一些生物制品的制造檢定規(guī)程

一些生物制品的制造檢定規(guī)程一些生物制品的制造檢定規(guī)程一些生物制品的制造檢定規(guī)程xxx公司一些生物制品的制造檢定規(guī)程文件編號(hào)：文件日期：修訂次數(shù)：第1.0次更改批準(zhǔn)審核制定方案設(shè)計(jì)，管理制度重組人干擾素α2b注射液ChongzuRenGanraosuα2bZhusheyeRecombinantHumanInterferonα2bInjection本品系由含有高效表達(dá)人干擾素α2b基因的大腸桿菌，經(jīng)發(fā)酵、分離和高度純化后制成。含適宜穩(wěn)定劑，不含防腐劑和抗生素。1基本要求生產(chǎn)和檢定用設(shè)施、原料及輔料、水、器具、動(dòng)物等應(yīng)符合“凡例”的有關(guān)要求。2制造2.1工程菌菌種2.重組人干擾素α2b工程菌株系由帶有人干擾素α2b基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株。2.應(yīng)符合“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”的規(guī)定。2.主種子批和工作種子批的菌種應(yīng)進(jìn)行以下各項(xiàng)全面檢定。2.1應(yīng)呈典型大腸桿菌集落形態(tài)，無(wú)其他雜菌生長(zhǎng)。2.1應(yīng)為典型的革蘭陰性桿菌。2.1應(yīng)與原始菌種相符。2.1.應(yīng)為典型大腸桿菌形態(tài)，無(wú)支原體、病毒樣顆粒及其他微生物污染。2.1應(yīng)符合大腸桿菌生物學(xué)性狀。2.1在搖床中培養(yǎng)，應(yīng)不低于原始菌種的表達(dá)量。2.1應(yīng)用抗α2b型干擾素參考血清做中和試驗(yàn)，證明型別無(wú)誤。2.1該質(zhì)粒的酶切圖譜應(yīng)與原始重組質(zhì)粒相符。2.2原液2.將檢定合格的工作種子批菌種接種于適宜的培養(yǎng)基(可含適量抗生素)中培養(yǎng)。2.采用適宜的不含任何抗生素的培養(yǎng)基。2.2.22.22.用適宜的方法收集處理菌體。2.采用經(jīng)批準(zhǔn)的純化工藝進(jìn)行初步純化，使其純度達(dá)到規(guī)定的要求。2.經(jīng)初步純化后，采用經(jīng)批準(zhǔn)的工藝進(jìn)行高度純化，使其達(dá)到3.1項(xiàng)要求，即為干擾素原液。加入適宜穩(wěn)定劑，除菌過(guò)濾后保存于適宜溫度，并規(guī)定其有效期。2.按3.1項(xiàng)進(jìn)行。2.3半成品2.2.3按經(jīng)批準(zhǔn)的配方配制稀釋液。配制后應(yīng)立即用于稀釋。2.3將檢定合格加穩(wěn)定劑的干擾素原液用2.3.1.1項(xiàng)稀釋液稀釋至所需濃度，除菌過(guò)濾2.按3.2項(xiàng)進(jìn)行。24成品2.應(yīng)符合“生物制品分批規(guī)程”規(guī)定。2.應(yīng)符合“生物制品分裝和凍干規(guī)程”規(guī)定。2.應(yīng)為經(jīng)批準(zhǔn)的規(guī)格。2.應(yīng)符合“生物制品包裝規(guī)程”規(guī)定。3檢定3.1原液檢定3.依法測(cè)定(附錄Xc)。3.1依法測(cè)定(附錄ⅥB第二法)。3.為生物學(xué)活性與蛋白質(zhì)含量之比，每1mg蛋白質(zhì)應(yīng)不低于1.0×108IU。3.3.1依法測(cè)定(附錄Ⅳc)。用非還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離膠膠濃度為15％，加樣量應(yīng)不低于10ug(考馬斯亮藍(lán)R250染色法)或5ug(銀染法)。經(jīng)掃描儀掃描，純度應(yīng)不低于95.O％。3.1依法測(cè)定(附錄ⅢB)。色譜柱以適合分離分子質(zhì)量為5～60kD蛋白質(zhì)的色譜用凝膠為填充劑；流動(dòng)相為0.1mol／L磷酸鹽-O．1mol／L氯化鈉緩沖液，pH7．0；上樣量不低于20ug，于波長(zhǎng)280nm處檢測(cè)，以干擾素色譜峰計(jì)算理論板數(shù)應(yīng)不低于1000。按面積歸一化法計(jì)算，干擾素主峰面積應(yīng)不低于總面積的95.O％。3.依法測(cè)定(附錄Ⅳc)。用還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離膠膠濃度為15％，加樣量應(yīng)不低于1.0ug，制品的分子質(zhì)量應(yīng)為19.2kD±1.92kD。3.每1次人用劑量應(yīng)不高于10ng(附錄ⅨB)。3.1.7如采用單克隆抗體親和色譜法純化，應(yīng)進(jìn)行本項(xiàng)檢定。每1次人用劑量鼠IgG殘留量應(yīng)不高于lOOng(附錄ⅨL)。3.應(yīng)不高于總蛋白質(zhì)的O.10％(附錄Ⅸc)。3.依法測(cè)定(附錄ⅨA)，不應(yīng)有殘余氨芐西林或其他抗生素活性。3.每300萬(wàn)IU應(yīng)小于10EU(附錄ⅫE凝膠限量試驗(yàn))。3.主區(qū)帶應(yīng)為4.0～6.7(附錄ⅣD)。3.1最大吸收峰波長(zhǎng)應(yīng)為278nm±3nm(附錄ⅡA)。3.依法測(cè)定(附錄ⅧE)，應(yīng)與對(duì)照品圖形一致。3.用氨基酸序列分析儀測(cè)定，N-末端序列應(yīng)為：Cys-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu—Gly-Ser-Arg-Arg-Thr-Leu。3.2半成品檢定3.每300萬(wàn)IU應(yīng)小于10EU(附錄ⅫE凝膠限量試驗(yàn))。3.2依法檢查(附錄ⅫA)，應(yīng)符合規(guī)定。3.3成品檢定3.按免疫印跡法(附錄ⅧA)或免疫斑點(diǎn)法(附錄1B)測(cè)定，應(yīng)為陽(yáng)性。3.3.3應(yīng)為澄明液體。3.3依法檢查(附錄VB)，應(yīng)符合規(guī)定。3.3按附錄IA中裝量項(xiàng)進(jìn)行。應(yīng)不低于標(biāo)示量。3.應(yīng)為6.5～7.5(附錄VA)。3.應(yīng)為標(biāo)示量的80％～150％(附錄XC)。3.依法檢查(附錄ⅫA)，應(yīng)符合規(guī)定。3.每1次人用劑量應(yīng)小于IOEU(附錄ⅫE凝膠限量試驗(yàn))。3.依法檢查(附錄ⅫF小鼠試驗(yàn)法)，應(yīng)符合規(guī)定。4保存、運(yùn)輸及有效期于2～8℃避光保存和運(yùn)輸。自分裝之日起，按批準(zhǔn)5使用說(shuō)明應(yīng)符合“生物制品包裝規(guī)程”規(guī)定。注射用重組人自介素-2ZhusheyongChongzuRenBaijiesu-2RecombinantHumanInterleukin-2forInjection本品系由含有高效表達(dá)人自細(xì)胞介素-2(簡(jiǎn)稱人白介素-2)基因的大腸桿菌，經(jīng)發(fā)酵、分離和高度純化后凍干制成。含適宜穩(wěn)定劑，不含防腐劑和抗生素。1基本要求生產(chǎn)和檢定用設(shè)施、原料及輔料、水、器具、動(dòng)物等主符合“凡例”的要求。2制造2.l工程菌菌種2.重組人白介素-2工程菌株系由帶有人白介索-2基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株。2.應(yīng)符合“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”的規(guī)定。2.l.3菌種檢定主種子批和工作種子批的菌種應(yīng)進(jìn)行以下各項(xiàng)全面檢定。2.1應(yīng)呈典型大腸桿菌集落形態(tài)，無(wú)其他雜菌生長(zhǎng)。2.1.3應(yīng)為典型的革蘭陰性桿菌。2.1應(yīng)與原始菌種相符。2.1應(yīng)為典型大腸桿菌形態(tài)，無(wú)支原體、病毒樣顆粒及其他微生物污染。2.1.應(yīng)符合大腸桿菌生物學(xué)性狀。2.1.3在搖床中培養(yǎng)，應(yīng)不低于原始菌種的表達(dá)量。2.1該質(zhì)粒的酶切圖譜應(yīng)與原始重組質(zhì)粒相符。2.2原液2.將檢定合格的工作種子批菌種接種于適宜的培養(yǎng)基（可含適量抗生素)中培養(yǎng)，供發(fā)酵罐接種用。2.采用適宜的不含任何抗生素的培養(yǎng)基。2.2.2.2.2.2.用適宜的方法收集處理菌體。2.采用經(jīng)批準(zhǔn)的純化工藝進(jìn)行初步純化，使其純度達(dá)到規(guī)定的要求。2.經(jīng)初步純化后，采用經(jīng)批準(zhǔn)的工藝進(jìn)行高度純化，使其達(dá)到3.1項(xiàng)要求，即為人白介素-2原液。加入適宜穩(wěn)定劑，除菌過(guò)濾后保存于適宜溫度，并規(guī)定其有效期。2.2按3.1項(xiàng)進(jìn)行。2.3半成品2.2.3按經(jīng)批準(zhǔn)的配方配制稀釋液。配制后應(yīng)立即用于稀釋。2.3.將檢定合格加穩(wěn)定劑的人白介素-2原液用2.3.12.按3.2項(xiàng)進(jìn)行。2.4成品2.應(yīng)符合“生物制品分批規(guī)程”規(guī)定。2.4應(yīng)符合“生物制品分裝和凍干規(guī)程”規(guī)定。2.應(yīng)為經(jīng)批準(zhǔn)的規(guī)格。2.應(yīng)符合“生物制品包裝規(guī)程”規(guī)定。3檢定3.1原液檢定3.依法測(cè)定(附錄XD)。3.依法測(cè)定(附錄ⅥB第二法)。3.為生物學(xué)活性與蛋白質(zhì)含量之比，每lmg蛋白質(zhì)應(yīng)不低于1.0×107IU。。3.1.3.1.依法測(cè)定(附錄Ⅳc)。用非還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離膠膠濃度為15％，加樣量應(yīng)不低于10ug(考馬斯亮藍(lán)R250染色法)或5ug(銀染法)。經(jīng)掃描儀掃描，純度應(yīng)不低于95.0％。3.1依法測(cè)定（附錄ⅢB)。色譜柱以適合分離分子質(zhì)量為5～60kD蛋白質(zhì)的色譜用凝膠為填充劑；流動(dòng)相為O.1moI／L磷酸鹽0.1mol／L氯化鈉緩沖液，pH7.0；上樣量不低于20ug，于波長(zhǎng)280nm處檢測(cè)，以人白介素-2色譜峰計(jì)算理論板數(shù)應(yīng)不低于1500。按面積歸一化法計(jì)算，人白介素-2主峰面積應(yīng)不低于總面積的95.0％。3.依法測(cè)定(附錄Ⅳc)。用還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離膠膠濃度為15％，加樣量應(yīng)不低于1.0ug，制品的分子質(zhì)量應(yīng)為15.5kD±1.55kD。3.每1次人用劑量應(yīng)不高于10ng(附錄ⅨB)。3.應(yīng)不高于總蛋白質(zhì)的O.10％(附錄ⅨC)。3.依法測(cè)定(附錄ⅨA)，不應(yīng)含有殘余氨芐西林或其他抗生素活性。如制品中含有SDS，應(yīng)將SDS濃度至少稀釋至O.01％進(jìn)行測(cè)定。3.1每100萬(wàn)IU應(yīng)小于10EU(附錄ⅫE凝膠限量試驗(yàn))。如制品中含有SDS，應(yīng)將SDS濃度至少稀釋至0.0025％進(jìn)行測(cè)定。3.主區(qū)帶應(yīng)為6.5～7.5(附錄ⅣD)。3.最大吸收峰波長(zhǎng)應(yīng)為277nm±3nm(附錄ⅡA)。3.依法測(cè)定(附錄ⅧE)，應(yīng)與對(duì)照品圖形一致。3.1.用氨基酸序列分析儀測(cè)定，N-末端序列應(yīng)為：Ala-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Thr-Gln-Leu-Gln-Leu-Glu。3.2半成品檢定3.每100萬(wàn)IU應(yīng)小于10EU(附錄ⅫE凝膠限量試驗(yàn))。如制品中含有SDS，應(yīng)將SDS濃度至少稀釋至O.0025％進(jìn)行測(cè)定。3.依法檢查(附錄ⅫA)，應(yīng)符合規(guī)定。3.3成品檢定除水分測(cè)定外，應(yīng)按標(biāo)示量加入滅菌注射用水，復(fù)溶后進(jìn)行其余項(xiàng)目的檢定。3.按免疫印跡法(附錄ⅧA)或免疫斑點(diǎn)法(附錄ⅧB(niǎo))測(cè)定，應(yīng)為陽(yáng)性。3.3.3應(yīng)為白色或微黃色疏松體，加入標(biāo)示量注射用水后應(yīng)迅速?gòu)?fù)溶為澄明液體。3.3依法檢查(附錄VB)，應(yīng)符合規(guī)定。3.3按附錄IA中裝量差異項(xiàng)進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。3.3.3應(yīng)不高于3.O％(附錄ⅦD)。3.3應(yīng)為6.5～7.5(附錄VA)。3.應(yīng)為標(biāo)示量的80％～150％(附錄XD)。3.依法檢查(附錄ⅫA)，應(yīng)符合規(guī)定。3.每1次人用劑量應(yīng)小于IOEU(附錄ⅫE凝膠限量試驗(yàn))。3.依法檢查(附錄ⅫF小鼠試驗(yàn)法)，應(yīng)符合規(guī)定。3.如工藝中采用乙腈，則照氣相色譜法(附錄Ⅲc)過(guò)行，色譜柱采用石英毛細(xì)管柱，柱溫45℃，汽化室溫度150℃，檢測(cè)器溫度300℃，載氣為氮?dú)猓魉贋槊糠昼?.0ml，用水稀釋乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液使其濃度為0.0004％，分別吸取1.0ml上述標(biāo)準(zhǔn)溶液及供試品溶液頂空進(jìn)樣400ul，通過(guò)比較標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品溶液的峰面積判定供試品溶液乙腈含量。乙腈殘留量應(yīng)不高于4保存、運(yùn)輸及有效期于2～8℃避光保存和運(yùn)輸。自分裝之日起，按批5使用說(shuō)明應(yīng)符合“生物制品包裝規(guī)程”規(guī)定。注射用重組人促紅素(CHO細(xì)胞)ZhusheyongChongzuRenCuhongsu(CHOXibao)RecombinantHumanErythropoietinforInjection(CHOCell)本品系由含有高效表達(dá)人紅細(xì)胞生成素(簡(jiǎn)稱人促紅素)基因的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)、分離和高度純化后凍干制成。含適宜穩(wěn)定劑，不含防腐劑和抗生素。l基本要求生產(chǎn)和檢定用設(shè)施、原料及輔料、水、器具、動(dòng)物等應(yīng)符合“凡例”的有關(guān)要求。2制造2.1工程細(xì)胞2.重組人促紅素工程細(xì)胞系由帶有人促紅素基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CHO-dhfr-(二氫葉酸還原酶基因缺陷型細(xì)胞)細(xì)胞系。2.由原始細(xì)胞庫(kù)的細(xì)胞傳代，擴(kuò)增后凍存于液氨中，作為主細(xì)胞庫(kù)；從主細(xì)胞庫(kù)的細(xì)胞傳代，擴(kuò)增后凍存于液氮中，作為工作細(xì)胞庫(kù)。每次傳代不超過(guò)批準(zhǔn)的代次。細(xì)胞系凍存于液氮中，檢定合格后方可用于生產(chǎn)。2.應(yīng)符合“生物制品生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程”規(guī)定。2.1細(xì)菌和真菌(附錄ⅫA)、支原體(附錄ⅫB)、病毒檢查(附錄Ⅻc(diǎn))均應(yīng)為陰性。2.1應(yīng)用同工酶分析、生物化學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞學(xué)和遺傳標(biāo)記物等任一方法進(jìn)行鑒別，應(yīng)為典型CHO細(xì)胞。2.1應(yīng)不低于原始細(xì)胞庫(kù)細(xì)胞表達(dá)量。2.2原液2.從工作細(xì)胞庫(kù)來(lái)源的細(xì)胞復(fù)蘇后，于含滅能小牛血清培養(yǎng)液中進(jìn)行傳代、擴(kuò)增，供轉(zhuǎn)瓶或細(xì)胞培養(yǎng)罐接種用。小牛血清的質(zhì)量應(yīng)符合規(guī)定(附錄ⅧD)。2.生產(chǎn)用細(xì)胞培養(yǎng)液應(yīng)不含牛血清和任何抗生素。2.細(xì)胞培養(yǎng)全過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格按照無(wú)菌操作。細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間可根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況而定。2.收集的培養(yǎng)液采用經(jīng)批準(zhǔn)的超濾法或其他適宜方法進(jìn)行濃縮，多步色譜純化后制得高純度的重組人促紅素，即為人促紅素原液。除菌過(guò)濾后保存于適宜溫度，并規(guī)定其有效期。2.按3.1項(xiàng)進(jìn)行。2.3半成品2.原液加入適宜穩(wěn)定劑，并用緩沖液稀釋。除菌過(guò)濾后即為半成品。2.按3.2項(xiàng)進(jìn)行。2.4成品2.應(yīng)符合“生物制品分批規(guī)程”規(guī)定。2.應(yīng)符合“生物制品分裝和凍干規(guī)程”規(guī)定。半成品應(yīng)及時(shí)分裝、冷凍。凍干的全過(guò)程中，制品溫度應(yīng)不高于30℃2.應(yīng)為經(jīng)批準(zhǔn)的規(guī)格。2.應(yīng)符合“生物制品包裝規(guī)程”規(guī)定。3檢定3.1原液檢定3.依法測(cè)定(附錄ⅥB第二法)。3.3.1依法測(cè)定(附錄XB)。3.1按酶聯(lián)免疫法試劑盒說(shuō)明書測(cè)定。3.每lmg蛋白質(zhì)應(yīng)不低于1.2×105IU。3.3.1依法測(cè)定(附錄Ⅳc)。用非還原SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，考馬斯亮藍(lán)染色，分離膠膠濃度為12.5％，加樣量應(yīng)不低于10ug，經(jīng)掃描儀掃描，純度應(yīng)不低于98.O％。3.1依法測(cè)定(附錄ⅢB)。親水硅膠體積排阻色譜柱，排阻極限300kD，孔徑24nm，粒度10um，直徑7.5mm，長(zhǎng)30cm；流動(dòng)相為3.2mmol／L磷酸氫二鈉1.5mmol／L磷酸二氫鉀-400.4mmol／L氯化鈉，pH7.3；上樣量20～lOOug，于波長(zhǎng)280nm處檢測(cè)，以人促紅素色譜峰計(jì)算理論板數(shù)應(yīng)不低于1500。按面積歸一化法計(jì)算人促紅素純度，應(yīng)不低于983.1.依法測(cè)定(附錄Ⅳc)。用還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，考馬斯亮藍(lán)R250染色，分離膠膠濃度為12.5％，加樣量應(yīng)不低于lug，分子質(zhì)量應(yīng)為36～45kD。3.依法測(cè)定(附錄ⅡA)，最大吸收峰279nm±2nm：最小吸收峰250nm±2nm；在320～360nm處無(wú)吸收峰。3.依法測(cè)定(附錄ⅣD)，使用pH值為3.0～5.O的兩性電解質(zhì)，等電點(diǎn)應(yīng)為pH3.3～4.3。3.每1mol人促紅素應(yīng)不低于9.0mol(附錄Ⅵc)。3.每lO000IU人促紅素應(yīng)不高于100pg(附錄ⅨB)。3.用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法檢測(cè)，應(yīng)不高于O.10％。3.每lO000IU人促紅素應(yīng)小于2EU(附錄ⅫE凝膠限量試驗(yàn))。3.用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)，應(yīng)不高于O.Ol％。3.供試品經(jīng)透析、凍干后，用1％碳酸氫銨溶液溶解并稀釋至l.5mg／ml，依法測(cè)定(附錄ⅧE)，其中加入胰蛋白酶(序列分析純)，37℃±0.5℃保溫6小時(shí)，色譜柱為反相C8柱(25cm×4.6mm，粒度5um，孔徑30nm)，柱溫為45℃士20ul；按下表進(jìn)行梯度洗脫(表中A為O．1％三氟乙酸水溶液，B為0．1％三氟乙酸-80%乙腈水溶液)。編號(hào)時(shí)間／分鐘流速／mlA％B％1234567O.0030.0075.00115.OO120.00125.00145.OOO.75O.750.750.75O.75O.75O.75100.O85.065.015.OO.O100.0100.0O.O15.035.085.O100.O0.00.O肽圖應(yīng)與人促紅素對(duì)照品一致。3.用氨基酸序列分析儀測(cè)定，N-末端序列應(yīng)為：Ala-Pro-Pro-Arg-Leu-Ile-CysAsp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-Tyr。3.2半成品檢定3.2.l細(xì)菌內(nèi)毒素檢查每1000IU人促紅素應(yīng)小于2EU(附錄ⅫE凝膠限量試驗(yàn))3.依法檢查(附錄ⅫA)，應(yīng)符合規(guī)定。3.3成品檢定除復(fù)溶時(shí)間和水分測(cè)定外，應(yīng)按標(biāo)示量加入滅菌注射用水，復(fù)溶后進(jìn)行其余各項(xiàng)檢定。3.3按免疫印跡法(附錄ⅧA)或免疫斑點(diǎn)法(附錄ⅧB(niǎo))測(cè)定，應(yīng)為陽(yáng)性。3.3.3應(yīng)為白色疏松體，復(fù)溶后為無(wú)色澄明液體。3.3加入標(biāo)示量的滅菌注射用水，復(fù)溶時(shí)間應(yīng)不超過(guò)2分鐘。3.3依法檢查(附錄VB)，應(yīng)符合規(guī)定。3.3按附錄IA中裝量差異項(xiàng)進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。3.3.3應(yīng)不高于3.0％(附錄ⅦD)。3.3應(yīng)為6.4～7.4或5.4～6.4(附錄VA)。33．3．3鈉離子含量應(yīng)不大于190mmol／L(附錄ⅦJ)。3.3應(yīng)不大于190mmol／L(附錄ⅦH第二法)。3.3依法測(cè)定(附錄ⅥB第二法)，應(yīng)符合經(jīng)批準(zhǔn)的蛋白質(zhì)含量范圍。3.3.3按酶聯(lián)免疫法試劑盒說(shuō)明書測(cè)定供試品體外活性(IU／ml)，根據(jù)標(biāo)示裝量計(jì)算供試品生物學(xué)活性(IU／瓶)，應(yīng)為標(biāo)示量的80％～120％。3-3．4．2體內(nèi)法按附錄XB測(cè)定供試品體內(nèi)活性(IU／m1)，根據(jù)標(biāo)示裝量計(jì)算供試品生物學(xué)括性(IU／瓶)，應(yīng)為標(biāo)示量的80％～140％。3.依法檢查(附錄ⅫA)，應(yīng)符合規(guī)定。3.每1000IU人促紅素應(yīng)小于2EU(附錄ⅫE凝膠限量試驗(yàn))。3.依法檢查(附錄ⅫF小鼠試驗(yàn)法)，應(yīng)符合規(guī)定。4保存、運(yùn)輸及有效期于8℃以下避光保存和運(yùn)輸。自分裝之日起，按批準(zhǔn)的有效期執(zhí)行。5使用說(shuō)明應(yīng)符合“生物制品包裝規(guī)程”規(guī)定。注射用重組鏈激酶RecombinantStreptokinaseforInjection本品系由含有高效表達(dá)鏈激酶基因的大腸桿菌，經(jīng)發(fā)酵、分離和高度純化后凍干制成。含適宜穩(wěn)定劑，不含防腐劑和抗生素。1基本要求生產(chǎn)和檢定用設(shè)施、原料及輔料、水、器具、動(dòng)物等應(yīng)符合“凡例”的有關(guān)要求。2制造2.1工程菌菌種2.重組鏈激酶工程菌株系由帶有鏈激酶基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株。2.應(yīng)符合“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”的規(guī)定。2.1.主種子批和工作種子批的菌種應(yīng)進(jìn)行以下各項(xiàng)全面檢定。2.1應(yīng)呈典型大腸桿菌集落形態(tài)，無(wú)其他雜菌生長(zhǎng)。2.1應(yīng)為典型的革蘭陰性桿菌。2.1應(yīng)與原始菌種相符。2.1.3應(yīng)為典型大腸桿菌形態(tài)，無(wú)支原體、病毒樣顆粒及其他微生物污染。2.1應(yīng)符合大腸桿菌生物學(xué)性狀。2.1在搖床中培養(yǎng)，應(yīng)不低于原始菌種的表達(dá)量。2.1.該質(zhì)粒的酶切圖譜應(yīng)與原始重組質(zhì)粒相符。2.2原液’2.將檢定合格的工作種子批菌種接種于適宜的培養(yǎng)基(可含適量抗生素)中培養(yǎng)，供發(fā)酵罐接種用。2.采用適宜的不含任何抗生素的培養(yǎng)基。2.22.22.2.3.2.用適宜的方法收集處理菌體。2.采用經(jīng)批準(zhǔn)的純化工藝進(jìn)行初步純化，使其純度達(dá)規(guī)定的要求。2.經(jīng)初步純化后，采用經(jīng)批準(zhǔn)的工藝進(jìn)行高度純化，使其達(dá)到3.1項(xiàng)要求，即為鏈激酶原液。加入適宜穩(wěn)定劑菌過(guò)濾后，保存于適宜溫度，并規(guī)定其有效期。2.按3.1項(xiàng)進(jìn)行。2.3半成品2.2.3按經(jīng)批準(zhǔn)的配方配制稀釋液。配制后應(yīng)立即用稀釋。2.3將檢定合格加穩(wěn)定劑的鏈激酶原液用2.3.1.2.按3.2項(xiàng)進(jìn)行。2.4成品2.應(yīng)符合“生物制品分批規(guī)程”規(guī)定。2.應(yīng)符合“生物制品分裝和凍于規(guī)程”規(guī)定。2.應(yīng)為經(jīng)批準(zhǔn)的規(guī)格。2.應(yīng)符合“生物制品包裝規(guī)程”規(guī)定。3檢定3.1原液檢定3.依法測(cè)定(附錄XI)。3.依法測(cè)定(附錄ⅥB第二法)。3.為生物學(xué)活性與蛋白質(zhì)含量之比，每lmg蛋白質(zhì)，不低于9.00×104IU。3.3.1依法測(cè)定(附錄Ⅳc)。用非還原型SDS-聚丙烯酰，凝膠電泳法，分離膠膠濃度為10％，加樣量應(yīng)不低10ug，用考馬斯亮藍(lán)R250染色。經(jīng)掃描儀掃描，純度應(yīng)不低于95.O％。3.1.依法測(cè)定(附錄ⅢB)。色譜柱采用十八烷基硅烷鍵鍵合硅膠為填充劑；以A相(三氟乙酸-水溶液：取1.0ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混勻)、B相(三氟乙酸-乙腈溶液：取1．Oml三氟乙酸加入色譜純乙腈至1000ml，充分混勻)為流動(dòng)相，在室溫條件下，進(jìn)行梯度洗脫（0～70％B相)。上樣量不低于lOug，于波長(zhǎng)280nm處檢測(cè)，以鏈激酶色譜峰計(jì)算理論板數(shù)應(yīng)不低于2000。按面面積一化法計(jì)算。鏈激酶主峰面積應(yīng)不低于總面積的95.O％。3.1依法測(cè)定(附錄Ⅳc)。用還原型SDS-聚丙烯酰胺凝墮電泳法，分離膠膠濃度為10％，加樣量應(yīng)不低于1.0ug，制品的分子質(zhì)量應(yīng)為47.0kD±4.70kD。3.每1次人用劑量應(yīng)不高于10ng(附錄ⅨB)。3.應(yīng)不高于總蛋白質(zhì)的O.050％(附錄Ⅸc)。3.依法測(cè)定(附錄ⅨA)，不應(yīng)有殘余氨芐西林或其他抗生素活性。3.1每lmg蛋白質(zhì)應(yīng)小于3EU(附錄ⅫE凝膠限量試驗(yàn))。3.主區(qū)帶應(yīng)為4.6～5.6(附錄ⅣD)。3.最大吸收峰波長(zhǎng)應(yīng)為277nm±3nm(附錄ⅡA)。3.1依法測(cè)定(附錄ⅧE)，應(yīng)與對(duì)照品圖形一致。3.用氨基酸序列分析儀測(cè)定，N-末端序列應(yīng)為：Val-Lys-Pro-Val-Gln-Ala-Ile-Ala-Gly-Ser-Glu-Trp-Leu-Leu-Asp。3.2半成品檢定3.每lmg蛋白質(zhì)應(yīng)小于3EU(附錄ⅫE凝膠限量試驗(yàn))。3.依法檢查(附錄ⅫA)，應(yīng)符合規(guī)定。3.3成品檢定除水分測(cè)定外，應(yīng)按標(biāo)示量加入滅菌注射用水，復(fù)溶后進(jìn)行其余各項(xiàng)檢定。3.按免疫印跡法(附錄ⅧA)或免疫斑點(diǎn)法(附錄ⅧB(niǎo))測(cè)定，應(yīng)為陽(yáng)性。3.3.3應(yīng)為白色或微黃色疏松體，加入標(biāo)示量注射用水后應(yīng)迅速?gòu)?fù)溶為澄明液體。3.3依法檢查(附錄VB)，應(yīng)符合規(guī)定。3.3按附錄IA中裝量差異項(xiàng)進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。3.3.3應(yīng)不高于3.0％(附錄ⅦD)。3.3應(yīng)為6.9～7.9(附錄VA)。3.應(yīng)為標(biāo)示量的80％～150％(附錄XI)。3.依法檢查(附錄ⅫA)，應(yīng)符合規(guī)定。3.每1次人用劑量應(yīng)小于15EU(附錄ⅫE凝膠限量試驗(yàn))。3.依法檢查(附錄ⅫF小鼠試驗(yàn)法)，應(yīng)符合規(guī)定。4保存、運(yùn)輸及有效期于2～8℃避光保存和運(yùn)輸。自分裝之日起，按批準(zhǔn)的有效期執(zhí)行5使用說(shuō)明應(yīng)符合“生物制品包裝規(guī)程”規(guī)定。傷寒菌苗制造及檢定規(guī)程本品系用傷寒菌培育后取菌苔制成懸液，加甲醛殺菌，以磷酸鹽緩沖生理鹽水稀釋成每ml含菌3億制成。用于預(yù)防傷寒。1菌種1.1菌種來(lái)源制造傷寒菌苗用的菌種及檢定菌種用的診斷血清，應(yīng)由中國(guó)藥品生物制品檢定所分發(fā)或經(jīng)同意。1.2菌種檢定定菌種可用pH7.2～7.4的肉湯瓊脂、馬丁瓊脂或其他適宜的培養(yǎng)基。1.2.1培養(yǎng)特性制造菌苗的菌株應(yīng)具有典型的形態(tài)、培養(yǎng)和生化特性。1.2.2用37℃培育18～20小時(shí)的培養(yǎng)物以磷酸鹽緩沖生理鹽水稀釋成含菌6億/ml，與傷寒菌診斷血清作定量凝集試驗(yàn)，充分混合后放37℃過(guò)夜，以肉眼見(jiàn)到凝集（+）之血清最高稀釋度為凝集反應(yīng)之效價(jià)。凝集價(jià)不應(yīng)低于血清原效價(jià)之半。并用傷寒Vi及O血清做凝集試驗(yàn)，應(yīng)與Vi血清有凝集，與O血清不凝集，或僅有較低凝集。1.2.3用37℃培育12～16小時(shí)的瓊脂培養(yǎng)物以生理鹽水稀釋成6億/ml、3億/ml、1.5億/ml及0.75億/ml等濃度的菌液（根據(jù)菌種毒力情況稀釋度可作更改也可增加稀釋度）。每1稀釋度的菌懸液腹腔注射體重14～16g之小白鼠，最少5只，每只0.5ml，觀察3天。使小白鼠于感染后3天內(nèi)全部死亡的最小劑量為1個(gè)致死量（LD），1LD應(yīng)不超過(guò)1.5億菌。1.2.4毒性試驗(yàn)用37℃培育18～20小時(shí)之瓊脂培養(yǎng)物混懸于磷酸鹽緩沖生理鹽水內(nèi)，56℃加溫1小時(shí)（或其他方法殺菌）。不加防腐劑。殺菌試驗(yàn)合格后稀釋為每ml含菌60、30及15億共3個(gè)濃度，每個(gè)濃度的菌懸液以0.5ml腹腔注射體重15～18g小白鼠5只，觀察3天，注射7.5億菌之小白鼠應(yīng)全部生存，注射15億菌之5只小白鼠可有3只死亡。1.2.5免疫力試驗(yàn)按《傷寒、副傷寒甲、乙三聯(lián)菌苗制造及檢定規(guī)程》1.2.5項(xiàng)進(jìn)行。1.2.6抗原性試驗(yàn)選體重2kg左右之健康家兔至少3只，用免疫力試驗(yàn)所用之菌液靜脈注射3次，每次0.5ml，第1次注射7億菌，第2次14億菌，第3次21億菌，每次間隔7天。末次注射后10～14天采血做定量凝集試驗(yàn)測(cè)定效價(jià)，2/3家兔血清之凝集效價(jià)不低于1∶12800為合格。1.3菌種保存菌種應(yīng)凍干保存，凍干菌種保存于2～8℃菌種凍干后應(yīng)抽取樣品按1.2項(xiàng)進(jìn)行檢查，合格后可使用3年，以后每次生產(chǎn)前必須檢查全部特性一次，合格者可繼續(xù)使用2年。2菌苗制造制造傷寒菌苗應(yīng)選用2個(gè)菌株。2.1菌種凍干菌種啟開(kāi)后應(yīng)檢查菌形、純度及玻片凝集試驗(yàn)（包括用Vi血清做玻凝集反應(yīng)），合格后即可使用，每啟開(kāi)1支凍干菌種用于生產(chǎn)不應(yīng)超過(guò)6代。2.2制造用培養(yǎng)基用pH7.2～7.4的馬丁瓊脂或肉湯瓊脂或其他適宜的培養(yǎng)基。2.3原液制造2.3.1接種可采用涂種，接種后置37℃培育18～24小時(shí)。2.3.2采集采集前應(yīng)逐瓶檢查，有雜菌者廢棄。刮取菌苔混懸于磷酸鹽緩沖生理鹽水中。2.3.3純菌試驗(yàn)原液采集后應(yīng)逐瓶取樣接種瓊脂斜面1管，于37℃培育2天，24～26℃1天，如有雜菌生長(zhǎng)應(yīng)廢棄。2.3.4殺菌原液中加入不超過(guò)1.1%±0.1%(ml/ml)的甲醛溶液殺菌。加殺菌劑后的原液應(yīng)放在37℃，不得超過(guò)7天，以后保存于2～8℃。2.3.5無(wú)菌試驗(yàn)純菌試驗(yàn)合格的原液，應(yīng)取樣接種不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基及普通瓊脂斜面各1管，放37℃培育5天，如有本菌生長(zhǎng)，可加培量復(fù)試一次；如有雜菌生長(zhǎng)應(yīng)廢棄。2.3.6原液合并無(wú)菌試驗(yàn)合格的原液按不同菌株或不同制造日期分別過(guò)濾合并。合并后應(yīng)加不超過(guò)0.5%（g/ml）苯酚或其他適宜防腐劑，保存于2～8℃。2.4原液檢定2.4.1鏡檢菌形應(yīng)正常，無(wú)雜菌。2.4.2凝集試驗(yàn)原液與相應(yīng)血清進(jìn)行凝集試驗(yàn)，其凝集效價(jià)不應(yīng)低于血清原效價(jià)之半。2.4.3無(wú)菌試驗(yàn)按《生物制品無(wú)菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。2.4.4濃度制定應(yīng)按中國(guó)細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量檢定部門會(huì)同測(cè)定濃度。2.4.5原液于無(wú)菌試驗(yàn)合格后與質(zhì)量檢定部門會(huì)同進(jìn)行，抽檢批數(shù)不應(yīng)少于生產(chǎn)批數(shù)的1/5。方法同1.2.5項(xiàng)，唯所用小白鼠每組至少15只，保護(hù)60%免疫小白鼠活存為合格。2.5原液保存原液應(yīng)保存于2～8℃。原液自采集之日起至用于菌苗稀釋時(shí)不得少于4個(gè)月，保存效期自采集之日起為2年半。2.6菌苗稀釋2.6.1稀釋前應(yīng)先將不同菌株所制之原液按菌數(shù)等量混合，但每個(gè)菌株所加的菌數(shù)與應(yīng)加菌數(shù)在總菌數(shù)不變的原則下允許兩個(gè)菌株之間在40%范圍內(nèi)互有增減。2.6.2菌苗稀釋稀釋菌苗用含0.25%～0.5%（g/ml）苯酚或其他適宜的防腐劑之磷酸鹽緩沖生理鹽水。2.6.3菌苗濃度每ml含傷寒菌3億2.7菌苗分批同組配合的原液用同一批稀釋液在同一日稀釋的各瓶菌苗為1批。大罐稀釋的應(yīng)按大罐分批，并按分裝機(jī)分為亞批。2.8檢定稀釋后每批應(yīng)逐瓶抽樣進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)及測(cè)定防腐劑含量（大罐稀時(shí)除外）。2.9分裝分裝后每亞批應(yīng)抽樣送質(zhì)量檢定部門進(jìn)行成品檢定。3成品檢定3.1物理化學(xué)檢查菌苗應(yīng)為乳白色懸液，pH值為6.8～7.4，不應(yīng)有搖不散的菌塊及異物。苯酚含量應(yīng)為0.25%～0.5%（g/ml）。3.2菌形及純度染色鏡檢，應(yīng)為革蘭氏陰性桿菌。至少觀察10個(gè)視野，平均每個(gè)視野內(nèi)不得有10個(gè)以上非典型菌（線狀、粗大或染色可穎桿菌），并不應(yīng)有雜菌。3.3無(wú)菌試驗(yàn)按《生物制品無(wú)菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。3.4安全試驗(yàn)3.4.1毒性試驗(yàn)用體重18～20g之健康小白鼠5只，每只腹腔注射菌苗0.5ml，或用體重350～450g之健康豚鼠2只，腹腔注射菌苗1.5ml，觀察7日，應(yīng)無(wú)死亡。3.4.2防腐劑試驗(yàn)用體重18～20g之健康小白鼠2只，每只皮下注射菌苗0.5ml，用苯酚作防腐劑的菌苗注射之小白鼠會(huì)發(fā)生戰(zhàn)栗癥狀，但不應(yīng)超過(guò)半小時(shí)，觀察7日，不得有局部膿腫或死亡。4保存與效期應(yīng)保存于2～8℃。自稀釋之日起效期為1年半。如原液保存超過(guò)1年稀釋，應(yīng)相應(yīng)縮短效期（自原液采集之日起總效期不得超過(guò)2年半）。傷寒菌苗使用說(shuō)明書本品系用傷寒菌培育后，取菌苔制成懸液，加甲醛殺菌，以磷酸鹽緩沖生理鹽水稀釋制成。用于預(yù)防傷寒。本品為乳白色的混懸液，含苯酚防腐劑，不應(yīng)含有異物或搖不散的凝塊。接種對(duì)象重點(diǎn)用于部隊(duì)、港口、鐵路沿線工地的工作人員，下水道、糞便、垃圾處理人員、飲食業(yè)、醫(yī)務(wù)防疫人員及水上居民，或有本病流行地區(qū)的人群。用法1．上臂外側(cè)三角肌附著處皮膚經(jīng)消毒后皮下注射。2．初次注射本菌苗者，需注射3次，每次間隔7～10天，注射劑量如下：1～6周歲：第1針0.2ml，第2針0.3ml，第3針0.3ml。6周歲以上～14周歲：第1針0.3ml，第2針0.5ml，第3針0.5ml。14周歲以上：第1針0.5ml，第2針1.0ml，第3針1.0ml。加強(qiáng)注射劑量與第3針相同。禁忌1．發(fā)熱，嚴(yán)重高血壓，心、肝、腎臟病及活動(dòng)性結(jié)核。2．孕婦，月經(jīng)及哺乳期。3．有過(guò)敏反應(yīng)病史者。反應(yīng)局部可出現(xiàn)紅腫，有時(shí)全身有寒熱或頭痛。注意事項(xiàng)1．用前搖勻。瓶?jī)?nèi)有搖不散的凝塊、異物，或安瓿有裂紋，曾經(jīng)發(fā)生過(guò)凍結(jié)者都不能使用。2．應(yīng)備有1∶1000腎上腺素，以供偶有發(fā)生休克時(shí)急救之用。保存保存于2～8℃暗處。吸附百日咳菌苗、白喉、破傷風(fēng)類毒素混合制劑制造及檢定規(guī)程本品系由百日咳菌苗原液、精制白喉類毒素及精制破傷風(fēng)類毒素用氫氧化鋁吸附制成。供兒童預(yù)防百日咳、白喉及破傷風(fēng)之用。1抗原要求1.1百日咳菌苗原液應(yīng)符合附錄1《百日咳菌苗原液制造及檢定要求》中2.4項(xiàng)的規(guī)定。1.2精制白喉類毒素應(yīng)符合《吸附精制白喉類毒素制造及檢定規(guī)程》中4項(xiàng)的要求。1.3精制破傷風(fēng)類毒素應(yīng)符合《吸附精制破傷風(fēng)類毒素制造及檢定規(guī)程》中4項(xiàng)的要求。2制造2.1配方每ml制劑中各種抗原成份含量如下：百日咳菌45億～90億精制白喉類毒素20Lf精制破傷風(fēng)類毒素5Lf2.2吸附劑配制，見(jiàn)《吸附精制破傷風(fēng)類毒素制造及檢定規(guī)程》5項(xiàng)。2.3氫氧化鋁稀釋以蒸餾水按吸附后之總量將氫氧化鋁原液稀釋成1.0～1.5mg/ml。硫柳汞含量不超過(guò)0.01%（g/ml），氯化鈉含量補(bǔ)足至0.85%（g/ml），高壓蒸汽滅菌。2.4吸附按計(jì)算量將精制白喉類毒素、精制破傷風(fēng)類素及百日咳菌苗原液加入稀釋好的吸附劑內(nèi)。調(diào)節(jié)pH至5.8～7.2。2.5分批同批吸附劑同批配合的原液同次吸附的制品為1批。如用大罐吸附時(shí)，所用抗原和吸附劑可以多批混合（精制類毒素不超過(guò)3批），每罐為1批。3成品檢定3.1物理化學(xué)檢查3.1.1振搖后應(yīng)呈均勻乳白色混懸液。不應(yīng)有搖不散的凝塊或異物。3.1.2pH值應(yīng)為5.8～7.2。3.1.3氯化鈉含量為0.75%～0.9%(g/ml)。3.1.4硫柳汞含量為1.0%～0.5%(mg/ml)。3.1.5硫柳汞含量不超過(guò)0.01%(g/ml)。3.2鑒別試驗(yàn)抽取樣品，另枸櫞酸鈉或用其他適宜方法將吸附劑溶解后，離心沉淀百日咳菌體和殘留的吸附劑，按《吸附精制白喉類毒素制造及檢定規(guī)程》中7.6項(xiàng)、《吸附精制破傷風(fēng)類毒素制造及檢定規(guī)程》中7.6項(xiàng)和附錄1《百日咳菌苗原液制造及檢定要求》中2.4.3項(xiàng)進(jìn)行鑒別試驗(yàn)。3.3無(wú)菌試驗(yàn)按《生物制品無(wú)菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。3.4毒性試驗(yàn)應(yīng)符合附錄1《百日咳菌苗原液制造及檢定要求》中2.4.53.5安全試驗(yàn)3.5.1小白鼠法用體重18～20g之健康小白鼠5只，每只皮下注射檢品0.5ml觀察7日，不得有局部膿腫或死亡。3.5.2用體得300～400g豚鼠，每批制品不少于4只，每只皮下注射2.5ml，分兩側(cè)，每側(cè)1.25ml，應(yīng)符合《吸附精制白喉類毒素制造及檢定規(guī)程》中4.4項(xiàng)及《吸附精制破傷風(fēng)類毒素制造及檢定規(guī)程》中4.5項(xiàng)要求。3.6效力試驗(yàn)3.6.1百日咳菌苗免疫力試驗(yàn)每3批抽1批進(jìn)行，應(yīng)符合附錄1《百日咳菌苗原液制造及檢定要求》中1.2.5項(xiàng)的規(guī)定。3.6.2白喉及破傷風(fēng)類毒素的效力試驗(yàn)每更換1批類毒素時(shí)進(jìn)行。取體重300～400g豚鼠4只，每只皮下注射0.5ml，第30天采血，將分離的血清等量混合，進(jìn)行白喉及破傷風(fēng)抗毒素單位測(cè)定。3.6.2.1白喉抗毒素單位測(cè)定用Lr/300家兔皮內(nèi)法，要求每ml血清達(dá)到0.25IU。3.6.2.2破傷風(fēng)抗毒素單位測(cè)定用L+/100小白鼠皮下法，要求每ml血清達(dá)到0.5IU。3.6.2.3白喉類毒素的效力試驗(yàn)亦可采用攻毒法。取體重300～350g豚鼠5只以上，每只皮下注射0.5ml。第30天各皮下攻擊白喉毒素200個(gè)MLD，觀察7天，豚鼠死亡不得超過(guò)20%；同時(shí)另取體重240～270g豚鼠3只，各皮下注射1個(gè)MLD毒素作為對(duì)照，2只對(duì)照豚鼠應(yīng)發(fā)病并于96小時(shí)內(nèi)死亡，允許另1只較晚死亡或發(fā)病。3.6.2.4亦可按WHO推薦的效力檢定方法（見(jiàn)《吸附精制白喉類毒素制造及檢定規(guī)程》附錄和《吸附精制破傷風(fēng)類毒素制造及檢定規(guī)程》附錄）。4保存與效期應(yīng)保存于2～8℃。自吸附之日起效期為1年半。附錄1百日咳菌苗原液制造及檢定要求本品系用百日咳第Ⅰ相菌種經(jīng)培育后取菌體制成懸液，加適當(dāng)殺菌劑，以磷酸鹽緩沖生理鹽水稀釋制成，每ml含菌45億～90億。用于制備百日咳菌苗、白喉、破傷風(fēng)類毒素混合制劑。1菌種1.1制造百日咳菌苗之菌種、檢定用的Ⅰ相診斷血清、百日咳分型血清及百日咳參考菌苗，由中國(guó)藥品生物制品檢定所分發(fā)或經(jīng)同意。1.2菌種檢定1.2.1培養(yǎng)特性于包-姜（Bordet-Gengou）氏或其他適宜的培養(yǎng)基上培育，各菌株應(yīng)具有典型的形態(tài)及生化特性。1.2.2血清學(xué)特性將35～37℃培育40～48小時(shí)的菌苔，混懸于生理鹽水或磷酸鹽緩沖生理鹽水內(nèi)，使每ml含菌20億個(gè)，與Ⅰ相血清做定量凝集反應(yīng)，凝集效價(jià)應(yīng)達(dá)到血清原效價(jià)之半。同時(shí)與單價(jià)分型血清做定量凝集反應(yīng)，其型別應(yīng)與該菌種標(biāo)定型別相同。1.2.3皮膚壞死試驗(yàn)用健康家兔或豚鼠至少2只，用培育40～48小時(shí)的菌苔混懸于磷酸鹽緩沖生理鹽水內(nèi)，然后稀釋為幾個(gè)不同濃度的菌液，分別用每一稀釋度的菌液注射于家兔或豚鼠的皮內(nèi)0.1ml，經(jīng)72小時(shí)觀察反應(yīng)。如2只家兔或豚鼠中有1只注射0.4億個(gè)菌以下的菌液部位出現(xiàn)出血性壞死者為陽(yáng)性反應(yīng)，判為合格。1.2.4毒力試驗(yàn)用體重16～18g之小白鼠至少3組，每組至少10只，在麻醉狀態(tài)下從鼻腔滴入經(jīng)培育40～48小時(shí)，以磷酸鹽緩沖生理鹽水稀釋的菌液0.05ml觀察14天，記錄小白鼠生死情況，按ReedMuench法計(jì)算LD50，LD50菌數(shù)不超過(guò)1.2億判為合格。1.2.5免疫力試驗(yàn)1.2.5.1方法按附錄2《百日咳菌苗原液免疫力試驗(yàn)方法》進(jìn)行。1.2.5.2判定試驗(yàn)菌液每個(gè)接種劑量的免疫效價(jià)應(yīng)不少于4.0IU。若試驗(yàn)菌液的效價(jià)低于此要求時(shí)，可復(fù)試，其結(jié)果的幾何平均值（如用概率分析法時(shí)，應(yīng)用加權(quán)幾何平均值）≥4.0IU，仍判為合格。1.3菌種保存1.3.1菌種應(yīng)用凍干法保存。1.3.2凍干菌種應(yīng)保存在2～8℃。凍干后抽樣按1.2項(xiàng)進(jìn)行檢查，合格的菌種可使用2年，以后每年檢查1次，如仍合格可繼續(xù)使用1年。2.制造2.1制造百日咳菌苗原液至少應(yīng)選用2個(gè)菌株，制成的菌苗應(yīng)含1、2、3型因子。2.2制造百日咳菌苗原液用活性炭半綜合培養(yǎng)基或其他適宜的培養(yǎng)基。如用液體培養(yǎng)基，不得含有已知引起人體毒性或變態(tài)反應(yīng)的成分。2.3原液制造2.3.1菌種凍干菌種啟開(kāi)后接種于改良包-姜氏或活性炭半綜合培養(yǎng)基或其他適宜的培養(yǎng)基上。于35～37℃培育不超過(guò)72小時(shí)，以后各代不超過(guò)48小時(shí)，傳代菌種保存不得超過(guò)14天，凍干菌種啟開(kāi)后用于生產(chǎn)時(shí)不應(yīng)超過(guò)10代。2.3.2培育可用固體法或液體法培育。培育時(shí)間不得超過(guò)48小時(shí)，經(jīng)檢查為純菌后，用適當(dāng)方法收集菌體，混懸于pH值為7.0～7.4的磷酸鹽緩沖生理鹽水中。2.3.3殺菌原液可用不超過(guò)0.1%（ml/ml）甲醛溶液殺菌，放37℃2～3天。亦可用其他適宜的殺菌劑和殺菌方法殺菌。2.3.4純菌試驗(yàn)原液應(yīng)逐瓶（罐）抽樣接種普通瓊脂斜面及普通血液瓊脂斜面（或活性炭半綜合培養(yǎng)基）各1管，放35～37℃培育2天，然后放24～26℃1天。有雜菌生長(zhǎng)者應(yīng)廢棄。2.3.5原液合并固體法工藝生產(chǎn)經(jīng)純菌試驗(yàn)合格的原液應(yīng)進(jìn)行合并。不同菌株不同日期制造2的原液應(yīng)分別合并。合并后，可加適量防腐劑，并保存于2～8℃。2.4原液檢定2.4.1濃度測(cè)定每瓶原液應(yīng)按中國(guó)細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量檢定部門會(huì)同測(cè)定濃度。稀釋菌苗時(shí)即按此濃度計(jì)算。2.4.2鏡檢每瓶原液取樣稀釋至成品濃度，涂片染色鏡檢，應(yīng)為革蘭氏陰性球桿菌。至少觀察10個(gè)視野，應(yīng)無(wú)雜菌。2.4.3凝集反應(yīng)每瓶原液按1.2.2項(xiàng)與Ⅰ相血清做定量凝集試驗(yàn)，其凝集效價(jià)應(yīng)達(dá)血清原效價(jià)之半，如僅達(dá)到或低于血清原效價(jià)1/4時(shí)，應(yīng)作免疫力試驗(yàn)，合格后方可使用；同時(shí)應(yīng)用單價(jià)分型血清做定性凝集試驗(yàn)，其所含型別應(yīng)與制造原液的菌種型別相同。2.4.4無(wú)菌試驗(yàn)每瓶原液除按《生物制品無(wú)菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)外，并做特異無(wú)菌試驗(yàn)。如特異無(wú)菌試驗(yàn)有百日咳菌生長(zhǎng)，可復(fù)試一次，若仍有百日咳菌生長(zhǎng)，原液應(yīng)判為不合格。2.4.5毒性試驗(yàn)2.4.5.1方法按附錄3《百日咳菌苗原液毒性試驗(yàn)方法》進(jìn)行。2.4.5.2判定試驗(yàn)組小白鼠注射后72小時(shí)的總體重不少于注射前總體重，第7天小白鼠增加的體重不少于對(duì)照組增加體重的60%，并不得有死亡，該批原液毒性試驗(yàn)判為合格。試驗(yàn)結(jié)果達(dá)不到上述要求，可復(fù)試一次。仍達(dá)到不過(guò)要求，可將原液放置1.2.5項(xiàng)方法及要求進(jìn)行。2.5原液保存應(yīng)保存于2～8℃。原液自采集之日起至成品發(fā)出不得少于4個(gè)月。原液自采集之日起效期為3年。附錄2百日咳菌苗原液免疫力試驗(yàn)方法1免疫1.1動(dòng)物選用體重10～12g同性或雌雄性各半的健康NIH小白鼠。將動(dòng)物隨機(jī)分為三組，每組16只或20只（同性或雌雄性各半，為保證攻擊后有16只或20只小白鼠，可適當(dāng)多免疫幾只小白鼠），同時(shí)飼養(yǎng)健康小白鼠55只，備做對(duì)照用。1.2免疫原稀釋將百日咳原液用生理鹽水或pH7.3±0.1磷酸鹽緩沖生理鹽水稀釋至成品菌苗濃度的1/2，然后再稀釋7.5×、37.5×、187.5×，百日咳參考菌苗稀釋至每ml含8IU，然后再稀釋成每ml含1.0IU（0.125ml）、0.2IU（0.025ml）及0.04IU（0.005ml）。1.3免疫方法將不同稀釋度的免疫原分別免疫小白鼠，每只小白鼠各腹腔注射0.5ml。2攻擊菌及攻擊菌液的制備2.1菌種小白鼠腦內(nèi)攻擊用58030（18323）菌株。2.2培養(yǎng)基可用包-姜氏培養(yǎng)基（含羊血20%～30%）或其他適宜的培養(yǎng)基。2.3培養(yǎng)溫度及時(shí)間放35～37℃培育，第一代不超過(guò)72小時(shí)，攻擊時(shí)菌種的培育時(shí)間為20～24小時(shí)。原代菌種放2～8℃可保存2周。2.4攻擊菌液的制備將培育20～24小時(shí)的菌苔經(jīng)肉眼檢查為純菌后，刮入生理鹽水或pH7.3±0.1緩沖生理鹽水，用滅菌脫脂棉過(guò)濾，測(cè)定濃度，然后用pH7.0～7.2水解酷素、蛋白胨水或肉湯稀釋成每0.03ml含菌8萬(wàn)，作為試驗(yàn)組的攻擊菌液，然后再連續(xù)稀釋，使每0.03ml分別含8000、800、80及8個(gè)菌，以上5個(gè)不同稀釋度的菌液，作為對(duì)照組的攻擊菌液。2.5工作起止時(shí)間自攻擊菌液制備（開(kāi)始刮菌）至注射完最后1只小白鼠不得超過(guò)2.5小時(shí)。2.6活菌計(jì)數(shù)在攻擊前后，可將0.03ml含8個(gè)菌的攻擊菌液，接種于包一姜氏培養(yǎng)基或其他適宜的培養(yǎng)基平皿中，每個(gè)平皿0.2ml，每次不得少于2個(gè)平皿，其菌落形成單位約為濁度測(cè)定的1/4。3攻擊動(dòng)物免疫后14天，每只小白鼠腦內(nèi)攻擊0.03ml菌液（含8萬(wàn)個(gè)菌），用0.25ml注射器，4號(hào)針頭。在試驗(yàn)組攻擊后再進(jìn)行對(duì)照組毒力測(cè)定，對(duì)照組每稀釋度攻擊10只小白鼠。4記錄結(jié)果動(dòng)物攻擊后觀察14天。攻擊后第2天，將試驗(yàn)組動(dòng)物處理成每組16只或20只。以后逐日觀察動(dòng)物并記錄死亡數(shù)，最初3天死亡的動(dòng)物不作統(tǒng)計(jì)，至第14天有麻痹、頭部腫脹、弓背及明顯聳毛的動(dòng)物按死亡計(jì)算。5結(jié)果計(jì)算5.1按Wilson-Worcester氏法計(jì)算參考菌苗及待檢菌苗的ED50±SD%，每個(gè)ED50標(biāo)準(zhǔn)差的范圍一般應(yīng)為64%～156%。5.2按Reed-Muench氏法計(jì)算對(duì)照組LD50，1個(gè)LD50的菌數(shù)應(yīng)不高于800個(gè)菌。5.3計(jì)算均質(zhì)性因子“α”。5.4IU計(jì)算待檢原液每ml應(yīng)含IU=參考菌苗ED50/待檢原液ED50×參考菌苗每ml的IU數(shù)6效力評(píng)價(jià)百日咳原液按成品菌苗嘗試稀釋后，每個(gè)接種劑量的免疫效價(jià)應(yīng)不少于4.0IU。附錄3百日咳菌苗原液毒性試驗(yàn)方法1選用體重14～16g健康小白鼠，每批原液不少于10只（同性或雌雄性各半）。2以滅菌生理鹽水或pH7.3±0.1磷酸鹽緩沖生理鹽水（含成品菌苗相同量的防腐劑），將百日咳原液稀釋至成品菌苗濃度的1/2。3每只小白鼠腹腔注射稀釋的原液0.5ml。另取同數(shù)量同體重的小白鼠（同性或雌雄性各半），腹腔注射稀釋用生理鹽水或pH7.3±0.1磷酸鹽緩沖生理鹽水0.5ml作為對(duì)照。4注射后的小白鼠應(yīng)逐日觀察，并于喂食后2小時(shí)進(jìn)行稱重。5于注射前、注射后72小時(shí)及7天，分別稱試驗(yàn)組及時(shí)對(duì)照組小白鼠的體重。6試驗(yàn)組小白鼠注射后72小時(shí)的總體重不少于注射前的總體重；7天小白鼠平均增加的體重不少于對(duì)照組平均增加體重的60%，并不得有死亡，該批原液毒性試驗(yàn)判為合格。7試驗(yàn)結(jié)果若達(dá)不到上述要求，可進(jìn)行復(fù)試，仍達(dá)不到上述要求，原液可放置2～8℃保存3～4個(gè)月再進(jìn)行復(fù)試，如仍達(dá)不到上述要求，該批原液的毒性判為不合格。吸附百日咳菌苗、白喉、破傷風(fēng)類毒素混合制劑使用說(shuō)明書本品系由百日咳菌苗原液、精制白喉類毒素及精制破傷風(fēng)類毒素用氫氧化鋁吸附制成。每ml中含百日咳菌8個(gè)效力單位，精制白喉類毒素20Lf、精制破傷風(fēng)類毒素5Lf。供兒童預(yù)防百日咳、白喉及破傷風(fēng)之日。本品為乳白色懸液，含硫柳汞防腐劑，放置后菌體易下沉，但經(jīng)振搖后能均勻分散。接種對(duì)象3個(gè)月～6周歲兒童。用法1.臀部外上方1/4處或上臂外側(cè)三角肌附著處皮膚經(jīng)消毒后肌內(nèi)注射。2.免疫程序與劑量自3月齡開(kāi)始免疫，至12月齡完成三針次免疫，每針間隔4～6周。18～24月齡注射第4針。每次注射劑量為0.5ml。禁忌有癲癇、神經(jīng)系統(tǒng)疾患及抽風(fēng)史者禁用。急性傳染病（包括恢復(fù)期）及發(fā)熱者暫緩注射。反應(yīng)注射本品后，局部可有紅腫、疼痛、發(fā)癢，或有低熱、疲倦、頭痛等，一般不須特殊處理即行消退，如有嚴(yán)重反應(yīng)應(yīng)及時(shí)診治。注意事項(xiàng)1.使用時(shí)應(yīng)充分搖勻，如出現(xiàn)搖不散之凝塊，有異物，安瓿有裂紋，制品曾經(jīng)凍結(jié)，標(biāo)簽不清和過(guò)期失效者不可使用。2.注射后，局部可能有硬結(jié)，可逐步吸收。注射第2針時(shí)應(yīng)更換另側(cè)部位。3.應(yīng)備1∶1000腎上腺素，供偶有發(fā)生休克時(shí)急救用。4.注射第一針后出現(xiàn)高熱、驚厥等異常情況者，不再注射第二針。保存應(yīng)保存于2～8℃暗處，不得凍結(jié)。凍干皮內(nèi)注射用卡介苗制造及檢定規(guī)程本品系卡介菌經(jīng)培育后凍干制成。用于預(yù)防結(jié)核病。1菌種1.1制造卡介苗的菌種，應(yīng)由中國(guó)藥品生物制品檢定所分發(fā)或經(jīng)同意。嚴(yán)禁使用通過(guò)動(dòng)物的菌種制造卡介苗。1.2如果采用次代種子批，單批收獲培養(yǎng)物的總代數(shù)不得超過(guò)12代（包括在馬鈴薯培養(yǎng)基上培育的代數(shù)與在液體蘇通培養(yǎng)基上的代數(shù)）。1.3菌種檢定新收到的菌種或新制備種子批應(yīng)進(jìn)行下列檢定。1.3.1培養(yǎng)特性卡介菌在蘇通培養(yǎng)基上發(fā)育良好。培育溫度在37～39℃之間。抗酸染色應(yīng)為抗酸桿菌。在蘇通馬鈴薯培養(yǎng)基上發(fā)育的卡介菌應(yīng)是干皺成團(tuán)略呈淺黃色。在牛膽汁馬鈴薯培養(yǎng)基上為淺灰色粘膏狀菌苔。在雞蛋培養(yǎng)基上有突起的皺型和擴(kuò)散型兩類菌落，且?guī)\黃色。在蘇通培養(yǎng)基上卡介菌應(yīng)浮于表面，為多皺微帶黃色的菌膜。1.3.2毒力試驗(yàn)用結(jié)素試驗(yàn)（PPD100IU）陰性，體重300～400g的同性健康豚鼠4只，各腹腔注射1ml菌液（5mg/ml），每周稱體重，4～5周后解剖檢查，大網(wǎng)膜上可出現(xiàn)膿皰，腸系膜淋巴結(jié)及脾可能腫大，肝及其他臟器應(yīng)無(wú)肉眼可見(jiàn)的病變。1.3.3毒力試驗(yàn)用結(jié)素試驗(yàn)（PPD100IU）陰性，體重300～400g的同性健康豚鼠6只，于肌內(nèi)側(cè)皮下各注射1ml菌液（10mg/ml），注射前稱體重，注射后每周觀察1次注射部位及局部淋巴結(jié)的變化。每2周稱體重1次。6周時(shí)解剖3只，滿3個(gè)月將另3只豚鼠解劑，檢查各臟器應(yīng)無(wú)肉眼可見(jiàn)的結(jié)核病變。若有可疑病灶時(shí)，應(yīng)作涂片和組織切片檢查，并采取部分病灶磨碎，加少量生理鹽水混勻，皮下注射2只豚鼠。若證明系結(jié)核病變，該菌種即應(yīng)廢棄。試驗(yàn)經(jīng)過(guò)詳細(xì)記錄備查。若未滿3個(gè)月試驗(yàn)豚鼠因其他病患死亡應(yīng)解剖檢查，依上法處理。若死亡2只以上應(yīng)重試。1.3.4免疫力試驗(yàn)用原代種子批以1/100人份的劑量免疫豚鼠，以103～104強(qiáng)毒人型結(jié)核分枝桿菌感染，免疫組與對(duì)照組動(dòng)物的病變指數(shù)及脾臟毒菌分離數(shù)的對(duì)數(shù)值經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，應(yīng)有顯著差異。如無(wú)條件，可送中國(guó)藥品生物制品檢定所進(jìn)行。1.4菌種保存凍干菌種保存于2～8℃。2菌苗制造2.1卡介苗制造室必須與其他生物制品部門及實(shí)驗(yàn)室分開(kāi)。所需用具如高壓鍋、冰箱及玻璃器皿等，均須單獨(dú)設(shè)置并專用?？ń槊缰圃臁b及保存過(guò)程均須避光。卡介苗制造的工作人員及經(jīng)常進(jìn)入卡介苗制造室的人員，必須身體健康，經(jīng)X線檢查無(wú)結(jié)核病，且以后每年經(jīng)X線檢查1～2次，可疑者暫不在卡介苗制造室工作，其檢查記錄必須保存?zhèn)洳椤?.2制造用培養(yǎng)基生產(chǎn)用培養(yǎng)基不得含有能使人產(chǎn)生毒性或變態(tài)反應(yīng)的物質(zhì)。培養(yǎng)基所用的原料應(yīng)符合《中國(guó)生物制品主要原材料試行標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定。2.3菌種傳代與培養(yǎng)凍干菌種在蘇通馬鈴薯培養(yǎng)基、膽汁馬鈴薯培養(yǎng)基以及液體蘇通培養(yǎng)基上每傳一次為一代。馬鈴薯培養(yǎng)基上培育的菌種放冰箱保存不超過(guò)2個(gè)月。用于生產(chǎn)菌苗的培養(yǎng)物的總代數(shù)不超過(guò)12代。2.4原液制造2.4.1收集培養(yǎng)瓶應(yīng)逐瓶檢查，若有污染、濕膜、混濁等情況應(yīng)廢棄。收集菌膜壓干，移入盛有不銹鋼珠瓶?jī)?nèi)，鋼珠與菌體的比例應(yīng)根據(jù)研磨機(jī)轉(zhuǎn)速控制在一適宜的范圍，并盡可能在低溫下研磨。加入適量無(wú)致敏原保護(hù)液稀釋成一定濃度的原液。2.4.2稀釋用中國(guó)藥品生物制品檢定所發(fā)給的凍干卡介苗參考比濁標(biāo)準(zhǔn)，以分光光度法或其他適宜方法測(cè)定原液濃度，用保護(hù)液將原液稀釋成1.0mg/ml。2.4.3用于制造卡介苗的培養(yǎng)物、原液、以及稀釋后的菌苗均應(yīng)按《生物制品無(wú)菌試驗(yàn)規(guī)程》抽樣做純菌試驗(yàn)。2.5菌苗分批用同一代菌種同時(shí)制造的菌苗為1批，稀釋為數(shù)瓶者，按瓶分亞批。2.6分裝分裝過(guò)程中勿使苗混合均勻。每10人份卡介苗應(yīng)為0.5±0.1mg。3凍干菌苗原液分裝后應(yīng)立即進(jìn)行凍干。干燥完畢后立即進(jìn)行真空封口。亦可充氮封口。4成品檢定4.1物理化學(xué)檢查凍干卡介苗應(yīng)為白色疏松體或粉末狀。加入稀釋液后，應(yīng)于3分鐘內(nèi)完全溶解成均勻懸液。殘余水分不應(yīng)超過(guò)3%。包裝前應(yīng)每支安瓿檢查真空，不合格的安瓿應(yīng)廢棄。4.2鑒別試驗(yàn)每批菌苗須做涂片檢查，抗酸染色應(yīng)是抗酸桿菌。4.3純菌試驗(yàn)每亞批菌苗抽樣按《生物制品無(wú)菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。4.4活菌計(jì)數(shù)同一代菌種制造的各批凍干卡介苗應(yīng)抽1批做干前活菌計(jì)數(shù)。同一批菌種制造的各亞批菌苗均應(yīng)做干后活菌計(jì)數(shù)，抽安瓿5支稀釋混合。凍干菌苗活菌數(shù)應(yīng)在100萬(wàn)/mg以上?？膳c熱穩(wěn)定性試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行。4.5熱穩(wěn)定性試驗(yàn)取凍干后菌苗放置37℃28天進(jìn)行加速失活試驗(yàn)，測(cè)定活菌數(shù)，與4℃保存的同一批菌苗同時(shí)進(jìn)行比較，計(jì)算降低的百分離。加溫放置制品的活菌數(shù)應(yīng)不少于冷藏菌苗的2%，但不得低于20萬(wàn)/mg。此試驗(yàn)可與參考菌苗同時(shí)進(jìn)行（參考菌苗加入試驗(yàn)的目的為檢查培養(yǎng)基的質(zhì)量）。每一機(jī)柜凍干菌勒應(yīng)抽樣進(jìn)行此項(xiàng)試驗(yàn)。4.6安全試驗(yàn)同一代菌種生產(chǎn)的各批凍干卡介苗應(yīng)抽1個(gè)亞批做安全試驗(yàn)。用結(jié)素試驗(yàn)（PPd10IU）陰性，體重300～400g的同性健康豚鼠6只。每只皮下注射相當(dāng)于50人份的凍干皮內(nèi)注射用卡介苗，每2周稱重一次，觀察6周后，解剖檢查每只動(dòng)物，若肝、脾、肺等臟器無(wú)結(jié)核病變，該批菌苗即可發(fā)出使用。若有可疑病灶時(shí)，應(yīng)按1.3.3項(xiàng)處理。5保存與效期保存于2～8℃暗處。自首次活菌計(jì)數(shù)結(jié)束之日起效期為1年。凍干皮內(nèi)注射用卡介苗使用說(shuō)明書嚴(yán)禁皮下或肌內(nèi)注射本品系卡介菌經(jīng)培育后凍干制成。用于預(yù)防結(jié)核病。本品為白色疏松體或粉末，按規(guī)定量加入稀釋液后，應(yīng)于3分鐘內(nèi)完全溶解成均勻懸液。接種對(duì)象出生3個(gè)月以內(nèi)的嬰兒或用5IUPPD或5IU稀釋舊結(jié)核菌素試驗(yàn)陰性的兒童（PPD或結(jié)素試驗(yàn)后48～72小時(shí)局部硬結(jié)在5mm以下者為陰性）。用法1.菌苗稀釋用滅菌的1ml注射器將隨制品附發(fā)的稀釋液定量加入凍干皮內(nèi)注射用卡介苗安瓿中（）稀釋液應(yīng)有足夠的附加量，以保證吸出量與標(biāo)示量一致），放置約1分鐘，搖動(dòng)安瓿使之溶化后，用注射器來(lái)回抽取數(shù)次，使充分混勻，每支安瓿自稀釋時(shí)起，必須在半小時(shí)內(nèi)用守，以防污染。2.接種方法先用75%酒精消毒上臂外側(cè)三角肌中部略下處的皮膚，然后用滅菌的1ml藍(lán)心注射器（25～26號(hào)針頭）吸取搖勻的菌苗，皮內(nèi)注射0.1ml。反應(yīng)接種后2周左右，局部可出現(xiàn)紅腫浸潤(rùn)，若隨后化膿，形成小潰瘍，可用1%龍膽紫涂抹，以防感染。一般8～12周后結(jié)痂，如遇局部淋巴結(jié)腫大可用熱敷處理，如已軟化形成膿皰，可用滅菌注射器抽膿。如已穿孔，則請(qǐng)醫(yī)生檢查，可用10%磺胺軟膏或20%對(duì)氨基柳酸軟膏處理。禁忌凡患有結(jié)核病、急性傳染病、腎炎、心臟病、濕疹、免疫缺陷癥或其他皮膚病者均不予接種。注意事項(xiàng)1.安瓿有裂紋和過(guò)期失效者不可使用。2.接種對(duì)象必須詳細(xì)登記姓名、性別、年齡、住址、菌苗批號(hào)及亞批號(hào)、制造單位和接種日期。3.接種卡介苗的注射器應(yīng)專用，不得用作其他注射，以防止產(chǎn)生化膿反應(yīng)。4.使用時(shí)制品注意避光。保存保存于2～8℃暗處。A群腦膜炎球菌多糖菌苗制造及檢定規(guī)程A群腦膜炎球菌多糖菌苗系用A群腦膜炎球菌液體培養(yǎng)后，經(jīng)提純獲得的多糖抗原凍干制成。供預(yù)防A群腦膜炎球菌引起的流行性腦脊髓膜炎之用。1菌種1.1菌種來(lái)源制造用的菌種及檢定菌種用的各種診斷血清，由中國(guó)藥品生物制品檢定所分發(fā)或經(jīng)同意。1.2

菌種檢定1.2.1

形態(tài)及培養(yǎng)特性將待檢的菌種接種在含10%羊血普通瓊脂培養(yǎng)基上，腦膜炎球菌在25℃不生長(zhǎng)。35～37℃二氧化碳的環(huán)境中培養(yǎng)16～20小時(shí)，涂片鏡檢應(yīng)為革蘭氏陰性雙球菌，亦可有單個(gè)陰性球菌。平皿分離培養(yǎng)顯現(xiàn)光滑、濕潤(rùn)、灰白色的菌落、菌苔易取下，在生理鹽水中呈均勻混懸液。1.2.2

生化反應(yīng)接種葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、果糖及蔗糖，于35～37℃培養(yǎng)5～7日，發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。1.2.3

血清學(xué)特性將在35～37℃培養(yǎng)16～20小時(shí)的菌苔，混懸于0.5%（ml/ml）甲醛生理鹽水中，或56℃加熱30分鐘殺菌后，使每ml含菌10億～20億，與同群血清做定量凝集反應(yīng)，放置35～37℃過(guò)夜，次日再放置室溫2小時(shí)觀察結(jié)果，以肉眼可見(jiàn)清晰凝集現(xiàn)象之血清最高稀釋度（+）為凝集反應(yīng)效價(jià)，必須達(dá)到原血清效價(jià)之半。1.3

菌種保存1.3.1

菌種應(yīng)凍干保存。凍干后抽樣按上述各項(xiàng)要求進(jìn)行檢查，合格后可作為種子批菌種用于生產(chǎn)。1.3.2

種子批菌種可低溫保存或置2～8℃冰箱中，生產(chǎn)前應(yīng)檢查菌種的全部特性，合格后方可用于生產(chǎn)。2制造2.1菌種將生產(chǎn)用種子批菌種啟開(kāi)后，接種在10%羊血瓊脂或其他適宜培養(yǎng)基上，放35～37℃二氧化碳環(huán)境培養(yǎng)一般不超過(guò)18小時(shí)，第2～4代菌種可用適宜的固體或液體培養(yǎng)基，35～37℃固體培養(yǎng)基培養(yǎng)不超過(guò)18小時(shí)，液體培養(yǎng)基培養(yǎng)不超過(guò)12小時(shí)。菌種自啟開(kāi)后最多不能超過(guò)5代。2.2

培養(yǎng)基生產(chǎn)多糖菌苗可選用適宜培養(yǎng)基。生產(chǎn)用的液體培養(yǎng)基不應(yīng)含有能與加入的十六烷基三甲基溴化銨形成沉淀的成分。培養(yǎng)基中不應(yīng)含有對(duì)人體有害或其他過(guò)敏物質(zhì)。2.3

培養(yǎng)采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中及殺菌前取樣進(jìn)行純菌試驗(yàn)，涂片做革蘭氏染色鏡檢，如發(fā)現(xiàn)污染雜菌，應(yīng)廢棄。培養(yǎng)物于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后或靜止期前期收獲。一般培養(yǎng)6～8小時(shí)（隨菌種接種量及使用培養(yǎng)基種類的不同而異）為宜。2.4

殺菌培養(yǎng)物加入甲醛溶液殺菌，或加熱56℃10分鐘，以確保殺菌完全及不損傷流腦多糖為宜。2.5

去核酸殺菌完成后，離心去菌體收集上清液，于其中加入十六烷基三甲溴化銨，充分混勻形成沉淀。放置適當(dāng)時(shí)間離心，收集沉淀物。沉淀物中加入氯化鈣溶液，使其最終濃度為1mol/L，搖動(dòng)或攪拌1小時(shí)，使多糖十六烷基三甲基溴化銨解離，加入乙醇至最終濃度為25%（ml/ml）。冷庫(kù)靜置1～3小時(shí)或過(guò)夜，離心去沉淀，收集澄清的上清液。2.6

沉淀多糖于上述上清液中加入冷卻乙醇至最終濃度為80%（ml/ml），充分振搖。使多糖沉淀，離心收集沉淀多糖，然后用無(wú)水乙醇及兩酮各洗二次以上，將沉淀物（多糖粗制品）保存在-20℃以下待進(jìn)一步提取。2.7多糖的精制將粗制品溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達(dá)10～20mg/ml，然后按1∶2容量用冷酚（100g結(jié)晶酚溶于40ml1∶10飽和醋酸鈉溶液）提取2～3次，提取時(shí)充分振搖。然后離心收集上清液，并用0.1mol/L氯化鈣溶液或適宜的溶液透析。必要或有條件時(shí)也可用其他方法去除內(nèi)毒素活性。再加乙醇至最終濃度為75%～80%（ml/ml）。離心收集沉淀物用無(wú)水乙醇及丙酮各洗二次以上。離心后傾去上清液，用無(wú)熱原蒸餾水溶解沉淀的多糖，所得溶液即為提取之多糖，經(jīng)除菌過(guò)濾后，取樣進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)及各項(xiàng)生化測(cè)定。提取過(guò)程應(yīng)盡量在15℃以下進(jìn)行。提純多糖應(yīng)保存在-20℃或以下。3半成品檢定3.1化學(xué)測(cè)定按《生物制品化學(xué)檢定規(guī)程》進(jìn)行。每批多糖應(yīng)測(cè)定固體總量，計(jì)算干重。3.1.1蛋白質(zhì)含量每批提純多糖抗原的蛋白質(zhì)含量（按重量）應(yīng)小于10mg/g。按Lowry法，用牛血清白蛋白作對(duì)照。3.1.2

核酸含量每批提純多糖的核酸含量（按重量）應(yīng)小于10mg/g。按分光光度法，核酸在260nm處的吸收系數(shù)（E1%1cm）為200。3.1.3

O-乙酰基含量測(cè)定每批提純多糖的O-乙酰基含量應(yīng)≥2mmol/g。按Hestrin法測(cè)定。3.1.4

磷含量每批提純多糖的磷含量應(yīng)≥80mg/g。用鉬酸胺法測(cè)定。3.2分子大小測(cè)定每批提純多糖的分子大小應(yīng)用瓊脂糖-4B或CL-4B凝膠過(guò)濾法測(cè)定。Kd值應(yīng)≤0.40。kd值在0.5以前的洗脫液多糖回收應(yīng)在65%以上。3.3血清學(xué)特異性試驗(yàn)每批提純多糖應(yīng)用血凝抑制試驗(yàn)（或其他適宜方法）進(jìn)行血清學(xué)特異性試驗(yàn)。A群半成品多糖抗原在抗A群腦膜炎球菌抗體存在下，應(yīng)特異抑制A群腦膜炎抗原致敏的紅血球凝集。3.4

提純多糖的蛋白、核酸及脂多糖含量若達(dá)不到要求可進(jìn)行再處理。4提純多糖稀釋可用單批或多批多糖合并，然后加入無(wú)菌乳糖和無(wú)菌蒸餾水（無(wú)熱原）稀釋，使每人份菌苗含多糖30μg，乳糖2.5～3.0mg。乳糖規(guī)格應(yīng)為分析純結(jié)晶體。5

分裝與干燥分裝及容器的要求同《生物制品分裝規(guī)程》。6成品檢定6.1鑒別試驗(yàn)每批分裝菌苗至少取一瓶進(jìn)行鑒別試驗(yàn)，按3.3項(xiàng)方法進(jìn)行。6.2

多糖濃度每批菌苗應(yīng)檢查多糖含量，每人份多糖應(yīng)不少于30μg。磷含量應(yīng)在2.25μg以上。6.3

無(wú)菌試驗(yàn)每批菌苗應(yīng)按《生物制品無(wú)菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。6.4

安全試驗(yàn)6.4.1

熱原質(zhì)試驗(yàn)每批菌苗應(yīng)按《生物制品熱原質(zhì)試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行，家兔注射劑量為0.025μg/kg。判定標(biāo)準(zhǔn)按該規(guī)程4.2項(xiàng)要求進(jìn)行。6.4.2

毒性試驗(yàn)6.4.2.1

豚鼠毒性試驗(yàn)至少用5只體重350～400g的豚鼠，每只腹腔注射500μg多糖（1ml），觀察7天，不應(yīng)引起明顯癥狀或死亡。6.4.2.2

小白鼠毒性試驗(yàn)至少用5只體重18～20g的小白鼠，每只腹腔注射100μg多糖（0.5ml），觀察7天，不應(yīng)引起明顯癥狀或死亡。6.5

分子大小測(cè)定分裝的菌苗至少5批抽一批測(cè)多糖分子大小，用瓊脂糖-4B或CL-4B凝膠過(guò)濾法測(cè)定，kd值應(yīng)≤0.40。kd值在0.5以前的洗脫液多糖回收率應(yīng)在65%以上。6.6

水分測(cè)定每批菌苗應(yīng)測(cè)水分（費(fèi)休氏法），其含量應(yīng)不超過(guò)3%。7菌苗稀釋液檢定稀釋菌苗用的pH6.8～7.2緩沖生理鹽水應(yīng)經(jīng)過(guò)下列檢定。7.1

無(wú)菌試驗(yàn)每批稀釋液應(yīng)按《生物制品無(wú)菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。7.2

安全試驗(yàn)每批稀釋液用體重18～20g小白鼠5只，每只腹腔注射0.5ml，觀察7天，應(yīng)健存。7.3

熱原質(zhì)試驗(yàn)按《生物制品熱原質(zhì)試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。8保存與效期半成品多糖保存于-20℃或以下，自收菌之日起效期為5年。凍干菌苗保存于2～8℃，自凍干之日起效期為2年。A群腦膜炎球菌多糖菌苗使用說(shuō)明書本品系用A群腦膜炎球菌經(jīng)提純制成的多糖菌苗，供預(yù)防A群腦膜炎球菌引起的流行性腦脊髓膜炎之用。本品為白色疏松體，加所附緩沖生理鹽水后迅速溶解，溶液澄明無(wú)異物。接種對(duì)象6個(gè)月～15周歲兒童。初免年齡從6月齡開(kāi)始，3歲以下接種2針，間隔3個(gè)月。3歲以上接種一針，接種應(yīng)于流腦流行季節(jié)前完成。根據(jù)需要每3年復(fù)種一次。在遇有流行的情況下，可擴(kuò)大年齡組作應(yīng)急接種。用法1.使用前檢查安瓿，不應(yīng)有裂紋，安瓿內(nèi)不應(yīng)有異物。2.用所附緩沖生理鹽水溶解干燥菌苗后，搖勻，立即使用。3.上臂外側(cè)三角肌附著處皮膚經(jīng)消毒后皮下注射0.5ml。禁忌有下列情況者不得使用本菌苗。1.癲癇、抽風(fēng)、腦部疾患及有過(guò)敏史者。2.腎臟病，心臟病及活動(dòng)性結(jié)核。3.急性傳染病及發(fā)熱者。反應(yīng)反應(yīng)輕微，偶有短暫低熱，局部稍有壓痛感。保存應(yīng)保存于2～8℃。凍干皮上劃痕用鼠疫活菌苗制造及檢定規(guī)程本品系采用鼠疫菌弱毒菌株，經(jīng)培育后凍干制成。用于預(yù)防鼠疫。1菌種1.1菌種來(lái)源用弱毒的EV菌株，由中國(guó)藥品生物制品檢定所分發(fā)或經(jīng)同意。1.2

菌種檢定凍干菌種在生產(chǎn)前每年需要檢查一次培養(yǎng)特性、生化特性、噬菌體裂解試驗(yàn)及安全性。1.2.1

培養(yǎng)特性在瓊脂平皿上，37℃培育44～48小時(shí)之菌落應(yīng)為粗糙型，在肉湯中液面有薄菌膜，管底有沉淀物，肉湯透明。1.2.2

生化特性應(yīng)分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，石蕊牛乳輕度變紅，在甘油培養(yǎng)基內(nèi)不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。1.2.3

噬菌體裂解試驗(yàn)將EV菌種涂于瓊脂平皿上，加滴度為10-6以上的鼠疫噬菌體1滴，于28℃培育44～48小時(shí)，在噬菌體流過(guò)的地方應(yīng)無(wú)本菌生長(zhǎng)。1.2.4

安全試驗(yàn)用體重300～400g豚鼠3只，每只皮下注射120億菌（28～30℃培育44～48小時(shí)的培養(yǎng)物）。在注射后第6天解剖1只，第21天解剖2只，檢查注射部位、脾、肝、肺，并用脾、肝、肺及心血進(jìn)行培育。其中心血和肺培育應(yīng)無(wú)本菌生長(zhǎng)。肉眼檢查病變，注射部位可見(jiàn)充血，浸潤(rùn)變?yōu)槟摨?，肝和脾可有丘疹狀結(jié)節(jié)，肺部不應(yīng)有鼠疫特異病變?yōu)榘踩囼?yàn)合格。肺部如有顯著病變時(shí)，應(yīng)用同量豚鼠復(fù)試，若仍有顯著病變時(shí)，菌種應(yīng)廢棄。1.2.5

免疫力試驗(yàn)用體得200～250g的豚鼠10只，每只皮下注射70萬(wàn)菌（28～30℃培育44～48小時(shí)的培養(yǎng)物）一次。于20～25天后進(jìn)行攻擊，每只皮下感染鼠疫強(qiáng)毒菌200個(gè)MLD。。同時(shí)用3組豚鼠作對(duì)照，每組3只，各組豚鼠皮下分別注射0.5、1及2個(gè)MLD的毒菌。免疫組及對(duì)照組至少觀察25天。免疫動(dòng)物存活不少于8只，而對(duì)照動(dòng)物注射1個(gè)及2個(gè)MLD全部死亡時(shí)，免疫力試驗(yàn)為合格。1.3

菌種保存菌種應(yīng)凍干保存，凍干菌種保存于2～8℃暗處。2菌苗制造2.1

制造鼠疫活菌苗之實(shí)驗(yàn)室在生產(chǎn)期間應(yīng)專用，不得作其他細(xì)菌工作，絕對(duì)禁止保存鼠疫毒菌。2.2

制造用培養(yǎng)基制造菌種可用pH6.8~7.2的厚氏瓊脂培養(yǎng)基或其他適宜的培養(yǎng)基。2.3

原液制造2.3.1

第1代菌種啟開(kāi)干燥菌種加入生理鹽水溶解后，接種于厚氏瓊脂培養(yǎng)基上，于28～30℃培育44～48小時(shí)為第1代。放2～8℃保存可使用半個(gè)月。2.3.2

第2代菌種用生理鹽水將第1工菌種洗下，接種足夠量的種子瓶，于28～30℃培育44～48小時(shí)為第2代，供大批生產(chǎn)用。不得用第3代菌種生產(chǎn)。2.3.3

大量接種第2代菌種經(jīng)肉眼檢查無(wú)雜菌后，加入適量生理鹽水洗下菌苔，制成均勻的菌懸液，用此菌懸液接種培養(yǎng)瓶，于28～30℃培育44～48小時(shí)后，逐瓶肉眼檢查，有雜菌者廢棄。2.3.4

采集用由蔗糖、明膠、硫脲、味精及尿素組成的保護(hù)液洗下菌苔（洗