核酸適體電化學(xué)傳感器研究的新進(jìn)展-圖文

萬方數(shù)據(jù)萬方數(shù)據(jù)1期黃田貞等:核酸適體電化學(xué)傳感器研究的新進(jìn)展5圖1親和型核酸適體電化學(xué)傳感器原理Fig.1Electrochemicalaptasensorbasedonaffinityprinciple再生.并且經(jīng)過至少15次重復(fù)檢測再生后,電極行為并沒有很大變化。Hsing等【12】利用FIS建造了用于檢測凝血酶的核酸適體傳感器。他們報(bào)道了4個(gè)數(shù)量級(jí)的檢測范圍,檢測限為0.1nmol/L。為了提高FIS核酸適體傳感器的靈敏度,Fang的小組發(fā)現(xiàn)了一個(gè)放大電阻信號(hào)的方法【l引。目標(biāo)蛋白結(jié)合后.利用鹽酸胍使捕獲的凝血酶變性導(dǎo)致凝血酶的水合半徑增加。從而增大了界面電子轉(zhuǎn)移電阻,檢測限達(dá)到1.0X10。14mol/L。有些實(shí)際操作情況下不能加入氧化還原探針。這樣,電極/溶液界面就像是平行板電容器,電容(C鋁成為最重要的參數(shù)。因此,可利用非法拉第阻抗譜(NIS研究核酸適體與配體的結(jié)合。Cui等報(bào)道了第一例利用NIS核酸適體傳感器來檢測血小板生長因子【14】。他們將PDGF—BB的核酸適體共價(jià)固定到氨基化的硅表面,隨著PDGF—BB的加入,幾秒之后,電容線性降低,檢出限為40nmol/L。由于NIS技術(shù)不需要加入任何試劑,這種核酸適體傳感器可用于體內(nèi)監(jiān)測。利用蛋白質(zhì)固有的電活性也可以直接檢測蛋白質(zhì)。Wang的小組十年前就報(bào)道了利用CPSA跟蹤肽和蛋白質(zhì)的靈敏方法【151。他們首次將核酸適體修飾的磁珠與CPSA相結(jié)合。構(gòu)建了無標(biāo)記化學(xué)法檢測溶菌酶116】。核酸適體與溶菌酶形成復(fù)合物,經(jīng)分離后采用堿處理,使溶菌酶從磁珠上釋放出來,分離出磁珠,剩下的溶菌酶利用酪氨酸和色氨酸殘基的氧化進(jìn)行CPSA分析,檢測下限可達(dá)350fmol(7nmo兒。1。1.3場效應(yīng)晶體管型(FET核酸適體傳感器場效應(yīng)晶體管轉(zhuǎn)化器是構(gòu)建電化學(xué)核酸適體傳感器的另一種方法。在源極和漏極之間的通道固定傳感元件是制備FET生物傳感器的關(guān)鍵。為檢測源一漏電流的變化,固定化傳感層的厚度萬方數(shù)據(jù)萬方數(shù)據(jù)1期黃田貞等:核酸適體電化學(xué)傳感器研究的新進(jìn)展7將電化學(xué)溶出測量與量子點(diǎn)示蹤相結(jié)合已經(jīng)被證實(shí)是一種靈敏有效方法用于蛋白質(zhì)的生物分析。利用量子點(diǎn)電化學(xué)編碼來做信號(hào)增強(qiáng)的復(fù)雜蛋白質(zhì)分析近年來引起了廣泛的研究興趣。Wang等設(shè)計(jì)了競爭型多分析物電化學(xué)核酸適體傳感器用于凝血酶和溶菌酶的同時(shí)檢測㈣。首先,將巰基核酸適體及其相應(yīng)的量子點(diǎn)標(biāo)記蛋白固定在金表面上。然后加入待分析蛋白樣品來取代標(biāo)記的蛋白。洗滌后,將剩下的Cds和PbS量子點(diǎn)溶解,在修飾的玻碳電極上進(jìn)行溶出伏安分析。由于量子點(diǎn)的有效放大作用,可以獲得亞皮摩爾級(jí)的檢測限。與傳統(tǒng)的抗原一抗體免疫檢測相比,量子點(diǎn)電化學(xué)核酸適體傳感器更加靈敏,這可能得益于標(biāo)記蛋白與緊密修飾核酸適體的電極表面間低的親合力。2構(gòu)型變換型適體生物傳感器當(dāng)核酸適體與特定的蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí).有典型的構(gòu)型變換,而抗體則沒有這樣的特性。這個(gè)性質(zhì)可以被用來設(shè)計(jì)構(gòu)型變換型適體傳感器.原理如圖2所示。圖2構(gòu)型變換型核酸適體電化學(xué)傳感器原理Fig.2ElectrochemicalaptasensorbasedonConformationchangeprinciple2.1分子內(nèi)構(gòu)型變換型1996年首次報(bào)道了熒光分子信標(biāo)作為無標(biāo)記無試劑型探針用于目標(biāo)DNA分析【舢321。分子信標(biāo)包含一個(gè)用于信號(hào)產(chǎn)生的莖部和一個(gè)用于與核酸互補(bǔ)雜交的環(huán)部。加入目標(biāo)寡核苷酸,隨著雜化的進(jìn)行,結(jié)合的莖結(jié)構(gòu)打開并自發(fā)的產(chǎn)生構(gòu)型變換。這種構(gòu)型變換是合理的,因?yàn)殡s化時(shí)產(chǎn)生的吉布斯自由能降低比莖部結(jié)合時(shí)要大。這種構(gòu)型變換已被用于設(shè)計(jì)各種淬滅和熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET型分析【弱4】。已有不少研究者在探索將環(huán)部采用適體序列取代.發(fā)展類似熒光原理的基于適體信標(biāo)的電化學(xué)傳感器。通常,將適體信標(biāo)的一端修飾官能團(tuán)用于在電極表面的固定化,另一端修飾電活性標(biāo)記物來產(chǎn)生電信號(hào)。標(biāo)記物的氧化還原反應(yīng)是距離決定的。識(shí)別后,分子內(nèi)構(gòu)型變換改變了電化學(xué)標(biāo)記物和電極表面的距離,產(chǎn)生可測的信號(hào)改變【弧鮐1。這種構(gòu)型變換既可以設(shè)計(jì)信號(hào)減弱(signal—off型.也可以設(shè)計(jì)信號(hào)增強(qiáng)型(signal—on適體傳感器。在之前的研究中,Plaxco小組使用標(biāo)記有MB的巰基化32一堿基凝血酶適體設(shè)計(jì)了一種無標(biāo)記signal—off型電化學(xué)適體傳感器檢測血清中萬方數(shù)據(jù)l期黃田貞等:核酸適體電化學(xué)傳感器研究的新進(jìn)展9狀態(tài)。在這種松散結(jié)構(gòu)中,電化學(xué)信號(hào)是通過末梢的標(biāo)記物與電極表面動(dòng)態(tài)碰觸產(chǎn)生的,這就使信號(hào)響應(yīng)受到限制。如果能夠設(shè)計(jì)構(gòu)型明確的“on”或“off'’型剛型結(jié)構(gòu)。就能克服這些缺點(diǎn)。Fan等設(shè)計(jì)了檢測三磷酸腺苷(ATP的電化學(xué)適體傳感器Ⅲ1,他們使用的長鏈DNA由適體片段、雙鏈部分和阻斷部分組成,適體片段用于高親和性ATP識(shí)別,與互補(bǔ)鏈雜化的雙鏈部分用于支撐結(jié)構(gòu)。標(biāo)記3,_SH和5,-二茂鐵的DNA適體首先以雜交雙鏈形式自組裝到金表面。在這種剛性的長結(jié)構(gòu)中。二茂鐵的電子轉(zhuǎn)移效率低。ATP的加入使雙鏈結(jié)構(gòu)破壞,并使互補(bǔ)DNA鏈解開。這樣,由于剛性的ATP一適體三級(jí)結(jié)構(gòu)的形成促使二茂鐵標(biāo)記物靠近電極表面。產(chǎn)生可測電流。由于雜交雙鏈結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)都是剛性的。適體傳感器具有明確的“signal-off”和“signal—on”結(jié)構(gòu)狀態(tài),檢測限可以覆蓋nmol/L到mmol/L范圍。3酶參與型適體與目標(biāo)蛋白質(zhì)的特異結(jié)合將改變一些酶反應(yīng)的特性。例如核酸酶的水解反應(yīng)和等溫滾環(huán)擴(kuò)增(RCA反應(yīng)等。這些反應(yīng)特性可以被用來設(shè)計(jì)一些基于酶參與型的適體傳感器,原理如圖3所示。圖3酶參與型核酸適體電化學(xué)傳感器原理Fig.3ElectrochemicalaptasensorbasedOilenzyme-participatedstrategies適體是合成寡核酸或多肽分子,很容易被核酸酶水解。但有目標(biāo)蛋白質(zhì)存在時(shí)。形成的適體一蛋白質(zhì)復(fù)合體會(huì)阻止適體的降解。Leclerc等利用這種特性設(shè)計(jì)了一種基于適體檢測的凝血酶電化學(xué)適體傳感器。該研究使用了與適體互補(bǔ)的單鏈肽核酸(PNA和陽離子噻吩高聚物㈣。特異的適體首先加入到凝血酶溶液中形成適體一凝血酶復(fù)合體。然后,加入核酸酶水解溶液中剩余的適體,只留下鍵合的適體。在95℃下處理10min,使蛋白質(zhì)變性,結(jié)合的適體被釋放到溶液中。滴加1“L該溶液到中性PNA探針修飾的電極上實(shí)現(xiàn)檢測。PNA一適體雜化后,電極表面帶負(fù)電荷。將其浸泡在陽離子高聚物中,通過靜電作用將陽離子聚合物吸附到電極上。形成PNA一適體一高聚物復(fù)合體。產(chǎn)生“signalon”型電化學(xué)響應(yīng),實(shí)現(xiàn)了凝血酶的定量分析,檢測下限是75nmolJL。環(huán)狀DNA適體(“eaptamers”1是將兩種或更多折疊適體以及核酸雙鏈或聯(lián)結(jié)結(jié)構(gòu)包含在一個(gè)環(huán)狀分子中的DNAt46-47]。適體處于聯(lián)結(jié)結(jié)構(gòu)的頂端,可以提供多個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)合活性位點(diǎn)。與傳統(tǒng)的適體相比.這種環(huán)狀DNA適體具有更高的熱穩(wěn)定性和更好的耐核酸酶降解特性。Captamer正如環(huán)狀DNA一樣可以用作RCA反應(yīng)的模板。King等采用環(huán)狀DNA適體設(shè)計(jì)了聚合酶介導(dǎo)