàn)樣品降解？實(shí)驗(yàn)樣品無(wú)該蛋白的表達(dá)？轉(zhuǎn)膜效率過(guò)低？重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，復(fù)核查找上述原因，以尋找對(duì)策。背景過(guò)高目的條帶以外的區(qū)域有信號(hào)，如果是片狀，甚至整塊膜，一般是封閉不好，膜變干，一抗非特異雜交或二抗的非特異雜交導(dǎo)致；如果是條紋狀，一般是由于膜上有壓痕導(dǎo)致，如果是點(diǎn)狀，一般是膜上有雜質(zhì)，或泡膜時(shí)膜沒有充分浸泡；轉(zhuǎn)膜效率過(guò)低。103常見問(wèn)題解答沒信號(hào)膜一片空白，沒有任何條帶，陽(yáng)性對(duì)照樣品也無(wú)常見問(wèn)題解答一抗效價(jià)低：提高一抗稀釋比例，提高雜交時(shí)間，減少洗膜次數(shù)，提高曝光時(shí)間，提高上樣量；轉(zhuǎn)膜效率低：檢測(cè)轉(zhuǎn)膜試劑和耗材，優(yōu)化轉(zhuǎn)膜條件；在目的帶以外的信號(hào)條帶為雜帶，一般由于一抗的特異性不好所導(dǎo)致，如果目的帶比雜帶信號(hào)強(qiáng)，可通過(guò)減低一抗的稀釋比例，并縮短雜交時(shí)間解決；如果目的帶比雜帶信號(hào)弱，在不減低一抗的稀釋比例的前提下，縮短雜交時(shí)間；并提高TBST緩沖液的NaCl的濃度提高到500nM；雜帶如果與目的帶的位置相距較遠(yuǎn)，可以不優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，直接裁剪即可，雜帶如果與目的帶的位置相距較進(jìn)，應(yīng)調(diào)整膠濃度，并延長(zhǎng)電泳時(shí)間。有雜帶目的帶弱104常見問(wèn)題解答一抗效價(jià)低：提高一抗稀釋比例，提高雜交時(shí)間，減少兩塊玻璃板之間灌膠,膠為什么總是不平?

105玻璃未洗凈過(guò)硫酸銨和TEMED加量過(guò)多可導(dǎo)致膠凝固過(guò)快而使膠不平加入試劑后未搖勻，導(dǎo)致局部聚合劑濃度過(guò)高，聚合較快而使膠不平加入不均勻，應(yīng)注意手法灌膠后應(yīng)進(jìn)行壓膠(可用水或正丁醇)溫度會(huì)影響膠聚合，若受熱不均勻，也會(huì)影響膠聚合不均勻。兩塊玻璃板之間灌膠,膠為什么總是不平?

46玻璃未洗凈過(guò)硫酸為什么會(huì)有“微笑”和“倒微笑”這樣的效果呢？

106微笑"是因?yàn)楣嗄z的時(shí)候冷卻不均勻，中間部分冷卻不好，導(dǎo)致凝膠中的分子有不同的遷移率所致。這種情況在較厚的凝膠以及垂直電泳時(shí)常常發(fā)生。“倒微笑“也稱“皺眉”現(xiàn)象常常是由于垂直電泳時(shí)電泳槽的裝置不合適引起的，特別是當(dāng)凝膠和玻璃板組成的三明治底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不完全便會(huì)產(chǎn)生這種現(xiàn)象

；中間部分和兩端受熱不一樣而致成了“倒微笑”可能是因?yàn)閮啥说哪z凝的不好，加APS和TEMED后應(yīng)該混合均勻。為什么會(huì)有“微笑”和“倒微笑”這樣的效果呢？

47Western-blot

制膠時(shí)好多泡泡怎么辦？107玻璃板需用洗潔精洗后再用雙蒸水沖洗，晾干配膠時(shí)應(yīng)沿管壁緩緩加入各成分，用手輕輕搖勻；若用槍頭吹打需緩慢且不要打到頭倒膠時(shí)，用槍沿一側(cè)緩緩加入，不要打到底，以免帶入氣泡封膠時(shí)，可用200μL槍加水，減小壓力，以免把膠沖起室溫制膠時(shí)，由于溫差及凝膠聚合反應(yīng)放熱可產(chǎn)生氣泡分離膠凝好后，倒掉里面的水，用吸水紙吸干，再加濃縮膠，迅速插梳子Western-blot

制膠時(shí)好多泡泡怎么辦？48玻璃板需問(wèn)答時(shí)間108問(wèn)答時(shí)間49WB標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)-試劑耗材與設(shè)備試劑：SDSRIPA裂解液丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺TEMEDECL顯影液封閉液TrisHCL過(guò)硫酸銨SDSloadingBuffer109耗材：離心管燒杯96孔板PVDF膜海綿墊移液槍/槍頭濾紙藍(lán)蓋玻璃瓶量筒容量瓶設(shè)備：臺(tái)式離心機(jī)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)垂直電泳儀電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱電子天平高壓滅菌鍋磁力攪拌器4℃、-20℃冰箱WB標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)-試劑耗材與設(shè)備試劑：50耗材：設(shè)備：WB標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)-試劑配置聚丙烯酰胺儲(chǔ)存液：29g丙稀酰胺、1gN,N-亞甲叉雙丙稀酰胺、加H2O至100ml。分離膠緩沖液(1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8)):18.15gTris和48mL1mol/LHCL混合加水稀釋到100mL終體積。濃縮膠緩沖液(0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mLH2O中，用約48mL1mol/LHCL調(diào)至pH6.8加水稀釋到100mL終體積。轉(zhuǎn)移緩沖液：

2.9g甘氨酸、5.8gTris堿、0.37gSDS，并加入200mL甲醇，加水至總量1L。110WB標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)-試劑配置聚丙烯酰胺儲(chǔ)存液：51SDS蛋白上樣緩沖液:pH6.8的0.5mol/LTris緩沖液8mL，甘油6.4mL，10%SDS12.8mL，巰基乙醇3.2mL，0.05%溴酚藍(lán)1.6mL，H2O32mL混勻備用。按1:1或1:2比例與蛋白質(zhì)樣品混合，沸水煮3min，混勻后再上樣，一般為20-25μL，總蛋白量100μg。Tris緩沖鹽溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LNaCl。10xTris-甘氨酸電泳緩沖液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸餾水溶解至1000mL。

臨用前稀釋10倍。111WB標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)-試劑配置SDS蛋白上樣緩沖液:52WB標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)-試劑配置WB標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程在六孔板中，按照一個(gè)孔添加150μL的比例添加適量