如何迎接臨床基因診斷實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收課件

臨床基因診斷實(shí)驗(yàn)室

技術(shù)準(zhǔn)入的缺陷分析江蘇省臨床檢驗(yàn)中心許斌

臨床基因診斷實(shí)驗(yàn)室

技術(shù)準(zhǔn)入的缺陷分析江蘇省臨床檢驗(yàn)中心1我國(guó)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室管理國(guó)家實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可委員會(huì)（CNAS）：依據(jù)-ISO15189；國(guó)家認(rèn)可；自愿衛(wèi)生部執(zhí)業(yè)認(rèn)證：《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理辦法》為加強(qiáng)醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理，提高臨床檢驗(yàn)水平，保證醫(yī)療質(zhì)量和醫(yī)療安全，衛(wèi)生部出臺(tái)并決定自2006年6月1日起施行。《辦法》包括總則、醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理的一般規(guī)定、質(zhì)量管理、安全管理、監(jiān)督管理、附則等六章五十六條。各省細(xì)則：《江蘇省醫(yī)院檢驗(yàn)科建設(shè)管理規(guī)范》省、市臨床檢驗(yàn)中心，強(qiáng)制，【體系+能力】我國(guó)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室管理國(guó)家實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可委員會(huì)（CNAS）：2PCR實(shí)驗(yàn)室技術(shù)準(zhǔn)入依據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號(hào)《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范》衛(wèi)檢字[2002]8號(hào)《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)場(chǎng)技術(shù)驗(yàn)收表》十章三十八款PCR實(shí)驗(yàn)室技術(shù)準(zhǔn)入依據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫3美國(guó)NCCLS對(duì)NAT的法規(guī)(一)1993年─1995年12月（MM3-A,已批準(zhǔn)）

NAT用于傳染病的規(guī)定2000年（MM1-A,已批準(zhǔn)）

NAT用于遺傳病的規(guī)定2000年（MM5-P,審定中）

NAT用于血液病的規(guī)定2001年（MM6-P,審定中）

定量NAT用于傳染病的規(guī)定2001年（MM7-P,審定中）

原位雜交NAT用于遺傳病的規(guī)定美國(guó)NCCLS對(duì)NAT的法規(guī)(一)1993年─1995年124美國(guó)NCCLS對(duì)NAT的法規(guī)(二)2002年正在編寫(xiě)中的

MM9NAT用于遺傳病的規(guī)定

MM10遺傳病的基因型鑒定

MM11

NAT用于細(xì)菌分裂

MM12點(diǎn)陣式NAT在臨檢中的應(yīng)用方法

MM13

NAT的樣品制備

MM14

NAT的質(zhì)控MM15NAT在“人類基因組”應(yīng)用中的規(guī)定美國(guó)NCCLS對(duì)NAT的法規(guī)(二)2002年正在編寫(xiě)中的5●物理的:分區(qū)及單向流動(dòng)、專用移液器、一次性試管架、紫外燈、PCR工作罩、濾芯吸嘴?！窕瘜W(xué)的：dUTP/UNGPCR產(chǎn)物防污染系統(tǒng)、DNA清潔液?！穹椒▽W(xué)的：即時(shí)Taqman法，Lab-on-a-chip芯片法，RTPCR一步法?！裰贫群筒僮饕?guī)范（維護(hù)保養(yǎng)、執(zhí)行）缺陷一、防污染意識(shí)和措施●物理的:分區(qū)及單向流動(dòng)、專用移液器、一次性試管架、紫外燈6如何迎接臨床基因診斷實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收7固定移液器固8易耗品易9PCR方法學(xué)/防污染兩步法RNAcDNAPCR

一步法RNAPCR

CT(I-Cycler/7000/COBAS-Taqman)Taqman

動(dòng)力學(xué)

(CaliperAG-9900自動(dòng)加樣)LabonaChip封閉廢液孔R(shí)TTaqTth(RT+Taq)PCR方法學(xué)/防污染兩步法RNA10擴(kuò)增中以脫氧尿苷(dUTP)取代脫氧胸苷(dTTP)，擴(kuò)增產(chǎn)物可被尿苷酶(UNG)消解，在經(jīng)加熱處理，即在脫氧尿苷處斷裂，不再能作為模板被擴(kuò)增。后續(xù)擴(kuò)增進(jìn)行之前在PCR反應(yīng)體系中加入U(xiǎn)NG處理，在預(yù)變性加熱后，可能的產(chǎn)物污染即被消除。PCR防污染UNG和dUTP防止“假陽(yáng)性”的圖解這種“假陽(yáng)性”是由于污染了前次PCR產(chǎn)物所致TAAAATTTTAAAAUUUPCRAAATUTAAAUUUAAAAAA*UNG加熱PCRUNG/dUTP系統(tǒng)擴(kuò)增中以脫氧尿苷(dUTP)取代脫氧胸苷(dTTP)，擴(kuò)11實(shí)驗(yàn)室分區(qū)原則單一流向、明確的識(shí)別標(biāo)記各區(qū)儀器設(shè)備物品配備的充分性和科學(xué)性防污染試劑準(zhǔn)備室標(biāo)本準(zhǔn)備室擴(kuò)增檢測(cè)室產(chǎn)物檢測(cè)室BIOTHREAT實(shí)驗(yàn)室分區(qū)原則單一流向、明確的識(shí)別標(biāo)記試劑準(zhǔn)備室標(biāo)本準(zhǔn)備室擴(kuò)12分區(qū)分區(qū)13

14如何迎接臨床基因診斷實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收15如何迎接臨床基因診斷實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收16缺陷二、檔案管理儀器檔案（a）制造商名稱、型號(hào)、序號(hào)或其它唯一性標(biāo)識(shí)；（b）儀器使用說(shuō)明書(shū)或其復(fù)印件；（c）校準(zhǔn)/檢測(cè)的日期和結(jié)果以及下次校準(zhǔn)和/或檢測(cè)的日期；（d）迄今所進(jìn)行的維護(hù)和今后維護(hù)計(jì)劃的細(xì)節(jié)；（e）損壞、故障、改裝或修理的歷史。人員檔案實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保存其技術(shù)人員有關(guān)資格證書(shū)（如上崗證）、培訓(xùn)、技能和經(jīng)歷等技術(shù)檔案。缺陷二、檔案管理儀器檔案17缺陷三、記錄內(nèi)容形式保存缺陷三、記錄內(nèi)容18缺陷四、質(zhì)量控制SOP文件的現(xiàn)行有效性儀器的標(biāo)志及維護(hù)保養(yǎng)試劑及耗品的質(zhì)檢缺陷四、質(zhì)量控制SOP文件的現(xiàn)行有效性19PCR檢測(cè)流程標(biāo)本采集核酸提取基因擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)采集的方法核酸的穩(wěn)定性保存分離方法*效率保存效率檢測(cè)方法*測(cè)定的線性*PCR檢測(cè)流程采集的方法分離方法*效率檢測(cè)方法*20DNA、RNA的濃度和純度測(cè)定及保存

此法準(zhǔn)確、快速，且不損壞樣品?？蓽y(cè)出濃度低于2.5ug/ml的核酸。測(cè)定時(shí)將樣品作適度的稀釋。用紫外分光光度儀檢測(cè)，記錄280nm和260nm處的吸光度。280nm為蛋白吸收峰，260nm為核酸吸收峰。其中260nm處讀數(shù)用來(lái)計(jì)算樣品的核酸濃度。1、紫外分光光度法DNA、RNA的濃度和純度測(cè)定及保存此法準(zhǔn)確2110D/A260nm=50ug/ml雙鏈DNA10D/A260nm=33ug/ml單鏈DNA10D/A260nm=40ug/mlRNADNA總產(chǎn)量（ug）=

OD(A260nm)×50ug×稀釋倍數(shù)×樣品總體積DNA濃度（ug/ml）=

OD值(A260nm)×50×稀釋倍數(shù)提取RNA總產(chǎn)量（ug）=

OD值(A260nm)×40ug×稀釋倍數(shù)×樣品總體積RNA濃度（ug/ml）=

OD值(A260nm)×40×稀釋倍數(shù)10D/A260nm=50ug/ml雙鏈DNA222、瓊脂糖凝膠微型電泳法未知濃度的微量DNA片段可與已知濃度的DNA同時(shí)電泳，根據(jù)其結(jié)合的溴乙錠熒光強(qiáng)度其含量。電泳時(shí)各DNA的體積要準(zhǔn)，否則會(huì)有誤差。2、瓊脂糖凝膠微型電泳法未知濃度的微量D233、純度檢查

天然DNA的吸光度比值為A260nm：A230nm：A280nm=1.0:0.450:0.515純DNA液的A260:A280:應(yīng)為1.8-1.9。如比值低于1.6時(shí)，這提示有蛋白質(zhì)和酚的污染，應(yīng)進(jìn)一步純化。3、純度檢查天然DNA的吸光度比值為244、RNA完整性檢查

常用變性的瓊脂糖電泳法檢查，常用的變性劑為甲醛、乙二醛和羥甲基汞。完整的RNA經(jīng)變性電泳后能分離出核糖體RNA中的28S和18S，且EB的顯色強(qiáng)度應(yīng)為2:1左右。如28S帶降低而18S帶增加則表示RNA標(biāo)本有所降解。4、RNA完整性檢查常用變性的瓊脂糖電泳法檢查255、DNA、RNA的保存4℃是DNA保存的最佳和最簡(jiǎn)單的條件之一。-70℃可能是長(zhǎng)期保存的良好溫度。但解凍時(shí)DNA可產(chǎn)生缺口，因此不宜反復(fù)凍融。DNA在TE緩沖液中（10mmol/LTris-Hcl，1mmol/LEDTA，PH8.0），4℃儲(chǔ)存6個(gè)月以上，其中EDTA還可抑制微生物生長(zhǎng)。RNA容易降解，操作和儲(chǔ)存中要防止RNA酶的污染。所用器皿高壓滅菌后用，重蒸水配制或用焦碳酸二乙酯（DEPC）處理過(guò)的蒸餾水溶解RNA，RNA溶液中加入RNA酶抑制劑（RNasin），終濃度為2U/10μl，置-20℃保存?zhèn)溆谩?、DNA、RNA的保存4℃是DNA保26血清標(biāo)志物用于

疾病診斷、流行病調(diào)查

基因檢測(cè)用于

療效監(jiān)控、預(yù)后判斷血清標(biāo)志物用于

疾病診斷、流行病調(diào)查27HIV抗體篩查試驗(yàn)流程圖

HIV抗體篩查試驗(yàn)流程圖28肝炎診斷檢測(cè)路線肝炎診斷檢測(cè)路線29英國(guó)HBV血清學(xué)診斷的SOP(V.SOP6)HBsAgAssayNegativeReaciveReport:HBsAgNegativeConfirmatoryHBsAgtestfromclotaccoringtoassayandlocalprotcal(egneutralisationorsecondHBsAg)Negative

ReactiveV.SOP7Repeat1stassayfromclot(ifavailble)BothtestsNegative1streactive2ndnegativeAnti-HBctestReportHBsAgnegativeAnti-HBcNegativeAnti-HBcReactiveReport:HBsAgequivocalRequestfurthsampleReport:Anti-HBcReactive.FurthertestAnti-HBbcIgM,HBeAg/anti-HBeandrequestafurthersample英國(guó)HBV血清學(xué)診斷的SOP(V.SOP6)HBsAgAs30實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)抗-HCV程序抗-HCVEIA陰性報(bào)告RR陽(yáng)性S/CO比值<3.8抗-HCVRIBAHCVRNANAT陰性其他結(jié)果評(píng)價(jià)(如NAT、ALT)陰性陽(yáng)性可疑陽(yáng)性RR陽(yáng)性S/CO>3.8或報(bào)告報(bào)告報(bào)告報(bào)告報(bào)告實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)抗-HCV程序抗-HCVEIA陰性報(bào)告RR陽(yáng)性S31如何迎接臨床基因診斷實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收32我們?nèi)绾芜x擇合適的替代終點(diǎn)以合理考評(píng)療效?

HBsAg消失 -完全應(yīng)答HBVDNA清除或抑制 -病毒學(xué)應(yīng)答‘e’血清轉(zhuǎn)化（HBeAg消失+抗HBe產(chǎn)生） -病毒學(xué)應(yīng)答ALT恢復(fù)正常 -生化應(yīng)答

肝臟組織學(xué)表現(xiàn) -組織學(xué)應(yīng)答

還是聯(lián)合應(yīng)答？我們?nèi)绾芜x擇合適的替代還是聯(lián)合應(yīng)答？33如何迎接臨床基因診斷實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收34HBVDNA清除或抑制？?jī)?yōu)點(diǎn):

HBVDNA抑制表示HBV復(fù)制的抑制水平，與HBeAg消失和/或ALT恢復(fù)正常相關(guān)。缺點(diǎn):不可能完全清除,不能反映持續(xù)應(yīng)答抑制程度:105(AASLDguideline)還是104(AGAPanelrecommendation*)?檢測(cè)沒(méi)有國(guó)際單位:無(wú)法采用標(biāo)準(zhǔn)化單位報(bào)告結(jié)果（copies/mL、pg/mL、meq/mL、logdrop）敏感性不同阻礙了對(duì)治療效果的比較*PhairJNATURALHISTORY,DIAGNOSTICS,ANDCLINICALPROFILESOFPERSONSWITHCHRONICHEPATITISBHBVDNA清除或抑制？?jī)?yōu)點(diǎn):*PhairJNA35核酸檢測(cè)要點(diǎn)靈敏度，<50copy/ml特異性分型突變定量的一致性療效觀察、驗(yàn)證診斷核酸檢測(cè)要點(diǎn)靈敏度，<50copy/ml36定量PCR技術(shù)定量是通過(guò)比較參考標(biāo)準(zhǔn)定量PCR技術(shù)定量是通過(guò)比較參考標(biāo)準(zhǔn)37標(biāo)準(zhǔn)品（Panel）SDA:參照WHOHBVStandard英國(guó)NIBSC(97/746)Adw

106IU/ml等于2.65×106拷貝/毫升PanelNo:L0L1L2L3L4L5

CNCCL:HBVDNA1PanelNo:1，2，3，4，5國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)局基質(zhì)問(wèn)題：基質(zhì)(Matrix)真實(shí)血樣：樣品純度和抑制劑標(biāo)準(zhǔn)品（Panel）SDA:38PCR定量方法的比較實(shí)時(shí)法Taqman

終點(diǎn)法Taqman

終點(diǎn)酶標(biāo)或芯片法外標(biāo)法7000,96孔,四波長(zhǎng)I-cycler,96孔,四波長(zhǎng)Light-cycler,32孔,三波長(zhǎng)cutoff值104/ml用于定量的必要條件：1.樣品純度高2.CT值必須小于353.定量試劑的生產(chǎn)文號(hào)內(nèi)標(biāo)法COBAS-Taqman,4×24孔，四波長(zhǎng)cutoff值50/ml用于定量的必要條件：1.終點(diǎn)循環(huán)數(shù)必須小于352.定量試劑的生產(chǎn)文號(hào)FX-990，F(xiàn)S-1000，F(xiàn)T-2000，DA620等cutoff值105/ml用于定量的必要件：1.樣品純度高2.終點(diǎn)循環(huán)數(shù)必須小于353.定量試劑的生產(chǎn)文號(hào)酶標(biāo)儀，96孔，手動(dòng)檢測(cè)Caliper1000,12孔,自動(dòng)檢測(cè)CaliperAMS-90SE,96孔,自動(dòng)加樣，自動(dòng)檢測(cè)COBAS-Amplicor，24孔,自動(dòng)擴(kuò)增，自動(dòng)檢測(cè)cutoff值102/ml用于定量必要條件：1.終點(diǎn)循環(huán)數(shù)必須小于352.定量試劑的生產(chǎn)文號(hào)PCR定量方法的比較實(shí)時(shí)法Taqman終點(diǎn)法Taqma39技術(shù)要素5.3(14條)

-檢測(cè)儀器覆蓋分析所有過(guò)程的品種、數(shù)量滿足要求可控狀態(tài)：標(biāo)志、檔案、狀態(tài)、使用安全5.3.2設(shè)備（在安裝時(shí)及常規(guī)使用中）應(yīng)顯示出能夠達(dá)到規(guī)定的性能標(biāo)準(zhǔn)，并且符合相關(guān)檢驗(yàn)所要求的規(guī)格。實(shí)驗(yàn)室管理層應(yīng)建立程序，用于定期監(jiān)測(cè)并證實(shí)設(shè)備、試劑及分析系統(tǒng)已適當(dāng)校準(zhǔn)并處于正常功能狀態(tài)。同時(shí)還應(yīng)有文件化的預(yù)防維護(hù)程序并記錄，該程序至少應(yīng)遵循制造商的建議。技術(shù)要素5.3(14條)

-檢測(cè)儀器覆蓋分析所有過(guò)程的品種40性能、狀態(tài)評(píng)價(jià)—校驗(yàn)或檢定（物理參數(shù)）VERIFICATION-驗(yàn)證、證明、檢驗(yàn)、證據(jù)—翻譯為校驗(yàn)更準(zhǔn)確！

查明和確認(rèn)計(jì)量器具是否符合法定要求的活動(dòng)，他包括檢查、加標(biāo)志和（或）出具檢定證書(shū)。校準(zhǔn)-CALIBRATION（校準(zhǔn)、標(biāo)定、標(biāo)準(zhǔn)化、測(cè)量的尺度）在規(guī)定的條件下，為確定測(cè)量?jī)x器（測(cè)量系統(tǒng)）所指示的值，與對(duì)應(yīng)的由測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)所復(fù)現(xiàn)的值之間關(guān)系的一組操作。性能、狀態(tài)評(píng)價(jià)—校驗(yàn)或檢定（物理參數(shù)）41校驗(yàn)周期與內(nèi)容頻度：首次（新安裝）；

后續(xù)（主要部件維修，強(qiáng)制周期如每年，不定期）內(nèi)容：血細(xì)胞分析儀：背景計(jì)數(shù)、精密度及攜帶污染在說(shuō)明書(shū)規(guī)定的范圍內(nèi)（如儀器無(wú)規(guī)定，精密度應(yīng)小于室間質(zhì)評(píng)允許范圍的1/4，攜帶污染小于2%）全自動(dòng)生化分析儀：加樣準(zhǔn)確度、攜帶污染率，溫控，吸光度零點(diǎn)漂移、雜閃光、準(zhǔn)確度、重復(fù)性、線性等儀器說(shuō)明書(shū)標(biāo)示的指標(biāo)在規(guī)定范圍內(nèi)PCR儀：溫度準(zhǔn)確度及升降速率；熒光本地；激發(fā)及吸收波長(zhǎng)的準(zhǔn)確度、雜閃光、重復(fù)性、線性校驗(yàn)周期與內(nèi)容頻度：首次（新安裝）；42如何迎接臨床基因診斷實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收43如何迎接臨床基因診斷實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收44如何迎接臨床基因診斷實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收45需要校驗(yàn)的儀器設(shè)備溫濕度計(jì)：環(huán)境、冰箱、冷庫(kù)等加樣設(shè)備：移液器、血沉管等制水機(jī)分析儀器需要校驗(yàn)的儀器設(shè)備溫濕度計(jì)：環(huán)境、冰箱、冷庫(kù)等46檢測(cè)儀器狀態(tài)維持—維護(hù)保養(yǎng)保養(yǎng)程序、操作手冊(cè)嚴(yán)格按照儀器使用手冊(cè)編寫(xiě)，包括日、周、月、季、半年、年標(biāo)識(shí)（時(shí)間、名稱）記錄檢測(cè)儀器狀態(tài)維持—維護(hù)保養(yǎng)47如何迎接臨床基因診斷實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收48（檢）測(cè)室內(nèi)質(zhì)控的SOP：耗品質(zhì)檢試劑質(zhì)檢質(zhì)控方法（糾錯(cuò)措施）質(zhì)控圖室間質(zhì)評(píng)的SOP：糾偏措施（檢）測(cè)室內(nèi)質(zhì)控的SOP：耗品質(zhì)檢49室內(nèi)質(zhì)控質(zhì)控目的：假陰性、假陽(yáng)性，準(zhǔn)確性、精密度質(zhì)控點(diǎn)：樣本質(zhì)量、模板提取、擴(kuò)增效率質(zhì)控物安排：空白、陰對(duì)、弱陽(yáng)對(duì)、標(biāo)準(zhǔn)品控制范圍：空白、陰對(duì)-------陰性弱陽(yáng)對(duì)-------陽(yáng)性（上下一次方）標(biāo)準(zhǔn)品-------r值（二個(gè)9）斜率（-3.5----4.0）截距（-40左右）點(diǎn)間CT值（3.3左右）室內(nèi)質(zhì)控質(zhì)控目的：假陰性、假陽(yáng)性，準(zhǔn)確性、精密度50如何確定CT值

閾值（Threshold）的作用閾值CT閾值高度標(biāo)準(zhǔn)偏差閾值=基線信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差×10如何確定CT值閾值（Threshold）的作用閾值CT閾標(biāo)51如何確定閾值基線的作用（Baselinecycles）

消除檢測(cè)中背景熒光信號(hào)的影響，確定閾值基線的范圍：儀器一般默認(rèn)的范圍PE-5700、PE-70003-15iCycle2-10LightCycle3-12基線需根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整：延長(zhǎng)基線以包括最高濃度樣本擴(kuò)增曲線起跳前盡可能多的循環(huán)，可以使擴(kuò)增曲線更平滑、數(shù)據(jù)也得到一定改善。

如何確定閾值基線的作用（Baselinecycles）52如何迎接臨床基因診斷實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收53閾值線熒光閾值線的調(diào)整

需根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整1、落在陰性對(duì)照線最高點(diǎn)上方2、外標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線的均一位置（點(diǎn)間CT3.3左右）3、盡量接近擴(kuò)增曲線剛真正進(jìn)入指數(shù)擴(kuò)增期的位置（避免弱陽(yáng)性漏檢以及一些擴(kuò)增反應(yīng)影響因素在指數(shù)期的放大）閾值線熒光閾值線的調(diào)整549.522E+91.024E+99.433E+71.127E+71.029E+69.902E+41.021E+49.217E+29.276E+11.085E+1H2O1.0E+101.0E+91.0E+81.0E+71.0E+61.0E+51.0E+41.0E+31.0E+21.0E+1H2O9.522E+91.0E+1055ThresholdCycleCalculation:BaselinecyclesThroughThresholdPosition21420.8ThresholdCycleCalculation:56標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過(guò)基線和熒光域值線的調(diào)整應(yīng)達(dá)到：

相關(guān)系數(shù)（r值）≥0.99斜率-3.0----4.0截距-40±4

（這些參數(shù)根據(jù)儀器和試劑有所不同）標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過(guò)基線和熒光域值線的調(diào)整應(yīng)達(dá)到：57室內(nèi)質(zhì)控由實(shí)驗(yàn)室工作人員采用一系列統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法連續(xù)地評(píng)價(jià)檢測(cè)工作的可靠程度，判斷檢驗(yàn)報(bào)告是否可以發(fā)出的過(guò)程。目的是控制本實(shí)驗(yàn)室測(cè)定工作的精密度，監(jiān)測(cè)其準(zhǔn)確度的改變，提高常規(guī)檢驗(yàn)工作的批間、批內(nèi)標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果的一致性。室內(nèi)質(zhì)控由實(shí)驗(yàn)室工作人員采用一系列統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法連續(xù)地評(píng)價(jià)檢測(cè)58質(zhì)控血清人血清基質(zhì)，分布均勻；

無(wú)傳染性；添加劑和調(diào)制物的數(shù)量少；瓶間變異?。粌龈善菲鋸?fù)溶后穩(wěn)定；到實(shí)驗(yàn)室后的有效期應(yīng)在1年以上液體血清較優(yōu)不用定值血清，而推薦用價(jià)廉的未定值血清質(zhì)控血清人血清基質(zhì)，分布均勻；59

在開(kāi)始進(jìn)行質(zhì)控時(shí)，只需要有3個(gè)質(zhì)控血清測(cè)定值即可進(jìn)行質(zhì)控。當(dāng)這組數(shù)據(jù)擴(kuò)大到20次有效值時(shí)就可以計(jì)算RCV的X，s。方法：（1）先將測(cè)定值從小到大排列，X1最小，Xn最大；（2）計(jì)算X和s；（3）計(jì)算SI上限值和下限值。SI上=（X最小-X）/S，SI下=（X最大-X）/S對(duì)照SI表，檢查是否出控，SI上、下限≤規(guī)定值，在控；

SI上或下限>規(guī)定值，失控。“即刻性”質(zhì)控：在開(kāi)始進(jìn)行質(zhì)控時(shí)，只需要有3個(gè)質(zhì)控血清測(cè)定值即60SI值表（即刻性質(zhì)控）N34567891011

N(3s)1.151.491.751.942.102.222.322.412.48N(2s)1.151.461.671.821.942.032.112.182.23

1213141516171819202.552.612.662.712.752.792.822.852.882.292.332.372.412.442.472.502.532.56

SI值表（即刻性質(zhì)控）61如何迎接臨床基因診斷實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收62如何迎接臨床基因診斷實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收63常用的質(zhì)控規(guī)則12s；一個(gè)質(zhì)控結(jié)果超過(guò)X±2S，此為警告規(guī)則；12.5s；一個(gè)質(zhì)控結(jié)果超過(guò)X±2.5S，提示存在隨機(jī)誤差；13s；一個(gè)質(zhì)控結(jié)果超過(guò)X±3S，提示存在隨機(jī)誤差；R4s；同批兩個(gè)結(jié)果之差超過(guò)4S，即一個(gè)質(zhì)控結(jié)果超過(guò)X+2S，另一個(gè)結(jié)果超X-2S。提示存在隨機(jī)誤差；22s；兩個(gè)連續(xù)質(zhì)控結(jié)果同時(shí)超過(guò)X+2S或X-2S，提示存在系統(tǒng)誤差；41s；一個(gè)質(zhì)控品連續(xù)的四次測(cè)定結(jié)果都超過(guò)X+1S或X-1S，兩個(gè)質(zhì)控品連續(xù)兩次測(cè)定都超過(guò)X+1S或X-1S，提示存在系統(tǒng)誤差；7T；七個(gè)連續(xù)的質(zhì)控結(jié)果呈現(xiàn)出向上或向下的趨勢(shì)，提示存在系統(tǒng)誤差；10x；十個(gè)連續(xù)的質(zhì)控結(jié)果在平均數(shù)的一側(cè)，提示存在系統(tǒng)誤差。常用的質(zhì)控規(guī)則64失控情況處理及原因分析

填寫(xiě)失控報(bào)告單上報(bào)實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人，由負(fù)責(zé)人作出是否發(fā)報(bào)告的決定分析失控原因重做同一質(zhì)控物（人為差錯(cuò)、偶然誤差）↓新開(kāi)一瓶質(zhì)控物（質(zhì)控物使用、保管）↓新開(kāi)另一批號(hào)質(zhì)控物（質(zhì)控物使用、保管）↓重新校準(zhǔn)（校準(zhǔn)錯(cuò)誤）↓進(jìn)行儀器維護(hù)，更換試劑（儀器、試劑）↓請(qǐng)專家?guī)椭?/p>

完成失控報(bào)告單失控情況處理及原因分析填寫(xiě)失控報(bào)告單上報(bào)實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人，重做65質(zhì)量審核型式檢查（編號(hào)唯一性、項(xiàng)目完整性、書(shū)寫(xiě)完整性）儀器檢查（狀態(tài)、校準(zhǔn)）試劑檢查（效期）質(zhì)控檢查（室內(nèi)、室間）異常值檢查（及時(shí)與臨床聯(lián)系）質(zhì)量審核型式檢查（編號(hào)唯一性、項(xiàng)目完整性、書(shū)寫(xiě)完整性）66

臨床基因診斷實(shí)驗(yàn)室

技術(shù)準(zhǔn)入的缺陷分析江蘇省臨床檢驗(yàn)中心許斌

臨床基因診斷實(shí)驗(yàn)室

技術(shù)準(zhǔn)入的缺陷分析江蘇省臨床檢驗(yàn)中心67我國(guó)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室管理國(guó)家實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可委員會(huì)（CNAS）：依據(jù)-ISO15189；國(guó)家認(rèn)可；自愿衛(wèi)生部執(zhí)業(yè)認(rèn)證：《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理辦法》為加強(qiáng)醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理，提高臨床檢驗(yàn)水平，保證醫(yī)療質(zhì)量和醫(yī)療安全，衛(wèi)生部出臺(tái)并決定自2006年6月1日起施行?！掇k法》包括總則、醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理的一般規(guī)定、質(zhì)量管理、安全管理、監(jiān)督管理、附則等六章五十六條。各省細(xì)則：《江蘇省醫(yī)院檢驗(yàn)科建設(shè)管理規(guī)范》省、市臨床檢驗(yàn)中心，強(qiáng)制，【體系+能力】我國(guó)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室管理國(guó)家實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可委員會(huì)（CNAS）：68PCR實(shí)驗(yàn)室技術(shù)準(zhǔn)入依據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號(hào)《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范》衛(wèi)檢字[2002]8號(hào)《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)場(chǎng)技術(shù)驗(yàn)收表》十章三十八款PCR實(shí)驗(yàn)室技術(shù)準(zhǔn)入依據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫69美國(guó)NCCLS對(duì)NAT的法規(guī)(一)1993年─1995年12月（MM3-A,已批準(zhǔn)）

NAT用于傳染病的規(guī)定2000年（MM1-A,已批準(zhǔn)）

NAT用于遺傳病的規(guī)定2000年（MM5-P,審定中）

NAT用于血液病的規(guī)定2001年（MM6-P,審定中）

定量NAT用于傳染病的規(guī)定2001年（MM7-P,審定中）

原位雜交NAT用于遺傳病的規(guī)定美國(guó)NCCLS對(duì)NAT的法規(guī)(一)1993年─1995年1270美國(guó)NCCLS對(duì)NAT的法規(guī)(二)2002年正在編寫(xiě)中的

MM9NAT用于遺傳病的規(guī)定

MM10遺傳病的基因型鑒定

MM11

NAT用于細(xì)菌分裂

MM12點(diǎn)陣式NAT在臨檢中的應(yīng)用方法

MM13

NAT的樣品制備

MM14

NAT的質(zhì)控MM15NAT在“人類基因組”應(yīng)用中的規(guī)定美國(guó)NCCLS對(duì)NAT的法規(guī)(二)2002年正在編寫(xiě)中的71●物理的:分區(qū)及單向流動(dòng)、專用移液器、一次性試管架、紫外燈、PCR工作罩、濾芯吸嘴?！窕瘜W(xué)的：dUTP/UNGPCR產(chǎn)物防污染系統(tǒng)、DNA清潔液。●方法學(xué)的：即時(shí)Taqman法，Lab-on-a-chip芯片法，RTPCR一步法?！裰贫群筒僮饕?guī)范（維護(hù)保養(yǎng)、執(zhí)行）缺陷一、防污染意識(shí)和措施●物理的:分區(qū)及單向流動(dòng)、專用移液器、一次性試管架、紫外燈72如何迎接臨床基因診斷實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收73固定移液器固74易耗品易75PCR方法學(xué)/防污染兩步法RNAcDNAPCR

一步法RNAPCR

CT(I-Cycler/7000/COBAS-Taqman)Taqman

動(dòng)力學(xué)

(CaliperAG-9900自動(dòng)加樣)LabonaChip封閉廢液孔R(shí)TTaqTth(RT+Taq)PCR方法學(xué)/防污染兩步法RNA76擴(kuò)增中以脫氧尿苷(dUTP)取代脫氧胸苷(dTTP)，擴(kuò)增產(chǎn)物可被尿苷酶(UNG)消解，在經(jīng)加熱處理，即在脫氧尿苷處斷裂，不再能作為模板被擴(kuò)增。后續(xù)擴(kuò)增進(jìn)行之前在PCR反應(yīng)體系中加入U(xiǎn)NG處理，在預(yù)變性加熱后，可能的產(chǎn)物污染即被消除。PCR防污染UNG和dUTP防止“假陽(yáng)性”的圖解這種“假陽(yáng)性”是由于污染了前次PCR產(chǎn)物所致TAAAATTTTAAAAUUUPCRAAATUTAAAUUUAAAAAA*UNG加熱PCRUNG/dUTP系統(tǒng)擴(kuò)增中以脫氧尿苷(dUTP)取代脫氧胸苷(dTTP)，擴(kuò)77實(shí)驗(yàn)室分區(qū)原則單一流向、明確的識(shí)別標(biāo)記各區(qū)儀器設(shè)備物品配備的充分性和科學(xué)性防污染試劑準(zhǔn)備室標(biāo)本準(zhǔn)備室擴(kuò)增檢測(cè)室產(chǎn)物檢測(cè)室BIOTHREAT實(shí)驗(yàn)室分區(qū)原則單一流向、明確的識(shí)別標(biāo)記試劑準(zhǔn)備室標(biāo)本準(zhǔn)備室擴(kuò)78分區(qū)分區(qū)79

80如何迎接臨床基因診斷實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收81如何迎接臨床基因診斷實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收82缺陷二、檔案管理儀器檔案（a）制造商名稱、型號(hào)、序號(hào)或其它唯一性標(biāo)識(shí)；（b）儀器使用說(shuō)明書(shū)或其復(fù)印件；（c）校準(zhǔn)/檢測(cè)的日期和結(jié)果以及下次校準(zhǔn)和/或檢測(cè)的日期；（d）迄今所進(jìn)行的維護(hù)和今后維護(hù)計(jì)劃的細(xì)節(jié)；（e）損壞、故障、改裝或修理的歷史。人員檔案實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保存其技術(shù)人員有關(guān)資格證書(shū)（如上崗證）、培訓(xùn)、技能和經(jīng)歷等技術(shù)檔案。缺陷二、檔案管理儀器檔案83缺陷三、記錄內(nèi)容形式保存缺陷三、記錄內(nèi)容84缺陷四、質(zhì)量控制SOP文件的現(xiàn)行有效性儀器的標(biāo)志及維護(hù)保養(yǎng)試劑及耗品的質(zhì)檢缺陷四、質(zhì)量控制SOP文件的現(xiàn)行有效性85PCR檢測(cè)流程標(biāo)本采集核酸提取基因擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)采集的方法核酸的穩(wěn)定性保存分離方法*效率保存效率檢測(cè)方法*測(cè)定的線性*PCR檢測(cè)流程采集的方法分離方法*效率檢測(cè)方法*86DNA、RNA的濃度和純度測(cè)定及保存

此法準(zhǔn)確、快速，且不損壞樣品?？蓽y(cè)出濃度低于2.5ug/ml的核酸。測(cè)定時(shí)將樣品作適度的稀釋。用紫外分光光度儀檢測(cè)，記錄280nm和260nm處的吸光度。280nm為蛋白吸收峰，260nm為核酸吸收峰。其中260nm處讀數(shù)用來(lái)計(jì)算樣品的核酸濃度。1、紫外分光光度法DNA、RNA的濃度和純度測(cè)定及保存此法準(zhǔn)確8710D/A260nm=50ug/ml雙鏈DNA10D/A260nm=33ug/ml單鏈DNA10D/A260nm=40ug/mlRNADNA總產(chǎn)量（ug）=

OD(A260nm)×50ug×稀釋倍數(shù)×樣品總體積DNA濃度（ug/ml）=

OD值(A260nm)×50×稀釋倍數(shù)提取RNA總產(chǎn)量（ug）=

OD值(A260nm)×40ug×稀釋倍數(shù)×樣品總體積RNA濃度（ug/ml）=

OD值(A260nm)×40×稀釋倍數(shù)10D/A260nm=50ug/ml雙鏈DNA882、瓊脂糖凝膠微型電泳法未知濃度的微量DNA片段可與已知濃度的DNA同時(shí)電泳，根據(jù)其結(jié)合的溴乙錠熒光強(qiáng)度其含量。電泳時(shí)各DNA的體積要準(zhǔn)，否則會(huì)有誤差。2、瓊脂糖凝膠微型電泳法未知濃度的微量D893、純度檢查

天然DNA的吸光度比值為A260nm：A230nm：A280nm=1.0:0.450:0.515純DNA液的A260:A280:應(yīng)為1.8-1.9。如比值低于1.6時(shí)，這提示有蛋白質(zhì)和酚的污染，應(yīng)進(jìn)一步純化。3、純度檢查天然DNA的吸光度比值為904、RNA完整性檢查

常用變性的瓊脂糖電泳法檢查，常用的變性劑為甲醛、乙二醛和羥甲基汞。完整的RNA經(jīng)變性電泳后能分離出核糖體RNA中的28S和18S，且EB的顯色強(qiáng)度應(yīng)為2:1左右。如28S帶降低而18S帶增加則表示RNA標(biāo)本有所降解。4、RNA完整性檢查常用變性的瓊脂糖電泳法檢查915、DNA、RNA的保存4℃是DNA保存的最佳和最簡(jiǎn)單的條件之一。-70℃可能是長(zhǎng)期保存的良好溫度。但解凍時(shí)DNA可產(chǎn)生缺口，因此不宜反復(fù)凍融。DNA在TE緩沖液中（10mmol/LTris-Hcl，1mmol/LEDTA，PH8.0），4℃儲(chǔ)存6個(gè)月以上，其中EDTA還可抑制微生物生長(zhǎng)。RNA容易降解，操作和儲(chǔ)存中要防止RNA酶的污染。所用器皿高壓滅菌后用，重蒸水配制或用焦碳酸二乙酯（DEPC）處理過(guò)的蒸餾水溶解RNA，RNA溶液中加入RNA酶抑制劑（RNasin），終濃度為2U/10μl，置-20℃保存?zhèn)溆谩?、DNA、RNA的保存4℃是DNA保92血清標(biāo)志物用于

疾病診斷、流行病調(diào)查

基因檢測(cè)用于

療效監(jiān)控、預(yù)后判斷血清標(biāo)志物用于

疾病診斷、流行病調(diào)查93HIV抗體篩查試驗(yàn)流程圖

HIV抗體篩查試驗(yàn)流程圖94肝炎診斷檢測(cè)路線肝炎診斷檢測(cè)路線95英國(guó)HBV血清學(xué)診斷的SOP(V.SOP6)HBsAgAssayNegativeReaciveReport:HBsAgNegativeConfirmatoryHBsAgtestfromclotaccoringtoassayandlocalprotcal(egneutralisationorsecondHBsAg)Negative

ReactiveV.SOP7Repeat1stassayfromclot(ifavailble)BothtestsNegative1streactive2ndnegativeAnti-HBctestReportHBsAgnegativeAnti-HBcNegativeAnti-HBcReactiveReport:HBsAgequivocalRequestfurthsampleReport:Anti-HBcReactive.FurthertestAnti-HBbcIgM,HBeAg/anti-HBeandrequestafurthersample英國(guó)HBV血清學(xué)診斷的SOP(V.SOP6)HBsAgAs96實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)抗-HCV程序抗-HCVEIA陰性報(bào)告RR陽(yáng)性S/CO比值<3.8抗-HCVRIBAHCVRNANAT陰性其他結(jié)果評(píng)價(jià)(如NAT、ALT)陰性陽(yáng)性可疑陽(yáng)性RR陽(yáng)性S/CO>3.8或報(bào)告報(bào)告報(bào)告報(bào)告報(bào)告實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)抗-HCV程序抗-HCVEIA陰性報(bào)告RR陽(yáng)性S97如何迎接臨床基因診斷實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收98我們?nèi)绾芜x擇合適的替代終點(diǎn)以合理考評(píng)療效?

HBsAg消失 -完全應(yīng)答HBVDNA清除或抑制 -病毒學(xué)應(yīng)答‘e’血清轉(zhuǎn)化（HBeAg消失+抗HBe產(chǎn)生） -病毒學(xué)應(yīng)答ALT恢復(fù)正常 -生化應(yīng)答

肝臟組織學(xué)表現(xiàn) -組織學(xué)應(yīng)答

還是聯(lián)合應(yīng)答？我們?nèi)绾芜x擇合適的替代還是聯(lián)合應(yīng)答？99如何迎接臨床基因診斷實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收100HBVDNA清除或抑制？?jī)?yōu)點(diǎn):

HBVDNA抑制表示HBV復(fù)制的抑制水平，與HBeAg消失和/或ALT恢復(fù)正常相關(guān)。缺點(diǎn):不可能完全清除,不能反映持續(xù)應(yīng)答抑制程度:105(AASLDguideline)還是104(AGAPanelrecommendation*)?檢測(cè)沒(méi)有國(guó)際單位:無(wú)法采用標(biāo)準(zhǔn)化單位報(bào)告結(jié)果（copies/mL、pg/mL、meq/mL、logdrop）敏感性不同阻礙了對(duì)治療效果的比較*PhairJNATURALHISTORY,DIAGNOSTICS,ANDCLINICALPROFILESOFPERSONSWITHCHRONICHEPATITISBHBVDNA清除或抑制？?jī)?yōu)點(diǎn):*PhairJNA101核酸檢測(cè)要點(diǎn)靈敏度，<50copy/ml特異性分型突變定量的一致性療效觀察、驗(yàn)證診斷核酸檢測(cè)要點(diǎn)靈敏度，<50copy/ml102定量PCR技術(shù)定量是通過(guò)比較參考標(biāo)準(zhǔn)定量PCR技術(shù)定量是通過(guò)比較參考標(biāo)準(zhǔn)103標(biāo)準(zhǔn)品（Panel）SDA:參照WHOHBVStandard英國(guó)NIBSC(97/746)Adw

106IU/ml等于2.65×106拷貝/毫升PanelNo:L0L1L2L3L4L5

CNCCL:HBVDNA1PanelNo:1，2，3，4，5國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)局基質(zhì)問(wèn)題：基質(zhì)(Matrix)真實(shí)血樣：樣品純度和抑制劑標(biāo)準(zhǔn)品（Panel）SDA:104PCR定量方法的比較實(shí)時(shí)法Taqman

終點(diǎn)法Taqman

終點(diǎn)酶標(biāo)或芯片法外標(biāo)法7000,96孔,四波長(zhǎng)I-cycler,96孔,四波長(zhǎng)Light-cycler,32孔,三波長(zhǎng)cutoff值104/ml用于定量的必要條件：1.樣品純度高2.CT值必須小于353.定量試劑的生產(chǎn)文號(hào)內(nèi)標(biāo)法COBAS-Taqman,4×24孔，四波長(zhǎng)cutoff值50/ml用于定量的必要條件：1.終點(diǎn)循環(huán)數(shù)必須小于352.定量試劑的生產(chǎn)文號(hào)FX-990，F(xiàn)S-1000，F(xiàn)T-2000，DA620等cutoff值105/ml用于定量的必要件：1.樣品純度高2.終點(diǎn)循環(huán)數(shù)必須小于353.定量試劑的生產(chǎn)文號(hào)酶標(biāo)儀，96孔，手動(dòng)檢測(cè)Caliper1000,12孔,自動(dòng)檢測(cè)CaliperAMS-90SE,96孔,自動(dòng)加樣，自動(dòng)檢測(cè)COBAS-Amplicor，24孔,自動(dòng)擴(kuò)增，自動(dòng)檢測(cè)cutoff值102/ml用于定量必要條件：1.終點(diǎn)循環(huán)數(shù)必須小于352.定量試劑的生產(chǎn)文號(hào)PCR定量方法的比較實(shí)時(shí)法Taqman終點(diǎn)法Taqma105技術(shù)要素5.3(14條)

-檢測(cè)儀器覆蓋分析所有過(guò)程的品種、數(shù)量滿足要求可控狀態(tài)：標(biāo)志、檔案、狀態(tài)、使用安全5.3.2設(shè)備（在安裝時(shí)及常規(guī)使用中）應(yīng)顯示出能夠達(dá)到規(guī)定的性能標(biāo)準(zhǔn)，并且符合相關(guān)檢驗(yàn)所要求的規(guī)格。實(shí)驗(yàn)室管理層應(yīng)建立程序，用于定期監(jiān)測(cè)并證實(shí)設(shè)備、試劑及分析系統(tǒng)已適當(dāng)校準(zhǔn)并處于正常功能狀態(tài)。同時(shí)還應(yīng)有文件化的預(yù)防維護(hù)程序并記錄，該程序至少應(yīng)遵循制造商的建議。技術(shù)要素5.3(14條)

-檢測(cè)儀器覆蓋分析所有過(guò)程的品種106性能、狀態(tài)評(píng)價(jià)—校驗(yàn)或檢定（物理參數(shù)）VERIFICATION-驗(yàn)證、證明、檢驗(yàn)、證據(jù)—翻譯為校驗(yàn)更準(zhǔn)確！

查明和確認(rèn)計(jì)量器具是否符合法定要求的活動(dòng)，他包括檢查、加標(biāo)志和（或）出具檢定證書(shū)。校準(zhǔn)-CALIBRATION（校準(zhǔn)、標(biāo)定、標(biāo)準(zhǔn)化、測(cè)量的尺度）在規(guī)定的條件下，為確定測(cè)量?jī)x器（測(cè)量系統(tǒng)）所指示的值，與對(duì)應(yīng)的由測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)所復(fù)現(xiàn)的值之間關(guān)系的一組操作。性能、狀態(tài)評(píng)價(jià)—校驗(yàn)或檢定（物理參數(shù)）107校驗(yàn)周期與內(nèi)容頻度：首次（新安裝）；

后續(xù)（主要部件維修，強(qiáng)制周期如每年，不定期）內(nèi)容：血細(xì)胞分析儀：背景計(jì)數(shù)、精密度及攜帶污染在說(shuō)明書(shū)規(guī)定的范圍內(nèi)（如儀器無(wú)規(guī)定，精密度應(yīng)小于室間質(zhì)評(píng)允許范圍的1/4，攜帶污染小于2%）全自動(dòng)生化分析儀：加樣準(zhǔn)確度、攜帶污染率，溫控，吸光度零點(diǎn)漂移、雜閃光、準(zhǔn)確度、重復(fù)性、線性等儀器說(shuō)明書(shū)標(biāo)示的指標(biāo)在規(guī)定范圍內(nèi)PCR儀：溫度準(zhǔn)確度及升降速率；熒光本地；激發(fā)及吸收波長(zhǎng)的準(zhǔn)確度、雜閃光、重復(fù)性、線性校驗(yàn)周期與內(nèi)容頻度：首次（新安裝）；108如何迎接臨床基因診斷實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收109如何迎接臨床基因診斷實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收110如何迎接臨床基因診斷實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收111需要校驗(yàn)的儀器設(shè)備溫濕度計(jì)：環(huán)境、冰箱、冷庫(kù)等加樣設(shè)備：移液器、血沉管等制水機(jī)分析儀器需要校驗(yàn)的儀器設(shè)備溫濕度計(jì)：環(huán)境、冰箱、冷庫(kù)等112檢測(cè)儀器狀態(tài)維持—維護(hù)保養(yǎng)保養(yǎng)程序、操作手冊(cè)嚴(yán)格按照儀器使用手冊(cè)編寫(xiě)，包括日、周、月、季、半年、年標(biāo)識(shí)（時(shí)間、名稱）記錄檢測(cè)儀器狀態(tài)維持—維護(hù)保養(yǎng)113如何迎接臨床基因診斷實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收114（檢）測(cè)室內(nèi)質(zhì)控的SOP：耗品質(zhì)檢試劑質(zhì)檢質(zhì)控方法（糾錯(cuò)措施）質(zhì)控圖室間質(zhì)評(píng)的SOP：糾偏措施（檢）測(cè)室內(nèi)質(zhì)控的SOP：耗品質(zhì)檢115室內(nèi)質(zhì)控質(zhì)控目的：假陰性、假陽(yáng)性，準(zhǔn)確性、精密度質(zhì)控點(diǎn)：樣本質(zhì)量、模板提取、擴(kuò)增效率質(zhì)控物安排：空白、陰對(duì)、弱陽(yáng)對(duì)、標(biāo)準(zhǔn)品控制范圍：空白、陰對(duì)-------陰性弱陽(yáng)對(duì)-------陽(yáng)性（上下一次方）標(biāo)準(zhǔn)品-------r值（二個(gè)9）斜率（-3.5----4.0）截距（-40左右）點(diǎn)間CT值（3.3左右）室內(nèi)質(zhì)控質(zhì)控目的：假陰性、假陽(yáng)性，準(zhǔn)確性、精密度116如何確定CT值

閾值（Threshold）的作用閾值CT閾值高度標(biāo)準(zhǔn)偏差閾值=基線信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差×10如何確定CT值閾值（Threshold）的作用閾值CT閾標(biāo)117如何確定閾值基線的作用（Baselinecycles）

消除檢測(cè)中背景熒光信號(hào)的影響，確定閾值基線的范圍：儀器一般默認(rèn)的范圍PE-5700、PE-70003-15iCycle2-10LightCycle3-12基線需根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整：延長(zhǎng)基線以包括最高濃度樣本擴(kuò)增曲線起跳前盡可能多的循環(huán)，可以使擴(kuò)增曲線更平滑、數(shù)據(jù)也得到一定改善。

如何確定閾值基線的作用（Baselinecycles）118如何迎接臨床基因診斷實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收119閾值線熒光閾值線的調(diào)整

需根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整1、落在陰性對(duì)照線最高點(diǎn)上方2、外標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線的均一位置（點(diǎn)間CT3.3左右）3、盡量接近擴(kuò)增曲線剛真正進(jìn)入指數(shù)擴(kuò)增期的位置（避免弱陽(yáng)性漏檢以及一些擴(kuò)增反應(yīng)影響因素在指數(shù)期的放大）閾值線熒光閾值線的調(diào)整1209.522E+91.024E+99.433E+71.127E+71.029E+69.902E+41.021E+49.217E+29.276E+11.085E+1H2O1.0E+101.0E+91.0E+81.0E+71.0E+61.0E+51.0E+41.0E+31.0E+21.0E+1H2O9.522E+91.0E+10121ThresholdCycleCalculation:Baseline