甲霜靈膠體金競(jìng)爭(zhēng)法試紙課件

甲霜靈膠體金競(jìng)爭(zhēng)法試紙條的研制

北京萬(wàn)華生物工程有限公司

2019.12.8

甲霜靈膠體金競(jìng)爭(zhēng)法試紙條的研制1一、前言農(nóng)藥甲霜靈簡(jiǎn)介最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法的建立分課題進(jìn)展情況簡(jiǎn)單匯報(bào)一、前言21.農(nóng)藥甲霜靈簡(jiǎn)介農(nóng)藥甲霜靈（metalaxyl），又名阿普隆、雷多米爾、瑞毒霉、甲霜安，化學(xué)名稱D，L-N-（2，6-二甲基苯基）-N-（2‘-甲氧基乙基）氨基丙酸甲酯，屬酰苯胺類殺菌劑。

據(jù)中國(guó)農(nóng)藥毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，屬低毒殺菌劑。

對(duì)卵菌引起的病害具有獨(dú)特的保護(hù)和治療作用。1.農(nóng)藥甲霜靈簡(jiǎn)介農(nóng)藥甲霜靈（metalaxyl），又名阿普32.最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)合國(guó)FAO/WHO食品法委員會(huì)（CCPR）《關(guān)于食品和飼料中農(nóng)藥最高殘留限量的規(guī)定》中規(guī)定每日允許攝入量（ADI）為0.03mg/kg體重，禾谷類植物最高允許殘留量為0.05×10-6。中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部和中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)于2019年1月25日發(fā)布，自2019年10月1日起實(shí)施中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)（GB2763-2019），該標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了農(nóng)藥甲霜靈在食品中的最大允許殘留量。

2.最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)合國(guó)FAO/WHO食品法委員會(huì)（CCP4中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)甲霜靈在食品中最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)種類

最高殘留限量（MRL），≤，mg/kg國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)號(hào)

谷子0.05GB2763-2019黃瓜0.5GB2763-2019葡萄1GB2763-2019中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)甲霜靈在食品中最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)種類最53.檢測(cè)方法建立甲霜靈不穩(wěn)定，傳統(tǒng)的氣相色譜法檢測(cè)困難。Krause在原有檢測(cè)基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，將高效液相色譜法（HPLC）應(yīng)用于食物樣本檢測(cè)中，此方法普遍用于檢測(cè)氨基甲酸酯類殺蟲(chóng)劑。雖然HPLC法具有更高的靈敏度，可以精確地對(duì)樣品中的農(nóng)藥進(jìn)行定性和定量分析，但此法要求精密復(fù)雜的儀器，而且需要專業(yè)人員操作，不適合于大批量樣品的檢測(cè)。

3.檢測(cè)方法建立甲霜靈不穩(wěn)定，傳統(tǒng)的氣相色譜法檢測(cè)困難。Kr6膠體金免疫層析診斷技術(shù)是在單克隆抗體技術(shù)、免疫層析技術(shù)及膠體金顯色技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新型體外診斷技術(shù)，具有快速、靈敏、操作簡(jiǎn)便、成本低、無(wú)需專業(yè)人員操作等特點(diǎn)，真正達(dá)到復(fù)雜原理與簡(jiǎn)易操作的統(tǒng)一；同時(shí)具有保存方便，有效期長(zhǎng)等特點(diǎn)。

與氣相色譜法補(bǔ)充使用，具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)迅速等特點(diǎn)。膠體金免疫層析診斷技術(shù)是在單克隆抗體技術(shù)、免疫層析技術(shù)及膠體7主要技術(shù)路線主要技術(shù)路線84.分課題情況簡(jiǎn)單匯報(bào)擬解決的關(guān)鍵技術(shù)：小分子免疫原的合成、與小分子免疫原抗原決定簇配對(duì)單克隆抗體的制備及膠體金研究。

4.分課題情況簡(jiǎn)單匯報(bào)擬解決的關(guān)鍵技術(shù)：9課題完成情況及效果：本課題已成功研制出合成免疫原N2B，進(jìn)行免疫獲得單克隆抗體N2B14E6C10,這一針對(duì)甲霜靈抗原決定簇配對(duì)的單克隆抗體，親和力好，效價(jià)達(dá)到10-9，并成功制成甲霜靈膠體金檢測(cè)試紙，應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)法膠體金檢測(cè)試紙最低檢出量可達(dá)0.3mg/kg，達(dá)到國(guó)標(biāo)要求。通過(guò)比對(duì)試驗(yàn)的驗(yàn)證，相關(guān)系數(shù)r=0.99996，說(shuō)明方法的可靠性。因此，可以肯定膠體金免疫法在農(nóng)藥、獸藥殘留限量快速檢測(cè)技術(shù)中，是最有效、最快速、最簡(jiǎn)便的方法。其優(yōu)點(diǎn)在于靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、快速、常溫儲(chǔ)存等，是適合于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的一種快速檢測(cè)方法，是食品安全檢測(cè)的一種手段，互補(bǔ)現(xiàn)有檢測(cè)方法各自的優(yōu)缺點(diǎn)。

課題完成情況及效果：10二、試驗(yàn)研究?jī)?nèi)容免疫原合成抗體制備膠體金研究半成品研制及鑒定成品研制二、試驗(yàn)研究?jī)?nèi)容免疫原合成111.免疫原合成半抗原合成免疫原合成免疫原的鑒定小結(jié)1.免疫原合成12（1）半抗原合成將1.6gNaOH溶于200mL蒸餾水中，并加入10.056g甲霜靈，油浴50℃下攪拌6h，用TLC檢測(cè)，反應(yīng)完全；用乙酸乙酯洗滌反應(yīng)液，棄去酯相；水層用濃鹽酸調(diào)pH值至1.0左右，析出白色物質(zhì)；用乙酸乙酯再次萃取混合液，酯相用無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)夜；抽濾酯相，旋轉(zhuǎn)蒸除溶劑，得到白色固體物質(zhì)；用正己烷和乙酸乙酯重結(jié)晶，抽濾后得到半抗原N2（甲霜靈酸）。（1）半抗原合成將1.6gNaOH溶于200mL蒸餾水中，13（2）免疫原合成稱取0.265g甲霜靈酸，用8mLDMF溶解，加入0.258gDCC和0.125gNHS；用TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全程度，待反應(yīng)完全后，抽濾反應(yīng)液，用DMF洗滌兩遍；稱取2gBSA，用200mL0.2mol/LpH值8.7的硼酸鹽緩沖液溶解；將DMF溶液滴入到上述BSA溶液中，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，得到甲霜靈免疫原N2B。

先用蒸餾水透析2天，再用生理鹽水透析3天，每天換液2次；透析后的溶液于3000r/min離心15min，取上清液于-20℃下冷凍干燥，凍干后分裝保存。同法可將甲霜靈酸連接到雞卵清蛋白OVA上，合成檢測(cè)原（N2A）。

（2）免疫原合成稱取0.265g甲霜靈酸，用8mLDMF溶14（3）免疫原的鑒定紫外掃描從紫外掃描圖譜可以看出：N2B在274.5nm出現(xiàn)最大吸收峰，峰值為0.209ABS；BSA在278.0nm出現(xiàn)最大吸收峰，峰值為0.083ABS。甲霜靈人工合成免疫原N2B在280nm左右的紫外吸收峰明顯高于BSA在280nm的紫外吸收峰，所以通過(guò)紫外掃描可以證明，甲霜靈半抗原成功的連接到了載體蛋白BSA上。（3）免疫原的鑒定紫外掃描從紫外掃描圖譜可以看出：N2B在215瓊脂糖雙擴(kuò)散法鑒定DADT結(jié)果顯示，抗血清與免疫原（N2B）、BSA、檢測(cè)原（N2A）均出現(xiàn)反應(yīng)沉淀線，而與OVA、甲霜靈未產(chǎn)生可見(jiàn)的沉淀線。這說(shuō)明抗血清中含有甲霜靈抗體和BSA抗體，不與OVA交叉反應(yīng)，雖然與甲霜靈發(fā)生交叉反應(yīng)（理論上推測(cè)），但不形成可見(jiàn)的沉淀線。DADT檢測(cè)結(jié)果表明，N2B合成成功，即N2與BSA間通過(guò)化學(xué)鍵結(jié)合。瓊脂糖雙擴(kuò)散法鑒定DADT結(jié)果顯示，抗血清與免疫原（N2B）16（4）小結(jié)本試驗(yàn)通過(guò)化學(xué)合成法進(jìn)行甲霜靈免疫原的制備，利用甲霜靈酸結(jié)構(gòu)中的羧基，在適當(dāng)?shù)呐悸?lián)劑作用下將其連接到載體蛋白（-BSA）上，制成免疫原。通過(guò)紫外檢測(cè)法、動(dòng)物免疫試驗(yàn)對(duì)甲霜靈免疫原進(jìn)行鑒定，證實(shí)免疫原合成成功。

（4）小結(jié)172.抗體制備單克隆抗體制備多克隆抗體制備2.抗體制備18（1）單克隆抗體制備單克隆抗體制備流程單克隆抗體特性鑒定小結(jié)（1）單克隆抗體制備19單克隆抗體制備流程單克隆抗體制備流程20用合成的免疫原N2B免疫BALB/C小鼠，在無(wú)菌條件下取免疫小鼠脾細(xì)胞與Sp2/0細(xì)胞融合，共融合6次，每次1只。用ELISA間接法從產(chǎn)生的267株陽(yáng)性雜交瘤中，篩選出對(duì)甲霜靈抗原呈陽(yáng)性反應(yīng)的雜交瘤11株，注射小鼠185只，制備腹水419mL，純化得到275.8mg抗體。結(jié)果表明：我們成功獲得了能識(shí)別甲霜靈抗原決定簇的雜交瘤細(xì)胞株：N2B14E6C10。用合成的免疫原N2B免疫BALB/C小鼠，在無(wú)菌條件下取免疫21單克隆抗體鑒定①抗體的純度鑒定

從圖中可以看出N2B14E6C10在電泳中呈現(xiàn)1條帶，純度大于95%，同時(shí)這株抗體分子量與97.4KD蛋白標(biāo)準(zhǔn)品相近。

單克隆抗體鑒定①抗體的純度鑒定從圖中可以看出N2B1422②間接ELISA法檢測(cè)抗體活性

從左圖可以看出，當(dāng)抗原濃度為0.32ng/mL時(shí)，OD450是1.681，大于0.5，因此活性合格。②間接ELISA法檢測(cè)抗體活性從左圖可以看出，當(dāng)抗原濃度為23③間接ELISA法抗體特異性檢測(cè)

由左圖可以看出甲霜靈單抗只針對(duì)甲霜靈抗原特異，與其它無(wú)關(guān)抗原不發(fā)生反應(yīng)，具有較好的特異性。

③間接ELISA法抗體特異性檢測(cè)由左圖可以看出甲霜靈單抗只24④抗體親和力的鑒定

④抗體親和力的鑒定25單抗測(cè)得三個(gè)Kaff值（M-1）Kaff值（M-1）均值±標(biāo)準(zhǔn)差變異系數(shù)（%）N2B14E6C107.41×109（6.72±0.507）×1097.50%6.20×1096.56×109N2B14E6C10抗體親和力表

測(cè)得三個(gè)Kaff值N2B14E6C107.41×109（26用甲霜靈抗原包被直接篩選，結(jié)果顯示：N2B14E6C10能識(shí)別甲霜靈抗原決定簇；經(jīng)ProteinA柱直接純化，亞類為IgG1的這株抗體純度達(dá)到95%以上；抗體親和力常數(shù)（6.72±0.507）×109，可以滿足用于制備檢測(cè)試紙的檢測(cè)線。

小結(jié)小結(jié)27（2）多克隆抗體制備基本制備過(guò)程多克隆抗體活性鑒定小結(jié)（2）多克隆抗體制備28過(guò)程：動(dòng)物免疫多克隆抗體純化多抗活性鑒定過(guò)程：動(dòng)物免疫多克隆抗體純化多抗活性鑒定29500μg1000μg31.25μggg31.25μggggggg1000μg500μg62.5μg125μg250μg62.5μg125μg250μg0.5mg/mL1mg/mL從左圖可以看出，此羊抗屬I(mǎi)gG抗體稀釋濃度在31.25μg/mL時(shí)清晰可見(jiàn)沉淀線，判定此抗體活性合格。

多克隆抗體活性鑒定500μg1000μg31.25μg31.25μg1000μ30羊抗鼠多克隆抗體，經(jīng)活性鑒定合格，可以滿足用于制備檢測(cè)試紙的控制線。小結(jié)小結(jié)313.膠體金研究經(jīng)過(guò)電鏡結(jié)果分析（同甲萘威），我們可以得出：膠體金顆粒直徑在20～30nm之間時(shí)，顆粒大小均勻、無(wú)聚合與沉淀現(xiàn)象，且靈敏度高，為最佳狀態(tài)。此時(shí)與抗體的結(jié)合量為6～12mg，氯金酸與檸檬酸三鈉溶液的配比為30mL/18～20mL。3.膠體金研究經(jīng)過(guò)電鏡結(jié)果分析（同甲萘威），我們可以得出：膠324.半成品研制及鑒定原理膠體金檢測(cè)試紙條的制作工藝流程半成品調(diào)試半成品鑒定小結(jié)4.半成品研制及鑒定原理33在硝酸纖維素膜上的檢測(cè)區(qū)包被甲霜靈合成免疫原，對(duì)照區(qū)包被羊抗鼠多克隆抗體。當(dāng)待測(cè)物中有被測(cè)的抗原物質(zhì)（即甲霜靈）時(shí)，待測(cè)物中的抗原物質(zhì)就會(huì)與標(biāo)記膠體金的甲霜靈單克隆抗體形成Ag-Ab-Au復(fù)合物，復(fù)合物不與包被在硝酸纖維素膜上的甲霜靈合成免疫原結(jié)合，僅會(huì)在控制線處出現(xiàn)一條色帶（C線），結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明被檢測(cè)的樣品中農(nóng)藥甲霜靈超標(biāo)。當(dāng)待測(cè)物質(zhì)中沒(méi)有被測(cè)的抗原物質(zhì)時(shí)，標(biāo)記膠體金的甲霜靈單克隆抗體就會(huì)與包被在硝酸纖維素膜上的甲霜靈合成免疫原結(jié)合，形成Ag-Ab-Au復(fù)合物，此時(shí)檢測(cè)線處可看到一條明顯色帶（T線），因此當(dāng)檢測(cè)試紙上可看到兩條線（C線和T線）時(shí)，結(jié)果為陰性，說(shuō)明被檢測(cè)的樣品中農(nóng)藥甲霜靈未超標(biāo)。原理在硝酸纖維素膜上的檢測(cè)區(qū)包被甲霜靈合成免疫原，對(duì)照區(qū)包被羊抗34膠體金檢測(cè)試紙條制作工藝流程膠體金檢測(cè)試紙條制作工藝流程35調(diào)試日期數(shù)量測(cè)試結(jié)果結(jié)果分析解決方法備注水標(biāo)準(zhǔn)品05.4.108條陰性無(wú)梯度，檢測(cè)1mg/mL和檢測(cè)水的顏色一樣。1.膠體金的濃度高2.膜的濃度高1.降低金的濃度2.降低膜的濃度檢測(cè)不同濃度的小樣8個(gè)05.4.118條陰性檢測(cè)限100μg/mL，敏感度低。1.膠體金的濃度高2.膜的濃度高1.降低金的濃度2.降低膜的濃度檢測(cè)不同濃度的小樣8個(gè)05.4.128條陰性檢測(cè)限1μg/mL，敏感度低。1.膠體金的濃度高2.膜的濃度高1.降低金的濃度2.降低膜的濃度檢測(cè)不同濃度的小樣8個(gè)05.4.138條無(wú)反應(yīng)線

1.膠體金的濃度低2.膜的濃度低1.提高膠體金的濃度2.提高膜的濃度檢測(cè)不同濃度的小樣15個(gè)05.4.148條反應(yīng)線淺檢測(cè)限10ng/mL1.膠體金的濃度低2.膜的濃度低1.提高膠體金的濃度2.提高膜的濃度檢測(cè)不同濃度的小樣10個(gè)05.4.178條陰性檢測(cè)限500ng/mL，敏感度低膠體金濃度高降低膠體金的濃度檢測(cè)不同濃度的小樣4個(gè)05.4.198條陰性檢測(cè)限300ng/mL。結(jié)果符合要求，測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品有梯度。進(jìn)行敏感性，特異性和陽(yáng)性參考品檢測(cè)。生產(chǎn)試紙條進(jìn)行半成品的鑒定05.4.198條陰性檢測(cè)陽(yáng)性參考品達(dá)300ng/mL結(jié)果符合要求，測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品有梯度。進(jìn)行敏感性，特異性和陽(yáng)性參考品檢測(cè)。生產(chǎn)試紙條進(jìn)行半成品的鑒定05.4.198條陰性與其它農(nóng)藥均無(wú)交叉結(jié)果符合要求，測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品有梯度。進(jìn)行敏感性，特異性和陽(yáng)性參考品檢測(cè)。生產(chǎn)試紙條進(jìn)行半成品的鑒定甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條半成品靈敏度調(diào)試

05.4.108條陰性無(wú)梯度，檢測(cè)1mg/mL和檢測(cè)水的顏色36①

敏感性鑒定取甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條，依次浸入蒸餾水、濃度為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、1μg/mL、2μg/mL甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品中，5分鐘內(nèi)各試紙條均可見(jiàn)一條紅色的控制線，其中蒸餾水和濃度為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品在檢測(cè)區(qū)和控制區(qū)均可見(jiàn)一條色帶，為陰性；而濃度為300ng/mL、500ng/mL、1μg/mL、2μg/mL甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品僅在控制區(qū)出現(xiàn)一條色帶，為陽(yáng)性。

半成品鑒定①敏感性鑒定半成品鑒定37圖中試紙條從左到右依次是蒸餾水、濃度為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、1μg/mL、2μg/mL甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果分析：

甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條敏感度可達(dá)到300ng/mL；檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品有梯度變化，靈敏度高，批間差小，性能穩(wěn)定。

圖中試紙條從左到右依次是蒸餾水、濃度為10ng/mL、50n38②陽(yáng)性參考品符合率鑒定取甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條，依次浸入濃度為300ng/mL、500ng/mL、800ng/mL、1μg/mL甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品中，5分鐘內(nèi)各試紙條僅可見(jiàn)一條紅色的控制線，為陽(yáng)性。②陽(yáng)性參考品符合率鑒定39圖中試紙條從左到右依次是濃度為100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、800ng/mL、1μg/mL甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果。

結(jié)果分析：甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條性能穩(wěn)定，特異性好。

圖中試紙條從左到右依次是濃度為100ng/mL、300ng/40③特異性鑒定取甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條，依次浸入濃度均為100μg/mL的草甘磷、甲基立枯磷、敵百蟲(chóng)、林丹、綠麥隆、甲基對(duì)硫磷、禾草靈、乙草胺、甲草胺、甲胺磷、甲萘威、毒死蜱、百菌清、莠去津樣品中，5分鐘內(nèi)各試紙條在檢測(cè)區(qū)和控制區(qū)均可見(jiàn)一條色帶，為陰性。③特異性鑒定41圖中試紙條從左到右依次是濃度均為100μg/mL的草甘磷、甲基立枯磷、敵百蟲(chóng)、林丹、綠麥隆、甲基對(duì)硫磷、禾草靈、乙草胺、甲草胺、甲胺磷、、甲萘威、毒死蜱、百菌清、莠去津的檢測(cè)結(jié)果。

結(jié)果分析甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條與濃度均為100μg/mL的草甘磷、甲基立枯磷、敵百蟲(chóng)、林丹、綠麥隆、甲基對(duì)硫磷、禾草靈、乙草胺、甲草胺、甲胺磷、甲萘威、毒死蜱、百菌清、莠去津常用農(nóng)藥均無(wú)交叉反應(yīng)，特異性好。

圖中試紙條從左到右依次是濃度均為100μg/mL的草甘磷、甲42④精密度鑒定取甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條，依次浸入300ng/mL的甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品中，同批次、不同批次各平行檢測(cè)10條，5分鐘內(nèi)各試紙條均可見(jiàn)一條紅色的控制線，為陽(yáng)性。甲霜靈膠體金競(jìng)爭(zhēng)法試紙課件43每批試紙條是濃度為300ng/mL甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果。

結(jié)果分析：甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙性能穩(wěn)定；可重復(fù)性好。

每批試紙條是濃度為300ng/mL甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果。44⑤穩(wěn)定性鑒定膠體金檢測(cè)試紙條37℃放置20天穩(wěn)定性試驗(yàn)?zāi)z體金檢測(cè)試紙條4～30℃放置6個(gè)月穩(wěn)定性試驗(yàn)

⑤穩(wěn)定性鑒定45膠體金檢測(cè)試紙條37℃放置20天穩(wěn)定性試驗(yàn)取甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條保存在37℃放置20天，對(duì)產(chǎn)品每隔3天進(jìn)行敏感性、陽(yáng)性參考品符合率、特異性檢測(cè)。敏感性：取保存在37℃的甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條依次浸在蒸餾水、濃度為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、1μg/mL、2μg/mL甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品中進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，5分鐘內(nèi)各試紙條均可見(jiàn)一條紅色的控制線，其中蒸餾水和濃度為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品在檢測(cè)區(qū)和控制區(qū)均可見(jiàn)色帶，為陰性；而濃度為300ng/mL、500ng/mL、1μg/mL、2μg/mL甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品僅在控制區(qū)出現(xiàn)一條色帶，為陽(yáng)性。膠體金檢測(cè)試紙條37℃放置20天穩(wěn)定性試驗(yàn)取甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙4637℃條件下甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條敏感度檢測(cè)

日期（天）

批號(hào)0504240504280505100505170505250505283300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL6300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL9300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL12300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL15300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL18300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL21300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL3300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng47陽(yáng)性參考品符合率：取保存在37℃的甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條依次浸在濃度為300ng/mL、500ng/mL、800ng/mL、1μg/mL甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品中，進(jìn)行陽(yáng)性參考品符合率試驗(yàn)；5分鐘內(nèi)各試紙條僅可見(jiàn)一條紅色的控制線，為陽(yáng)性。

甲霜靈膠體金競(jìng)爭(zhēng)法試紙課件48日期（天）

批號(hào)0504240504280505100505170505250505283＋＋＋＋＋＋6＋＋＋＋＋＋9＋＋＋＋＋＋12＋＋＋＋＋＋15＋＋＋＋＋＋18＋＋＋＋＋＋21＋＋＋＋＋＋

37℃條件下甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條陽(yáng)性參考品檢測(cè)

37℃條件下甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條陽(yáng)性參考品檢測(cè)49特異性：取保存在37℃的甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條，依次浸入濃度均為100μg/mL的草甘磷、甲基立枯磷、敵百蟲(chóng)、林丹、綠麥隆、甲基對(duì)硫磷、禾草靈、乙草胺、甲草胺、甲胺磷、、甲萘威、毒死蜱、百菌清、莠去津中進(jìn)行特異性試驗(yàn)，5分鐘內(nèi)各批次試紙條在控制區(qū)和檢測(cè)區(qū)均可見(jiàn)一條色帶，為陰性。

特異性：取保存在37℃的甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條，依次浸入濃度均為50日期（天）

批號(hào)0504240504280505100505170505250505283－－－－－－6－－－－－－9－－－－－－12－－－－－－15－－－－－－18－－－－－－21－－－－－－37℃條件下甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條特異性檢測(cè)050528－－37℃條件下甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條特異性檢測(cè)51結(jié)果分析甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條在37℃放置20天后，其敏感度仍可達(dá)到300ng/mL；批間差小，性能穩(wěn)定；與100μg/mL的草甘磷、甲基立枯磷、敵百蟲(chóng)、林丹、綠麥隆、甲基對(duì)硫磷、禾草靈、乙草胺、甲草胺、甲胺磷、、甲萘威、毒死蜱、百菌清、莠去津等農(nóng)藥樣品均無(wú)交叉反應(yīng)，特異性好。結(jié)果分析52膠體金檢測(cè)試紙條4～30℃放置6個(gè)月穩(wěn)定性試驗(yàn)將甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法膠體金試紙條保存在4～30℃放置6個(gè)月，對(duì)產(chǎn)品每隔3個(gè)月進(jìn)行敏感性、陽(yáng)性參考品符合率、特異性檢測(cè)。

取保存在4～30℃的甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條，依次浸在蒸餾水、濃度為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、1μg/mL、2μg/mL甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品中進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，5分鐘內(nèi)各試紙條均可見(jiàn)一條紅色的控制線，其中蒸餾水和濃度為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品在檢測(cè)區(qū)和控制區(qū)均可見(jiàn)色帶，為陰性；而甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品300ng/mL、500ng/mL、1μg/mL、2μg/mL僅在控制區(qū)出現(xiàn)一條色帶，為陽(yáng)性。

膠體金檢測(cè)試紙條4～30℃放置6個(gè)月穩(wěn)定性試驗(yàn)將甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法53取保存在4～30℃的甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條，依次浸入濃度為300ng/mL、500ng/mL、800ng/mL、1μg/mL甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品中進(jìn)行陽(yáng)性參考品符合率試驗(yàn)，5分鐘內(nèi)各試紙條僅可見(jiàn)一條紅色的控制線，為陽(yáng)性。取保存在4～30℃的甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條，依次浸入濃度均為100μg/mL的草甘磷、甲基立枯磷、敵百蟲(chóng)、林丹、綠麥隆、甲基對(duì)硫磷、禾草靈、乙草胺、甲草胺、甲胺磷、、甲萘威、毒死蜱、百菌清、莠去津中進(jìn)行特異性試驗(yàn)，5分鐘內(nèi)各批次試紙條在控制區(qū)和檢測(cè)區(qū)均可見(jiàn)一條色帶，為陰性。

取保存在4～30℃的甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條，依次浸入濃度為30054批號(hào)

項(xiàng)目敏感性陽(yáng)性參考品特異性050510300ng/mL＋，300ng/mL—050514300ng/mL＋，300ng/mL—050518300ng/mL＋，300ng/mL—4～30℃條件下放置3個(gè)月競(jìng)爭(zhēng)法試紙條檢測(cè)4～30℃條件下放置3個(gè)月競(jìng)爭(zhēng)法試紙條檢測(cè)55批號(hào)

項(xiàng)目敏感性陽(yáng)性參考品特異性050510300ng/mL＋，300ng/mL—050514300ng/mL＋，300ng/mL—050518300ng/mL＋，300ng/mL—4～30℃條件下放置6個(gè)月競(jìng)爭(zhēng)法試紙條檢測(cè)

4～30℃條件下放置6個(gè)月競(jìng)爭(zhēng)法試紙條檢測(cè)56結(jié)果分析

甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條在4～30℃放置6個(gè)月，其敏感度仍可達(dá)到300ng/mL；批間差小，性能穩(wěn)定；與100μg/mL的草甘磷、甲基立枯磷、敵百蟲(chóng)、林丹、綠麥隆、甲基對(duì)硫磷、禾草靈、乙草胺、甲草胺、甲胺磷、、甲萘威、毒死蜱、百菌清、莠去津等農(nóng)藥均無(wú)交叉反應(yīng)，特異性好。

結(jié)果分析57用國(guó)家農(nóng)藥質(zhì)檢中心標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)，競(jìng)爭(zhēng)法甲霜靈膠體金檢測(cè)試紙的最低檢出量不高于300ng/mL。采用陽(yáng)性甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品，配制成濃度為100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、1μg/mL的甲霜靈樣品，結(jié)果濃度大于300ng/mL的甲霜靈陽(yáng)性參考品為陽(yáng)性，陽(yáng)性符合率大于90%，性能穩(wěn)定。小結(jié)用國(guó)家農(nóng)藥質(zhì)檢中心標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)，競(jìng)爭(zhēng)法甲霜靈膠體金檢測(cè)試紙的最58與100μg/mL的草甘磷、甲基立枯磷、敵百蟲(chóng)、林丹、綠麥隆、甲基對(duì)硫磷、禾草靈、乙草胺、甲草胺、甲胺磷、、甲萘威、毒死蜱、百菌清、莠去津等農(nóng)藥無(wú)交叉反應(yīng)，特異性好。三批試紙條批內(nèi)、批間檢測(cè)結(jié)果一致，具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。通過(guò)對(duì)試紙條在37℃、20天和4～30℃、20個(gè)月的穩(wěn)定性研究，因成品的有效期應(yīng)比實(shí)際穩(wěn)定存儲(chǔ)的期限少兩個(gè)月，結(jié)果確定該產(chǎn)品的有效期為18個(gè)月?；厥章士蛇_(dá)100%，膠體金檢測(cè)試紙條性能可靠，結(jié)果穩(wěn)定。與100μg/mL的草甘磷、甲基立枯磷、敵百蟲(chóng)、林丹、綠麥隆594.成品研制經(jīng)過(guò)產(chǎn)品的包裝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)，成功制成甲霜靈膠體金檢測(cè)試紙，應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)法膠體金檢測(cè)試紙最低檢出量可達(dá)0.3mg/kg，達(dá)到國(guó)標(biāo)要求。4.成品研制60三、結(jié)論甲霜靈膠體金檢測(cè)試紙條是一種集快速、靈敏、操作簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉于一體的農(nóng)藥殘留檢測(cè)產(chǎn)品，充分證實(shí)了膠體金免疫法在農(nóng)藥、獸藥殘留檢測(cè)中是一種肯定、有效的快速檢測(cè)手段。

三、結(jié)論甲霜靈膠體金檢測(cè)試紙條是一種集快速、靈敏、操作簡(jiǎn)便、61ThanksThanks62甲霜靈膠體金競(jìng)爭(zhēng)法試紙課件63甲霜靈膠體金競(jìng)爭(zhēng)法試紙條的研制

北京萬(wàn)華生物工程有限公司

2019.12.8

甲霜靈膠體金競(jìng)爭(zhēng)法試紙條的研制64一、前言農(nóng)藥甲霜靈簡(jiǎn)介最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法的建立分課題進(jìn)展情況簡(jiǎn)單匯報(bào)一、前言651.農(nóng)藥甲霜靈簡(jiǎn)介農(nóng)藥甲霜靈（metalaxyl），又名阿普隆、雷多米爾、瑞毒霉、甲霜安，化學(xué)名稱D，L-N-（2，6-二甲基苯基）-N-（2‘-甲氧基乙基）氨基丙酸甲酯，屬酰苯胺類殺菌劑。

據(jù)中國(guó)農(nóng)藥毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，屬低毒殺菌劑。

對(duì)卵菌引起的病害具有獨(dú)特的保護(hù)和治療作用。1.農(nóng)藥甲霜靈簡(jiǎn)介農(nóng)藥甲霜靈（metalaxyl），又名阿普662.最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)合國(guó)FAO/WHO食品法委員會(huì)（CCPR）《關(guān)于食品和飼料中農(nóng)藥最高殘留限量的規(guī)定》中規(guī)定每日允許攝入量（ADI）為0.03mg/kg體重，禾谷類植物最高允許殘留量為0.05×10-6。中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部和中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)于2019年1月25日發(fā)布，自2019年10月1日起實(shí)施中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)（GB2763-2019），該標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了農(nóng)藥甲霜靈在食品中的最大允許殘留量。

2.最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)合國(guó)FAO/WHO食品法委員會(huì)（CCP67中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)甲霜靈在食品中最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)種類

最高殘留限量（MRL），≤，mg/kg國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)號(hào)

谷子0.05GB2763-2019黃瓜0.5GB2763-2019葡萄1GB2763-2019中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)甲霜靈在食品中最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)種類最683.檢測(cè)方法建立甲霜靈不穩(wěn)定，傳統(tǒng)的氣相色譜法檢測(cè)困難。Krause在原有檢測(cè)基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，將高效液相色譜法（HPLC）應(yīng)用于食物樣本檢測(cè)中，此方法普遍用于檢測(cè)氨基甲酸酯類殺蟲(chóng)劑。雖然HPLC法具有更高的靈敏度，可以精確地對(duì)樣品中的農(nóng)藥進(jìn)行定性和定量分析，但此法要求精密復(fù)雜的儀器，而且需要專業(yè)人員操作，不適合于大批量樣品的檢測(cè)。

3.檢測(cè)方法建立甲霜靈不穩(wěn)定，傳統(tǒng)的氣相色譜法檢測(cè)困難。Kr69膠體金免疫層析診斷技術(shù)是在單克隆抗體技術(shù)、免疫層析技術(shù)及膠體金顯色技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新型體外診斷技術(shù)，具有快速、靈敏、操作簡(jiǎn)便、成本低、無(wú)需專業(yè)人員操作等特點(diǎn)，真正達(dá)到復(fù)雜原理與簡(jiǎn)易操作的統(tǒng)一；同時(shí)具有保存方便，有效期長(zhǎng)等特點(diǎn)。

與氣相色譜法補(bǔ)充使用，具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)迅速等特點(diǎn)。膠體金免疫層析診斷技術(shù)是在單克隆抗體技術(shù)、免疫層析技術(shù)及膠體70主要技術(shù)路線主要技術(shù)路線714.分課題情況簡(jiǎn)單匯報(bào)擬解決的關(guān)鍵技術(shù)：小分子免疫原的合成、與小分子免疫原抗原決定簇配對(duì)單克隆抗體的制備及膠體金研究。

4.分課題情況簡(jiǎn)單匯報(bào)擬解決的關(guān)鍵技術(shù)：72課題完成情況及效果：本課題已成功研制出合成免疫原N2B，進(jìn)行免疫獲得單克隆抗體N2B14E6C10,這一針對(duì)甲霜靈抗原決定簇配對(duì)的單克隆抗體，親和力好，效價(jià)達(dá)到10-9，并成功制成甲霜靈膠體金檢測(cè)試紙，應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)法膠體金檢測(cè)試紙最低檢出量可達(dá)0.3mg/kg，達(dá)到國(guó)標(biāo)要求。通過(guò)比對(duì)試驗(yàn)的驗(yàn)證，相關(guān)系數(shù)r=0.99996，說(shuō)明方法的可靠性。因此，可以肯定膠體金免疫法在農(nóng)藥、獸藥殘留限量快速檢測(cè)技術(shù)中，是最有效、最快速、最簡(jiǎn)便的方法。其優(yōu)點(diǎn)在于靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、快速、常溫儲(chǔ)存等，是適合于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的一種快速檢測(cè)方法，是食品安全檢測(cè)的一種手段，互補(bǔ)現(xiàn)有檢測(cè)方法各自的優(yōu)缺點(diǎn)。

課題完成情況及效果：73二、試驗(yàn)研究?jī)?nèi)容免疫原合成抗體制備膠體金研究半成品研制及鑒定成品研制二、試驗(yàn)研究?jī)?nèi)容免疫原合成741.免疫原合成半抗原合成免疫原合成免疫原的鑒定小結(jié)1.免疫原合成75（1）半抗原合成將1.6gNaOH溶于200mL蒸餾水中，并加入10.056g甲霜靈，油浴50℃下攪拌6h，用TLC檢測(cè)，反應(yīng)完全；用乙酸乙酯洗滌反應(yīng)液，棄去酯相；水層用濃鹽酸調(diào)pH值至1.0左右，析出白色物質(zhì)；用乙酸乙酯再次萃取混合液，酯相用無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)夜；抽濾酯相，旋轉(zhuǎn)蒸除溶劑，得到白色固體物質(zhì)；用正己烷和乙酸乙酯重結(jié)晶，抽濾后得到半抗原N2（甲霜靈酸）。（1）半抗原合成將1.6gNaOH溶于200mL蒸餾水中，76（2）免疫原合成稱取0.265g甲霜靈酸，用8mLDMF溶解，加入0.258gDCC和0.125gNHS；用TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全程度，待反應(yīng)完全后，抽濾反應(yīng)液，用DMF洗滌兩遍；稱取2gBSA，用200mL0.2mol/LpH值8.7的硼酸鹽緩沖液溶解；將DMF溶液滴入到上述BSA溶液中，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，得到甲霜靈免疫原N2B。

先用蒸餾水透析2天，再用生理鹽水透析3天，每天換液2次；透析后的溶液于3000r/min離心15min，取上清液于-20℃下冷凍干燥，凍干后分裝保存。同法可將甲霜靈酸連接到雞卵清蛋白OVA上，合成檢測(cè)原（N2A）。

（2）免疫原合成稱取0.265g甲霜靈酸，用8mLDMF溶77（3）免疫原的鑒定紫外掃描從紫外掃描圖譜可以看出：N2B在274.5nm出現(xiàn)最大吸收峰，峰值為0.209ABS；BSA在278.0nm出現(xiàn)最大吸收峰，峰值為0.083ABS。甲霜靈人工合成免疫原N2B在280nm左右的紫外吸收峰明顯高于BSA在280nm的紫外吸收峰，所以通過(guò)紫外掃描可以證明，甲霜靈半抗原成功的連接到了載體蛋白BSA上。（3）免疫原的鑒定紫外掃描從紫外掃描圖譜可以看出：N2B在278瓊脂糖雙擴(kuò)散法鑒定DADT結(jié)果顯示，抗血清與免疫原（N2B）、BSA、檢測(cè)原（N2A）均出現(xiàn)反應(yīng)沉淀線，而與OVA、甲霜靈未產(chǎn)生可見(jiàn)的沉淀線。這說(shuō)明抗血清中含有甲霜靈抗體和BSA抗體，不與OVA交叉反應(yīng)，雖然與甲霜靈發(fā)生交叉反應(yīng)（理論上推測(cè)），但不形成可見(jiàn)的沉淀線。DADT檢測(cè)結(jié)果表明，N2B合成成功，即N2與BSA間通過(guò)化學(xué)鍵結(jié)合。瓊脂糖雙擴(kuò)散法鑒定DADT結(jié)果顯示，抗血清與免疫原（N2B）79（4）小結(jié)本試驗(yàn)通過(guò)化學(xué)合成法進(jìn)行甲霜靈免疫原的制備，利用甲霜靈酸結(jié)構(gòu)中的羧基，在適當(dāng)?shù)呐悸?lián)劑作用下將其連接到載體蛋白（-BSA）上，制成免疫原。通過(guò)紫外檢測(cè)法、動(dòng)物免疫試驗(yàn)對(duì)甲霜靈免疫原進(jìn)行鑒定，證實(shí)免疫原合成成功。

（4）小結(jié)802.抗體制備單克隆抗體制備多克隆抗體制備2.抗體制備81（1）單克隆抗體制備單克隆抗體制備流程單克隆抗體特性鑒定小結(jié)（1）單克隆抗體制備82單克隆抗體制備流程單克隆抗體制備流程83用合成的免疫原N2B免疫BALB/C小鼠，在無(wú)菌條件下取免疫小鼠脾細(xì)胞與Sp2/0細(xì)胞融合，共融合6次，每次1只。用ELISA間接法從產(chǎn)生的267株陽(yáng)性雜交瘤中，篩選出對(duì)甲霜靈抗原呈陽(yáng)性反應(yīng)的雜交瘤11株，注射小鼠185只，制備腹水419mL，純化得到275.8mg抗體。結(jié)果表明：我們成功獲得了能識(shí)別甲霜靈抗原決定簇的雜交瘤細(xì)胞株：N2B14E6C10。用合成的免疫原N2B免疫BALB/C小鼠，在無(wú)菌條件下取免疫84單克隆抗體鑒定①抗體的純度鑒定

從圖中可以看出N2B14E6C10在電泳中呈現(xiàn)1條帶，純度大于95%，同時(shí)這株抗體分子量與97.4KD蛋白標(biāo)準(zhǔn)品相近。

單克隆抗體鑒定①抗體的純度鑒定從圖中可以看出N2B1485②間接ELISA法檢測(cè)抗體活性

從左圖可以看出，當(dāng)抗原濃度為0.32ng/mL時(shí)，OD450是1.681，大于0.5，因此活性合格。②間接ELISA法檢測(cè)抗體活性從左圖可以看出，當(dāng)抗原濃度為86③間接ELISA法抗體特異性檢測(cè)

由左圖可以看出甲霜靈單抗只針對(duì)甲霜靈抗原特異，與其它無(wú)關(guān)抗原不發(fā)生反應(yīng)，具有較好的特異性。

③間接ELISA法抗體特異性檢測(cè)由左圖可以看出甲霜靈單抗只87④抗體親和力的鑒定

④抗體親和力的鑒定88單抗測(cè)得三個(gè)Kaff值（M-1）Kaff值（M-1）均值±標(biāo)準(zhǔn)差變異系數(shù)（%）N2B14E6C107.41×109（6.72±0.507）×1097.50%6.20×1096.56×109N2B14E6C10抗體親和力表

測(cè)得三個(gè)Kaff值N2B14E6C107.41×109（89用甲霜靈抗原包被直接篩選，結(jié)果顯示：N2B14E6C10能識(shí)別甲霜靈抗原決定簇；經(jīng)ProteinA柱直接純化，亞類為IgG1的這株抗體純度達(dá)到95%以上；抗體親和力常數(shù)（6.72±0.507）×109，可以滿足用于制備檢測(cè)試紙的檢測(cè)線。

小結(jié)小結(jié)90（2）多克隆抗體制備基本制備過(guò)程多克隆抗體活性鑒定小結(jié)（2）多克隆抗體制備91過(guò)程：動(dòng)物免疫多克隆抗體純化多抗活性鑒定過(guò)程：動(dòng)物免疫多克隆抗體純化多抗活性鑒定92500μg1000μg31.25μggg31.25μggggggg1000μg500μg62.5μg125μg250μg62.5μg125μg250μg0.5mg/mL1mg/mL從左圖可以看出，此羊抗屬I(mǎi)gG抗體稀釋濃度在31.25μg/mL時(shí)清晰可見(jiàn)沉淀線，判定此抗體活性合格。

多克隆抗體活性鑒定500μg1000μg31.25μg31.25μg1000μ93羊抗鼠多克隆抗體，經(jīng)活性鑒定合格，可以滿足用于制備檢測(cè)試紙的控制線。小結(jié)小結(jié)943.膠體金研究經(jīng)過(guò)電鏡結(jié)果分析（同甲萘威），我們可以得出：膠體金顆粒直徑在20～30nm之間時(shí)，顆粒大小均勻、無(wú)聚合與沉淀現(xiàn)象，且靈敏度高，為最佳狀態(tài)。此時(shí)與抗體的結(jié)合量為6～12mg，氯金酸與檸檬酸三鈉溶液的配比為30mL/18～20mL。3.膠體金研究經(jīng)過(guò)電鏡結(jié)果分析（同甲萘威），我們可以得出：膠954.半成品研制及鑒定原理膠體金檢測(cè)試紙條的制作工藝流程半成品調(diào)試半成品鑒定小結(jié)4.半成品研制及鑒定原理96在硝酸纖維素膜上的檢測(cè)區(qū)包被甲霜靈合成免疫原，對(duì)照區(qū)包被羊抗鼠多克隆抗體。當(dāng)待測(cè)物中有被測(cè)的抗原物質(zhì)（即甲霜靈）時(shí)，待測(cè)物中的抗原物質(zhì)就會(huì)與標(biāo)記膠體金的甲霜靈單克隆抗體形成Ag-Ab-Au復(fù)合物，復(fù)合物不與包被在硝酸纖維素膜上的甲霜靈合成免疫原結(jié)合，僅會(huì)在控制線處出現(xiàn)一條色帶（C線），結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明被檢測(cè)的樣品中農(nóng)藥甲霜靈超標(biāo)。當(dāng)待測(cè)物質(zhì)中沒(méi)有被測(cè)的抗原物質(zhì)時(shí)，標(biāo)記膠體金的甲霜靈單克隆抗體就會(huì)與包被在硝酸纖維素膜上的甲霜靈合成免疫原結(jié)合，形成Ag-Ab-Au復(fù)合物，此時(shí)檢測(cè)線處可看到一條明顯色帶（T線），因此當(dāng)檢測(cè)試紙上可看到兩條線（C線和T線）時(shí)，結(jié)果為陰性，說(shuō)明被檢測(cè)的樣品中農(nóng)藥甲霜靈未超標(biāo)。原理在硝酸纖維素膜上的檢測(cè)區(qū)包被甲霜靈合成免疫原，對(duì)照區(qū)包被羊抗97膠體金檢測(cè)試紙條制作工藝流程膠體金檢測(cè)試紙條制作工藝流程98調(diào)試日期數(shù)量測(cè)試結(jié)果結(jié)果分析解決方法備注水標(biāo)準(zhǔn)品05.4.108條陰性無(wú)梯度，檢測(cè)1mg/mL和檢測(cè)水的顏色一樣。1.膠體金的濃度高2.膜的濃度高1.降低金的濃度2.降低膜的濃度檢測(cè)不同濃度的小樣8個(gè)05.4.118條陰性檢測(cè)限100μg/mL，敏感度低。1.膠體金的濃度高2.膜的濃度高1.降低金的濃度2.降低膜的濃度檢測(cè)不同濃度的小樣8個(gè)05.4.128條陰性檢測(cè)限1μg/mL，敏感度低。1.膠體金的濃度高2.膜的濃度高1.降低金的濃度2.降低膜的濃度檢測(cè)不同濃度的小樣8個(gè)05.4.138條無(wú)反應(yīng)線

1.膠體金的濃度低2.膜的濃度低1.提高膠體金的濃度2.提高膜的濃度檢測(cè)不同濃度的小樣15個(gè)05.4.148條反應(yīng)線淺檢測(cè)限10ng/mL1.膠體金的濃度低2.膜的濃度低1.提高膠體金的濃度2.提高膜的濃度檢測(cè)不同濃度的小樣10個(gè)05.4.178條陰性檢測(cè)限500ng/mL，敏感度低膠體金濃度高降低膠體金的濃度檢測(cè)不同濃度的小樣4個(gè)05.4.198條陰性檢測(cè)限300ng/mL。結(jié)果符合要求，測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品有梯度。進(jìn)行敏感性，特異性和陽(yáng)性參考品檢測(cè)。生產(chǎn)試紙條進(jìn)行半成品的鑒定05.4.198條陰性檢測(cè)陽(yáng)性參考品達(dá)300ng/mL結(jié)果符合要求，測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品有梯度。進(jìn)行敏感性，特異性和陽(yáng)性參考品檢測(cè)。生產(chǎn)試紙條進(jìn)行半成品的鑒定05.4.198條陰性與其它農(nóng)藥均無(wú)交叉結(jié)果符合要求，測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品有梯度。進(jìn)行敏感性，特異性和陽(yáng)性參考品檢測(cè)。生產(chǎn)試紙條進(jìn)行半成品的鑒定甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條半成品靈敏度調(diào)試

05.4.108條陰性無(wú)梯度，檢測(cè)1mg/mL和檢測(cè)水的顏色99①

敏感性鑒定取甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條，依次浸入蒸餾水、濃度為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、1μg/mL、2μg/mL甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品中，5分鐘內(nèi)各試紙條均可見(jiàn)一條紅色的控制線，其中蒸餾水和濃度為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品在檢測(cè)區(qū)和控制區(qū)均可見(jiàn)一條色帶，為陰性；而濃度為300ng/mL、500ng/mL、1μg/mL、2μg/mL甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品僅在控制區(qū)出現(xiàn)一條色帶，為陽(yáng)性。

半成品鑒定①敏感性鑒定半成品鑒定100圖中試紙條從左到右依次是蒸餾水、濃度為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、1μg/mL、2μg/mL甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果分析：

甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條敏感度可達(dá)到300ng/mL；檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品有梯度變化，靈敏度高，批間差小，性能穩(wěn)定。

圖中試紙條從左到右依次是蒸餾水、濃度為10ng/mL、50n101②陽(yáng)性參考品符合率鑒定取甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條，依次浸入濃度為300ng/mL、500ng/mL、800ng/mL、1μg/mL甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品中，5分鐘內(nèi)各試紙條僅可見(jiàn)一條紅色的控制線，為陽(yáng)性。②陽(yáng)性參考品符合率鑒定102圖中試紙條從左到右依次是濃度為100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、800ng/mL、1μg/mL甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果。

結(jié)果分析：甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條性能穩(wěn)定，特異性好。

圖中試紙條從左到右依次是濃度為100ng/mL、300ng/103③特異性鑒定取甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條，依次浸入濃度均為100μg/mL的草甘磷、甲基立枯磷、敵百蟲(chóng)、林丹、綠麥隆、甲基對(duì)硫磷、禾草靈、乙草胺、甲草胺、甲胺磷、甲萘威、毒死蜱、百菌清、莠去津樣品中，5分鐘內(nèi)各試紙條在檢測(cè)區(qū)和控制區(qū)均可見(jiàn)一條色帶，為陰性。③特異性鑒定104圖中試紙條從左到右依次是濃度均為100μg/mL的草甘磷、甲基立枯磷、敵百蟲(chóng)、林丹、綠麥隆、甲基對(duì)硫磷、禾草靈、乙草胺、甲草胺、甲胺磷、、甲萘威、毒死蜱、百菌清、莠去津的檢測(cè)結(jié)果。

結(jié)果分析甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條與濃度均為100μg/mL的草甘磷、甲基立枯磷、敵百蟲(chóng)、林丹、綠麥隆、甲基對(duì)硫磷、禾草靈、乙草胺、甲草胺、甲胺磷、甲萘威、毒死蜱、百菌清、莠去津常用農(nóng)藥均無(wú)交叉反應(yīng)，特異性好。

圖中試紙條從左到右依次是濃度均為100μg/mL的草甘磷、甲105④精密度鑒定取甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條，依次浸入300ng/mL的甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品中，同批次、不同批次各平行檢測(cè)10條，5分鐘內(nèi)各試紙條均可見(jiàn)一條紅色的控制線，為陽(yáng)性。甲霜靈膠體金競(jìng)爭(zhēng)法試紙課件106每批試紙條是濃度為300ng/mL甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果。

結(jié)果分析：甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙性能穩(wěn)定；可重復(fù)性好。

每批試紙條是濃度為300ng/mL甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果。107⑤穩(wěn)定性鑒定膠體金檢測(cè)試紙條37℃放置20天穩(wěn)定性試驗(yàn)?zāi)z體金檢測(cè)試紙條4～30℃放置6個(gè)月穩(wěn)定性試驗(yàn)

⑤穩(wěn)定性鑒定108膠體金檢測(cè)試紙條37℃放置20天穩(wěn)定性試驗(yàn)取甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條保存在37℃放置20天，對(duì)產(chǎn)品每隔3天進(jìn)行敏感性、陽(yáng)性參考品符合率、特異性檢測(cè)。敏感性：取保存在37℃的甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條依次浸在蒸餾水、濃度為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、1μg/mL、2μg/mL甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品中進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，5分鐘內(nèi)各試紙條均可見(jiàn)一條紅色的控制線，其中蒸餾水和濃度為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品在檢測(cè)區(qū)和控制區(qū)均可見(jiàn)色帶，為陰性；而濃度為300ng/mL、500ng/mL、1μg/mL、2μg/mL甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品僅在控制區(qū)出現(xiàn)一條色帶，為陽(yáng)性。膠體金檢測(cè)試紙條37℃放置20天穩(wěn)定性試驗(yàn)取甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙10937℃條件下甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條敏感度檢測(cè)

日期（天）

批號(hào)0504240504280505100505170505250505283300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL6300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL9300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL12300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL15300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL18300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL21300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL3300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng110陽(yáng)性參考品符合率：取保存在37℃的甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條依次浸在濃度為300ng/mL、500ng/mL、800ng/mL、1μg/mL甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品中，進(jìn)行陽(yáng)性參考品符合率試驗(yàn)；5分鐘內(nèi)各試紙條僅可見(jiàn)一條紅色的控制線，為陽(yáng)性。

甲霜靈膠體金競(jìng)爭(zhēng)法試紙課件111日期（天）

批號(hào)0504240504280505100505170505250505283＋＋＋＋＋＋6＋＋＋＋＋＋9＋＋＋＋＋＋12＋＋＋＋＋＋15＋＋＋＋＋＋18＋＋＋＋＋＋21＋＋＋＋＋＋

37℃條件下甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條陽(yáng)性參考品檢測(cè)

37℃條件下甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條陽(yáng)性參考品檢測(cè)112特異性：取保存在37℃的甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條，依次浸入濃度均為100μg/mL的草甘磷、甲基立枯磷、敵百蟲(chóng)、林丹、綠麥隆、甲基對(duì)硫磷、禾草靈、乙草胺、甲草胺、甲胺磷、、甲萘威、毒死蜱、百菌清、莠去津中進(jìn)行特異性試驗(yàn)，5分鐘內(nèi)各批次試紙條在控制區(qū)和檢測(cè)區(qū)均可見(jiàn)一條色帶，為陰性。

特異性：取保存在37℃的甲霜靈競(jìng)爭(zhēng)法試紙條，依次浸入濃度均為113日期（天）

批號(hào)0504240504280505100505170505250505283－－－－－－6－－－－－－9－－－－－－12－－－－－－15－－－－－－18－－