南農(nóng)-生物技術(shù)制藥-第二章基因工程藥物課件

第二章基因工程與藥物蛋白生產(chǎn)

GeneticEngineeringinMedicineandIndustry第二章基因工程與藥物蛋白生產(chǎn)

GeneticEngineeSometherapeuticproductsforusedinhumansSometherapeuticproductsforGenentech公司1976年，27歲的風(fēng)險(xiǎn)投資人RobertSwanson與UniversityofCalifornia的教授HerbBoyer共飲了幾杯啤酒，討論了基因工程技術(shù)的商業(yè)前景。討論結(jié)束時(shí)，他們決定建立一個(gè)公司，并取名為Genentech（GeneticEngineeringTechnology）。第一個(gè)基因工程公司在學(xué)術(shù)界和商業(yè)界的滿腹懷疑中誕生了！Genentech公司1976年，27歲的風(fēng)險(xiǎn)投資人RobGenentech的驕人業(yè)績1976Genentech創(chuàng)立1977首次在微生物里生產(chǎn)了人蛋白生長激素抑制素1978克隆了人胰島素基因1979克隆了人生長激素素基因1980公司上市，募集$35million1982第一個(gè)基因重組藥（人胰島素）上市（轉(zhuǎn)讓給Lilly公司）1984第一個(gè)VIII因子，轉(zhuǎn)讓給CutterBiological1985第一個(gè)自己生產(chǎn)的產(chǎn)品（人生長激素）1987生產(chǎn)組織纖溶酶原激活劑（tPA）1990生產(chǎn)interferon1

1990與瑞士Roche醫(yī)藥公司合并（$2.1billion）Genentech的驕人業(yè)績1976Genentech創(chuàng)立1美國已批準(zhǔn)上市的基因工程藥物（1997.7）中文名稱商品名稱英文名縮寫開發(fā)公司胰島素HumulinNovolinHumalogInsulinlispoinsulinLillyNovoNordiskLilly人生長激素ProtropinHumatropeNutropinAQrhuGHGenentechLillyGenentech干擾素IntronAReferonAAvonixBetaseronActimmuneAlferon-NrhuIFNa2brhuIFNa2arhuIFN

rhuIFN1brhuIFN1brhuIFNa3ScheringRocheBiogenChironGenentechInterferonScience美國已批準(zhǔn)上市的基因工程藥物（1997.7）中文名稱商品名稱白細(xì)胞介素2ProleukinrhuIL2Chiron粒細(xì)胞集落刺激因子NeupogenrhuG-CSFAmgen粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子LeukinerhuGM-GSFImmunex紅細(xì)胞生成素EpogenProcritrhuEPOAmgenOrtho組織溶纖原激活劑ActivaserhuTPAGenentech生長激素SerostinsomatotropinSerono促生長素NutropinSaizenGenotropinNorditropinBio-TropinsomatopinGenentechSeronoPharma/UpjohnNovoNordiskBiotechGeneral白細(xì)胞介素2ProleukinrhuIL2Chiron粒細(xì)胞抗血友病因子VIIIKogenateRecombinateFactorVIIIBayerBaxter葡萄腦苷脂酶CerezymeglucocerebrosidaseGenzyml脫氧核糖核酸酶PulmozymedomaseGenentech乙型肝炎疫苗RecombivaxHBEngerixBComraxHepatitisBvaccineMerckSmithKlineMerck甲型肝炎疫苗HavrixHepatitisBvaccineSmithKline抗血友病因子VIIIKogenateFactorVIII體內(nèi)用單克隆抗體ReoproOrthoOKT-3OncoScintCR/OVOncoScintOC103OncoScintCR103ProstascintMAB,bloodclotsMAB,KidneysupMAB,diaginjectCentocorOrthoBiotechCytogenCytogenCytogenCytogen鼠單克隆抗體PanorexMurineMABGlaxoWelcome1體內(nèi)用單克隆抗體ReoproMAB,bloodclots中國已經(jīng)批準(zhǔn)上市的基因工程藥物（1998.5）藥品名縮寫開發(fā)生產(chǎn)公司批準(zhǔn)時(shí)間適應(yīng)癥rhuINFa1b(外用）rhuINFa1brhuINFa2a長春生研所上海生研所深圳興科長春生研所長生藥業(yè)三生藥業(yè)1989試1996正1996正1996正1997正1997正病毒性角膜炎HBV,HCVHBV,HCV尖銳濕疣，皰疹等HBV,HCVHBV,HCVrhuIFNa2b新大洲藥業(yè)里亞哈爾華立達(dá)安科華新1997正1996正1997正1997試1997試HBV,HCVHBV,HCVHBV,HCVHBV,HCVHBV,HCV中國已經(jīng)批準(zhǔn)上市的基因工程藥物（1998.5）藥品名縮寫開發(fā)rhuINF

上海生研所克隆麗珠生物工程1994試1995試1995試類風(fēng)濕類風(fēng)濕類風(fēng)濕rhuIL2長春生研所長春藥業(yè)四環(huán)制藥華新三生藥業(yè)深圳興科中華合通金絲利康利制藥1997正1997正1997正1997正1997正1997正1995試1995試1995試癌輔助治療癌輔助治療癌輔助治療癌輔助治療癌輔助治療癌輔助治療癌輔助治療癌輔助治療癌輔助治療rhuINF上海生研所1994試類風(fēng)濕rhuIL2rhuG-CSF九源1997試化療生白血病rhuGM-CSF特寶1997試化療生白血病rSK醫(yī)大實(shí)業(yè)1996試心梗溶栓rhuEPO華欣永銘維沃1997試1997試再生障礙性貧血再生障礙性貧血bFGF（外用）珠海東大1996試創(chuàng)傷，燒傷rhuG-CSF九源1997試化療生白血病rhuGM-CSF一、基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生1、生產(chǎn)基因工程藥品

（1）傳統(tǒng)的某些藥品（如動物激素）生產(chǎn)：控制某種物質(zhì)合成基因轉(zhuǎn)基因“工程菌”基因工程藥品基因表達(dá)產(chǎn)物基因工程發(fā)酵分離提取從動物組織中提取，生產(chǎn)量小，價(jià)格昂貴。（3）基因工程生產(chǎn)的藥品重組人生長激素重組人白細(xì)胞介素重組人干擾素重組人胰島素發(fā)酵罐（2）基因工程方法生產(chǎn)藥品的方法：一、基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生1、生產(chǎn)基因工程藥品控制某種物質(zhì)合成基1313二、基因工程菌大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)一：大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢二大腸桿菌表達(dá)載體的基本組成三常用的大腸桿菌表達(dá)載體四真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)五大腸桿菌表達(dá)真核基因存在的問題六基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機(jī)制七.人胰島素的生產(chǎn)方法二、基因工程菌大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)一：大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢一：大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢全基因組測序,共有4405個(gè)開放型閱讀框架基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定被美國FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素(endotoxin)periplasmheterogous一：大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢pe二大腸桿菌表達(dá)載體的基本組成一個(gè)良好的大腸桿菌表達(dá)載體：有抗菌素抗性基因決定載體拷貝數(shù)的復(fù)制起點(diǎn)(ori)供外源基因插入的多克隆位點(diǎn)。參與控制轉(zhuǎn)錄與翻譯的必不可少的原件外源基因在原核寄主細(xì)胞中表達(dá),它的編碼結(jié)構(gòu)必須是連續(xù)的,不間斷的,處于寄主啟動子有效控制下。二大腸桿菌表達(dá)載體的基本組成一個(gè)良好的大腸桿菌表達(dá)載體：外1啟動子可使外源基因高水平表達(dá)的最佳啟動子必須具備以下幾個(gè)條件1)強(qiáng)啟動子，外源基因的蛋白質(zhì)的表達(dá)量占細(xì)胞總蛋白的10%-30%以上2)應(yīng)能呈現(xiàn)出一種低限的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平3)應(yīng)該是誘導(dǎo)型的,能通過簡單的方式,使用廉價(jià)的誘導(dǎo)物得以誘導(dǎo)。Accountforinducible1啟動子Accountforinducibleb:如果在啟動子的上游部位放置一個(gè)有效的轉(zhuǎn)錄終止子,那么由該啟動子驅(qū)動的克隆基因的轉(zhuǎn)錄便會被限制在最低本底水平。2終止子

a

:如果在克隆基因編碼區(qū)的3末端之后，接上一個(gè)有效的轉(zhuǎn)錄終止子，便能夠阻止轉(zhuǎn)錄通讀過位于下游另一個(gè)啟動子

c:轉(zhuǎn)錄終止子還能增強(qiáng)mRNA分子的穩(wěn)定性,大大提高蛋白質(zhì)產(chǎn)物水平。b:如果在啟動子的上游部位放置一個(gè)有效的轉(zhuǎn)錄終止子,那在構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體時(shí)，通常是添加全部終止密碼子,阻止核糖體跳躍(skipping)現(xiàn)象。大腸桿菌格外偏愛使用終止密碼子UAA,當(dāng)其后連上一個(gè)U而形成四聯(lián)核苷酸的情況下,轉(zhuǎn)譯終止效率便會得到進(jìn)一步加強(qiáng)。在構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體時(shí)，通常是添加全部終止密碼子,阻止3轉(zhuǎn)譯起始序列mRNA的5末端之獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征,是決定mRNA轉(zhuǎn)譯起始效率的主要因素。在構(gòu)建外源基因的高效表達(dá)載體時(shí),需認(rèn)真選擇有效的轉(zhuǎn)錄起始序列。未鑒定出通用有效的轉(zhuǎn)譯起始序列的保守結(jié)構(gòu)initiationfactorconservedsequenceuniversial3轉(zhuǎn)譯起始序列mRNA的5末端之獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征,是決定4、reportergene其編碼產(chǎn)物可被快速測定的功能單元。追蹤某些特定的DNA結(jié)構(gòu)(重組質(zhì)粒)是否已經(jīng)導(dǎo)入寄主細(xì)胞同任何一種目的啟動子連接,其表達(dá)活性可作為檢測啟動子功能的依據(jù)。usageβ－半乳糖苷酶基因lacZ、堿性磷酸酶基因、熒光素酶基因(luciferase)基因、半乳糖激酶基因(galK)氯霉素抗性(乙酰轉(zhuǎn)移酶)基因(cat)四環(huán)素抗性基因(tetr)alkalinephosphatase4、reportergene其編碼產(chǎn)物可被快速測定的功能單三常用的大腸桿菌表達(dá)載體啟動子廣泛使用的大多數(shù)質(zhì)粒表達(dá)載體啟動子λ噬菌體的PL啟動子大腸桿菌乳糖操縱子lac啟動子色氨酸操縱子trp啟動子pBR322質(zhì)粒的beta－內(nèi)酰胺酶啟動子LactoseOperon三常用的大腸桿菌表達(dá)載體啟動子廣泛使用的大多數(shù)質(zhì)粒表達(dá)載體圖1-1在大腸桿菌中基因表達(dá)的3個(gè)重要信號啟動子核糖體結(jié)合位點(diǎn)基因終止子DNARNA轉(zhuǎn)錄核糖體結(jié)合mRNA位點(diǎn)圖1-1在大腸桿菌中基因表達(dá)的3個(gè)重要信號啟動子核糖圖1-2基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游序列的比較TTGACATATAATPu>Py-35區(qū)-30-70正調(diào)控區(qū)-20負(fù)調(diào)控區(qū)+1-10區(qū)GC區(qū)….CAAT區(qū)TATAAATPuAPy-40-110+1-20-30增強(qiáng)子CCGCCC或GGGCGG或GGCCAATCTTA原核真核圖1-2基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游序列的比較TTGACATATA圖1-3通過表達(dá)載體在大腸桿菌中被表達(dá)PRTTPRTPRmRNA蛋白質(zhì)表達(dá)載體外源基因?qū)⑼庠椿虿迦胂拗菩悦盖形稽c(diǎn)轉(zhuǎn)化大腸桿菌圖1-3通過表達(dá)載體在大腸桿菌中被表達(dá)PRTTPRTPRm圖1-4雜交基因的構(gòu)建和融合蛋白的合成PRTPRT插入外源基因｝ATATTA正確融合N端C端不正確融合外源基因不被翻譯表達(dá)ATATTA

GGAGCTGGAGC融合蛋白親和層析法純化化學(xué)試劑除去大腸桿菌肽段圖1-4雜交基因的構(gòu)建和融合蛋白的合成PR圖1-5在大腸桿菌中表達(dá)外源基因長遇到的問題翻譯轉(zhuǎn)錄PRTT轉(zhuǎn)錄大腸桿菌不能切除內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄提前終止圖1-5在大腸桿菌中表達(dá)外源基因長遇到的問題翻譯轉(zhuǎn)錄P圖1-6真核細(xì)胞表達(dá)載體常用的4種啟動子P半乳糖轉(zhuǎn)錄GAL10P甲醇轉(zhuǎn)錄乙醇氧化酶基因（a）GAL啟動子（b）AOX啟動子（c）葡萄糖水解酶啟動子（d）纖維二糖水解酶啟動子P纖維素轉(zhuǎn)錄纖維素二糖水解酶基因P淀粉轉(zhuǎn)錄葡萄糖淀粉酶基因木糖不轉(zhuǎn)錄圖1-6真核細(xì)胞表達(dá)載體常用的4種啟動子P半乳糖轉(zhuǎn)錄GAL四真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)三種表達(dá)部位各有不同的優(yōu)缺點(diǎn)//

而且對克隆基因表達(dá)產(chǎn)物的制備有很大關(guān)系。在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)在細(xì)胞周質(zhì)中表達(dá)以分泌到細(xì)胞外的形式表達(dá)。1外源基因在大腸桿菌中表達(dá)蛋白質(zhì)位置cytoplasmperiplasm四真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)三種表達(dá)部位各有不同的優(yōu)缺點(diǎn)1)細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)expressedincytoplasm包含體是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種由不可溶性蛋白質(zhì)聚集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)。在表達(dá)中應(yīng)盡可能限制包含體產(chǎn)生,并促進(jìn)形成天然三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。多采用與分子伴侶共表達(dá)的方法,可能是增加外源蛋白的可溶性和折疊能力的一種有效途徑。insolublechaperon1)細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)expressedincytopl周質(zhì):指大腸桿菌一類G-菌中，位于內(nèi)膜和外膜之間的細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分。在大腸桿菌中,已成功的使用了各種不同類型信號肽,將細(xì)胞質(zhì)中蛋白的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至周質(zhì)。周質(zhì)中表達(dá)外源蛋白質(zhì)優(yōu)點(diǎn):A:周質(zhì)中蛋白質(zhì)種類少,周質(zhì)中表達(dá)的外源蛋白質(zhì)能夠被有效的濃縮和純化。b:周質(zhì)氧化環(huán)境有利于蛋白質(zhì)按正確的方式折疊c:在周質(zhì)中蛋白質(zhì)降解不廣泛。來自原核、真核的外源基因都成功的在大腸桿菌細(xì)胞周質(zhì)中實(shí)現(xiàn)了有效表達(dá)。2)周質(zhì)中表達(dá)expressedin

periplasm周質(zhì):指大腸桿菌一類G-菌中，位于內(nèi)膜和外膜之間的細(xì)胞結(jié)3)分泌表達(dá)使在大腸桿菌中表達(dá)的外源蛋白質(zhì)分泌到胞外培養(yǎng)基中進(jìn)行分離純化,這種研究思路稱為外源蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)。3)分泌表達(dá)目的蛋白穩(wěn)定性高:目的蛋白易于分離目的蛋白末端完整將外源基因與大腸桿菌信號肽編碼序列重組在一起進(jìn)行分泌表達(dá),其N端的甲硫氨酸殘基可在信號肽剪切過程中被有效除去這些真核基因在大腸桿菌中表達(dá)時(shí),蛋白質(zhì)甲硫氨酸殘基往往不能被切除。分泌表達(dá)優(yōu)點(diǎn)

:重組人胰島素原若分泌到細(xì)胞周質(zhì)中,其穩(wěn)定性大約是在細(xì)胞質(zhì)中的10倍許多真核生物成熟蛋白N端不含有甲硫氨酸殘基。intactexcise目的蛋白穩(wěn)定性高:將外源基因與大腸桿菌信號肽編碼序列重組在一外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進(jìn)行分泌型表達(dá);外源基因分泌表達(dá)的表達(dá)率通常要比包涵體形式低很多分泌表達(dá)缺點(diǎn)相對其它生物細(xì)胞,大腸桿菌蛋白分泌機(jī)制不健全。目前產(chǎn)業(yè)化的異源蛋白分泌型重組大腸桿菌工程菌很少Perfectsound外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進(jìn)行分泌型表達(dá);分泌表達(dá)缺點(diǎn)分泌型重組蛋白具有較高比例正確構(gòu)象，對蛋白酶不敏感蛋白質(zhì)的分泌機(jī)制原核細(xì)胞周質(zhì)中有多種分子伴侶,可阻止分泌蛋白隨機(jī)折疊分泌至細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中重組蛋白很少形成分子間二硫鍵與包涵體相比randomSulferinnerouter分泌型重組蛋白具有較高比例正確構(gòu)象，蛋白質(zhì)的分泌機(jī)制原核細(xì)胞重組大腸桿菌--目的蛋白完全分泌分泌型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建有些G-能將細(xì)菌的抗菌蛋白（細(xì)菌素）分泌到培養(yǎng)基中,這一過程嚴(yán)格依賴于細(xì)菌素釋放蛋白

,它激活定位于內(nèi)膜上的磷酸酯酶,導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)外膜的通透性增大。將細(xì)菌素釋放蛋白編碼基因克隆在一個(gè)合適的質(zhì)粒上攜帶大腸桿菌信號肽編碼序列和目的基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞完全分泌型受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化permeabilitybacteriocin重組大腸桿菌--目的蛋白完全分泌分泌型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建二種類型由報(bào)告基因編碼序列和另一個(gè)基因啟動子及其它的調(diào)節(jié)序列構(gòu)成。用于研究啟動子功能及調(diào)控作用分子機(jī)理。由一種異源蛋白質(zhì)基因編碼序列同寄主細(xì)胞誘導(dǎo)型啟動子構(gòu)成。用于生產(chǎn)新型融和蛋白。2融和蛋白質(zhì)表達(dá)將外源基因與受體菌自身的蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一起,并作為一個(gè)開放型閱讀框架進(jìn)行表達(dá)。這種雜合基因表達(dá)出的蛋白質(zhì)稱為融合蛋白。

2.1融和基因二種類型2融和蛋白質(zhì)表達(dá)將外源基因與受體菌自身的蛋白質(zhì)編attention外源基因應(yīng)裝在受體蛋白編碼基因下游,為融合蛋白提供終止密碼子。在某些情況下,并不需要完整的受體結(jié)構(gòu)基因2.2融和蛋白的表達(dá)策略融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建原則受體細(xì)胞的結(jié)構(gòu)基因能高效表達(dá),且其表達(dá)產(chǎn)物可以通過親和層析進(jìn)行特異性簡單純化兩個(gè)結(jié)構(gòu)基因拼接位點(diǎn)處的序列設(shè)計(jì)十分重要,它直接決定融合蛋白的裂解。兩個(gè)蛋白編碼序列應(yīng)保持一致的翻譯閱讀框架在DNA水平上，人工設(shè)計(jì)引入的蛋白酶切割位點(diǎn)或化學(xué)試劑特異性斷裂位點(diǎn),可以在體外從純化的融合蛋白分子中釋放回收異源蛋白Baseonconsistentattention外源基因應(yīng)裝在受體蛋白編碼基因下游,為使克隆外源基因有效轉(zhuǎn)譯有效轉(zhuǎn)譯：取決于核糖體的結(jié)合位點(diǎn),

受到編碼區(qū)起點(diǎn)核苷酸序列影響?？墒沟鞍踪|(zhì)產(chǎn)物穩(wěn)定,免受寄主胞內(nèi)酶的降解作用,因此可以得到較高的產(chǎn)率?？赡軜?gòu)成一種信號肽指導(dǎo)大腸桿菌蛋白質(zhì)分配到細(xì)胞的正確位置。能夠使用親和層析技術(shù)分離純化融合蛋白。2.3表達(dá)融合蛋白質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)ribosome使克隆外源基因有效轉(zhuǎn)譯2.3表達(dá)融合蛋白質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)ribos3整合型異源蛋白的表達(dá)工程菌在沒有選擇壓力存在下,可以連續(xù)培養(yǎng)而不丟失目的基因表達(dá)盒,

這對以改良物種遺傳性狀為目的的基因工程特別有意義3.1整合形式表達(dá)目的蛋白的特點(diǎn)目的基因穩(wěn)定表達(dá)目的基因表達(dá)率低整合型的目的基因隨受體細(xì)胞染色體DNA一起復(fù)制,

在大多數(shù)情況下相當(dāng)穩(wěn)定單拷貝整合的目的基因表達(dá)率受到限制,此時(shí)可通過強(qiáng)化表達(dá)元件加以補(bǔ)償replicate/stabilitySpecies/improvementintensify3整合型異源蛋白的表達(dá)工程菌在沒有選擇壓力存在下,可以連轉(zhuǎn)位因子依賴型的體內(nèi)重組同源序列依賴型的體內(nèi)重組3.2DNA體內(nèi)重組的基本原理轉(zhuǎn)位因子依賴型的體內(nèi)重組同源序列依賴型的體內(nèi)重組3.2D生物細(xì)胞內(nèi)天然存在的一類無復(fù)制能力的DNA可移動因子,不同生物種群擁有結(jié)構(gòu)不同的轉(zhuǎn)位因子噬菌體G片段(G-Fragment)原核微生物插入順序(IS)真核微生物轉(zhuǎn)座子(Tn、Ty)高等植物可移動因子(Ac、Ds)高等動物跳躍基因(mobilegene)轉(zhuǎn)位因子transposon轉(zhuǎn)位因子依賴型的體內(nèi)重組生物細(xì)胞內(nèi)天然存在的一類無復(fù)制能力的DNA可移動因子,噬轉(zhuǎn)位因子的結(jié)構(gòu)transposonpalindromerepressorinversionregion轉(zhuǎn)位因子的結(jié)構(gòu)transposonpalindromerep整合形式整合形式

同源整合同源序列依賴型的體內(nèi)重組同源整合一般地說,距離越遠(yuǎn)、長度越長、同源性越高,重組的頻率也就越高,反之亦然。同源整合

1基因結(jié)構(gòu)存在很大差異。大多數(shù)真核基因含有內(nèi)含子，細(xì)菌細(xì)胞中沒有除去內(nèi)含子機(jī)制；五大腸桿菌表達(dá)真核基因存在的問題2轉(zhuǎn)錄信號不同。真核基因轉(zhuǎn)錄的mRNA分子不具有結(jié)合細(xì)菌核糖體所必須的SD序列。細(xì)菌RNA聚合酶不能識別真核生物啟動子3mRNA的分子結(jié)構(gòu)有所差異。絕大多數(shù)真核mRNA分子的3末端有poly(A)尾巴，在5末端有一個(gè)帽結(jié)構(gòu)。影響mRNA在細(xì)菌中的穩(wěn)定性及與細(xì)菌核糖體相結(jié)合的能力，阻止正常的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯。4真核生物的蛋白質(zhì)有些是通過前體分子加工來的。在細(xì)菌中不存在這種修飾作用。5細(xì)菌的蛋白酶可以識別和降解真核生物的蛋白質(zhì)產(chǎn)物1基因結(jié)構(gòu)存在很大差異。大多數(shù)真核基因含有內(nèi)含子，細(xì)菌細(xì)胞中結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導(dǎo)致其表觀生物學(xué)功能的喪失六基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機(jī)制1工程菌遺傳不穩(wěn)定性表現(xiàn)形式基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒的不穩(wěn)性,具有下列兩種表現(xiàn)形式分配不穩(wěn)定性整個(gè)重組DNA分子從受體細(xì)胞中逃逸segregativeinstabilitydomainDeletionregionrearrange結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性六基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機(jī)制1工程受體細(xì)胞中的限制修飾系統(tǒng)對外源重組DNA分子的降解2工程菌遺傳不穩(wěn)定性的產(chǎn)生機(jī)制外源基因的高效表達(dá)嚴(yán)重干擾受體細(xì)胞正常的生長代謝能量、物質(zhì)的匱乏和外源基因表達(dá)產(chǎn)物的毒性誘導(dǎo)受體細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，關(guān)閉合成途徑，啟動降解重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時(shí)的不均勻分配是重組質(zhì)粒逃逸的基本原因受體細(xì)胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進(jìn)重組分子的缺失重排Deletion受體細(xì)胞中的限制修飾系統(tǒng)對外源重組DNA分子的降解2工程以構(gòu)建穩(wěn)定性高質(zhì)粒:

將R1質(zhì)粒上的parB基因引入表達(dá)型載體中:其表達(dá)產(chǎn)物可以選擇性地殺死由于分配不均勻所產(chǎn)生的無質(zhì)粒細(xì)胞3改進(jìn)載體、受體系統(tǒng)正確設(shè)置載體上的多克隆位點(diǎn):禁止DNA片段插在穩(wěn)定區(qū)內(nèi)將受體細(xì)胞的致死性基因安裝在載體上，并構(gòu)建條件致死性的相應(yīng)受體系統(tǒng)。

eg:大腸桿菌的ssb基因(DNA單鏈結(jié)合蛋白編碼基因)以構(gòu)建穩(wěn)定性高質(zhì)粒:3改進(jìn)載體、受體系統(tǒng)正確設(shè)置載體上根據(jù)載體上的抗藥性標(biāo)記,向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的抗生素(藥物和食品生產(chǎn)時(shí)禁止使用抗生素)4施加選擇壓力根據(jù)載體上的營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記,向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的營養(yǎng)組份(培養(yǎng)基復(fù)雜,成本較高)correspond根據(jù)載體上的抗藥性標(biāo)記,向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的抗生素(藥使用可控型啟動子控制目的基因定時(shí)表達(dá)及表達(dá)程度5控制目的基因過量表達(dá)使用可控型復(fù)制子控制質(zhì)粒的定時(shí)增殖或降低質(zhì)粒的拷貝數(shù)(優(yōu)化基因工程菌的培養(yǎng)工藝)培養(yǎng)基組成:限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定培養(yǎng)溫度:較低培養(yǎng)溫度有利于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定replicon使用可控型啟動子控制目的基因定時(shí)表達(dá)及表達(dá)程度5控制目的1982年,美國ElyLiLi公司首先使用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素,成為世界上第一個(gè)上市的基因工程藥物。1987年,Novo公司,成為世界上第一個(gè)上市的基因工程藥物。1987年,Novo公司又推出了利用重組酵母菌生產(chǎn)人胰島素的新工藝。七.人胰島素的生產(chǎn)方法基因工程法生產(chǎn)人胰島素體外胰島素受體結(jié)合性能、淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的應(yīng)答能力、降血糖作用、血漿藥代動力學(xué)等指標(biāo)上均與天然胰島素沒有任何區(qū)別具有無免疫原性、注射吸收迅速。充分展示了基因工程在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的巨大潛力。potentialimmunogenic1982年,美國ElyLiLi公司首先使用重組大腸桿菌SHSHSHSHCCCC

COO_SHSHN

CCS.S.Pre-pro-insulinSSSSCCCC

COO_SSCCS-SPro-insulinNSSSSCCCCCOO_CCS

SS-SinsulinNSHSHSHSHCCC基因工程菌的構(gòu)建戰(zhàn)略：化學(xué)合成A鏈和B鏈的編碼序列表達(dá)重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建A鏈和B鏈分別表達(dá)法1synthesis基因工程菌的構(gòu)建戰(zhàn)略：化學(xué)合成A鏈和B鏈的編碼序列表達(dá)重組人南農(nóng)-生物技術(shù)制藥--第二章基因工程藥物課件由于A鏈和B鏈上共存在六個(gè)半胱氨酸殘基，體外二硫鍵的正確配對率較低,通常只有10%-20%.采用這條工藝路線生產(chǎn)正確配對率較低,采用這條工藝路線生產(chǎn)的重組人胰島素每克成本高達(dá)100美元以上。A鏈和B鏈分別表達(dá)法生產(chǎn)技術(shù)評價(jià)為了進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本,美國ElyLiLi公司隨后又建立了第二條生產(chǎn)重組人胰島素的工藝路線由于A鏈和B鏈上共存在六個(gè)半胱氨酸殘基，體外二硫鍵的正確配對基因工程菌的構(gòu)建戰(zhàn)略

人胰島素原表達(dá)法proinsulin基因工程菌的構(gòu)建戰(zhàn)略人胰島素原表達(dá)法proinsulin表達(dá)產(chǎn)物后處理路線B鏈中第22位上的Arg和第29位上的Lys,由于良好折疊的原因,對胰蛋白酶不敏感表達(dá)產(chǎn)物后處理路線在人胰島素原表達(dá)工藝中,由于C肽的存在,胰島素原能形成良好的空間構(gòu)象,三對二硫鍵的正確配對率也相應(yīng)提高,折疊率高達(dá)80%以上。生產(chǎn)技術(shù)的評價(jià)目前美國ElyLiLi公司采用此工藝年產(chǎn)十幾噸的重組人胰島素。雖然這條工藝路線不比AB鏈分別表達(dá)法更為簡捷,而且還要使用兩種高純度的酶制劑,但理想的折疊率在很大程度上彌補(bǔ)了工藝繁瑣的缺陷,使得每克最終產(chǎn)品的成本僅50美元。在人胰島素原表達(dá)工藝中,由于C肽的存在,胰島素原能形南農(nóng)-生物技術(shù)制藥--第二章基因工程藥物課件

一種能促進(jìn)融合蛋白分泌的工程菌構(gòu)建策略是將胰島素或胰島素原編碼序列與beta-內(nèi)酰胺酶基因拼接,beta-內(nèi)酰胺酶通常能被大腸桿菌分泌到胞外。獲得的工程菌同時(shí)具備了穩(wěn)定高效表達(dá)可分泌型融合蛋白的優(yōu)良特性,為胰島素的后續(xù)分離純化工序減輕了負(fù)擔(dān)。分泌型重組人胰島素表達(dá)法上述三種重組大腸桿菌的構(gòu)建路線均采用胰島素或胰島素原編碼序列與大腸桿菌beta-半乳糖苷酶基因拼接的方法,所產(chǎn)生的融合型重組蛋白表達(dá)率高、穩(wěn)定性強(qiáng),但不能分泌,只要以包涵體的形式存在于胞質(zhì)中。一種能促進(jìn)融合蛋白分泌的工程菌構(gòu)建策略是將胰島素什么叫蛋白質(zhì)工程指通過改造與蛋白質(zhì)相應(yīng)的基因中的堿基順序，或設(shè)計(jì)合成新的基因，將它克隆至受體細(xì)胞中，通過基因表達(dá)而獲得具有新的特性的蛋白質(zhì)（酶）技術(shù)。這是一門從改變基因入手，定做新的蛋白質(zhì)的技術(shù)。故有人將其稱為“第二代基因工程”

1983年，美國生物學(xué)家額爾默首先提出了“蛋白質(zhì)工程”的概念。蛋白質(zhì)工程和基因工程蛋白質(zhì)類藥物什么叫蛋白質(zhì)工程蛋白質(zhì)工程和基因工程蛋白質(zhì)類62

1、蛋白質(zhì)工程的理論設(shè)計(jì)：包括活性設(shè)計(jì)、專一性設(shè)計(jì)、框架（構(gòu)象）設(shè)計(jì)等。由于對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系認(rèn)識還不系統(tǒng)，目前的蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)僅僅是對天然蛋白質(zhì)的修飾。如：異常血紅蛋白的氨基酸取代去羧基端胰島素等。

蛋白質(zhì)工程的一般技術(shù)根據(jù)需要合成具有特定氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)；確定蛋白質(zhì)化學(xué)組成、空間結(jié)構(gòu)與生物功能之間的關(guān)系；從氨基酸序列預(yù)測蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和生物功能，設(shè)計(jì)合成具有特定生物功能的全新蛋白質(zhì)。

蛋白質(zhì)工程的一般技術(shù)根據(jù)需要合成具有特定氨基酸序列和632、基因修飾——點(diǎn)突變法蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變通過基因修飾來完成基因修飾的方法：⑴基因的全化學(xué)合成按照所需蛋白質(zhì)的氨基酸順序，先后合成結(jié)構(gòu)基因、轉(zhuǎn)錄的起始信號及終止信號、限制酶切位點(diǎn)等核酸片段，然后用連接酶將各片段連接起來，通過基因工程轉(zhuǎn)移到細(xì)菌中進(jìn)行目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)。目前用此法已合成了：人血細(xì)胞干擾素、胰島素、生長激素釋放抑制激素等基因。

2、基因修飾——點(diǎn)突變法64調(diào)節(jié)基因啟動基因結(jié)構(gòu)基因終止基因連接酶完整基因調(diào)節(jié)基因啟動基因結(jié)構(gòu)基因終止基因連接酶完整基因65⑵基因直接修飾法將連接于質(zhì)粒上的某一蛋白質(zhì)的基因用酶法去除一小段，然后用合成的核苷酸片段接上，從而獲得新的突變體。已修飾過的酶有：內(nèi)酰胺酶、酪氨酰tRNA合成酶、二氫葉酸還原酶等酶蛋白。⑵基因直接修飾法66限制性內(nèi)切酶外源DNA限制性內(nèi)切酶退火重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞篩選表達(dá)帶重組體的細(xì)胞目的產(chǎn)物質(zhì)粒目的基因酶切割蛋白基因核苷酸片段新突變質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶外源DNA限制性內(nèi)切酶退火重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞篩67⑶盒式突變

1985年Wells提出的一種基因修飾技術(shù)，一次可以在一個(gè)位點(diǎn)上產(chǎn)生20種不同氨基酸的突變體，可以對蛋白質(zhì)分子中重要氨基酸進(jìn)行“飽和性”分析。蛋白質(zhì)工程的運(yùn)用蛋白質(zhì)或肽類藥物的改造和新藥的研制

⑶盒式突變68酶切割蛋白基因核苷酸片段新突變質(zhì)粒同時(shí)獲得多個(gè)突變體酶切割蛋白基因核苷酸片段新突變質(zhì)粒同時(shí)獲得多個(gè)突變體69圖3-1胰島素的分子結(jié)構(gòu)和從前胰島素原合成胰島素的簡要過程30個(gè)氨基酸B鏈21個(gè)氨基酸A鏈胰島素利于重組生產(chǎn)的特點(diǎn)前導(dǎo)序列BCA前胰島素原（胰島素原=BCA——無前導(dǎo)序列）胰島素∣S∣S∣∣S∣S∣BA剪切-S-S--S-S-LBAC自發(fā)折疊蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用圖3-1胰島素的分子結(jié)構(gòu)和從前胰島素原合成胰島素的簡要過程370圖3-2由人工合成的A,B鏈的基因合成重組胰島素lac啟動子lacZ’A基因運(yùn)載人工合成的A基因的載體B基因運(yùn)載人工合成的B基因的載體(a)人工合成的基因(b)合成胰島素蛋白ABmetβ-半乳糖苷酶片段A鏈胰島素純化A鏈和B鏈二硫鍵連接metB鏈溴化氰處理pBR322pBR322轉(zhuǎn)化的大腸桿菌合成AB融合蛋白圖3-2由人工合成的A,B鏈的基因合成重組胰島素lac啟動71圖3-3重組促生長素抑制素的合成lac啟動子lacZ’人工促生長素抑制素基因metβ-半乳糖苷酶片段促生長素抑制素融合蛋白轉(zhuǎn)化大腸桿菌促生長素抑制素（14氨基酸）溴化氰圖3-3重組促生長素抑制素的合成lac啟動子lacZ’人工促72圖3-4重組生長素的合成密碼子01911912424024HaeⅢ保留除去（a）生長素cDNA片段的準(zhǔn)備過程（b）表達(dá)024合成前導(dǎo)序列191cDNAlac啟動子插入表達(dá)載體合成生長素轉(zhuǎn)化大腸桿菌圖3-4重組生長素的合成密碼子01911912424024H73圖3-5凝血因子Ⅷ基因及其翻譯產(chǎn)物外顯子（26）內(nèi)含子（25）（a）凝血因子Ⅷ基因（b）凝血因子Ⅷ的翻譯后的加工初級翻譯產(chǎn)物（2351個(gè)氨基酸）ABCAC成熟的凝血因子Ⅷ蛋白加工圖3-5凝血因子Ⅷ基因及其翻譯產(chǎn)物外顯子（26）內(nèi)含子（274重組凝血因子Ⅷ合成的幾種方法在哺乳動物細(xì)胞中合成（倉鼠細(xì)胞）利用活體動物生產(chǎn)（豬）利用表達(dá)載體Ag啟動子SV40聚腺甘酸化序列凝血因子Ⅷ的cDNA導(dǎo)入倉鼠細(xì)胞重組蛋白重組凝血因子Ⅷ合成的幾種方法在哺乳動物細(xì)胞中合成（倉鼠細(xì)胞）75干擾素的合成干擾素分子結(jié)構(gòu)干擾素生產(chǎn)車間干擾素的合成干擾素分子結(jié)構(gòu)干擾素生產(chǎn)車間76圖3-7利用分離的病毒殼體蛋白作疫苗的原理分離的病毒殼體蛋白殼體蛋白的特異抗體注射到血液循環(huán)抗體包圍整個(gè)病毒被完整病毒感染圖3-7利用分離的病毒殼體蛋白作疫苗的原理分離的病毒殼體77圖3-8重組牛痘病毒可能用途的基本原理乙型肝炎表面抗原基因牛痘病毒啟動子重組牛痘病毒基因組牛痘病毒乙型肝炎病毒抗乙型肝炎抗體抗牛痘病毒抗體注射重組牛痘病毒顆粒到血液循環(huán)免疫系統(tǒng)合成抗牛痘病毒和乙型肝炎病毒的抗體圖3-8重組牛痘病毒可能用途的基本原理乙型肝炎表面抗原基因78表3-2在重組牛痘病毒中表達(dá)的外源基因

基因惡性瘧原蟲表面抗原流行性感冒病毒衣殼蛋白狂犬病病毒G蛋白乙型肝炎主要表面抗原單純皰疹糖蛋白人類免疫缺陷病毒（HIV）表面蛋白水泡性口炎衣殼蛋白仙臺病毒蛋白BACK表3-2在重組牛痘病毒中表達(dá)的外源基因7980（inclusionbodiesIBs)基因工程包含體的純化基因工程菌培養(yǎng)液不同表達(dá)形式的前處理胞外分泌型表達(dá)：離心,收集液相→濃縮→純化。胞內(nèi)表達(dá)：胞內(nèi)可溶性表達(dá)：離心,收集菌體→細(xì)胞破碎→離心，收集上清→純化胞內(nèi)周質(zhì)表達(dá)：離心,收集菌體→低濃度溶菌酶或滲透壓沖擊等溶解目標(biāo)物→離心,收集上清液→純化。不溶性包涵體：離心,收集菌體→細(xì)胞破碎→離心,收集沉淀→包涵體洗滌→目標(biāo)蛋白變性溶解→復(fù)性→純化。80（inclusionbodiesIBs)基因工程包81外源蛋白在大腸桿菌中的積累蛋白產(chǎn)物占菌體總蛋白外源蛋白的積累人胰島素50%形成包涵體β-丙酰胺酶20%在細(xì)胞間區(qū)γ-人體干擾素25%形成包涵體凝乳酶原形成包涵體牛生長激素>30%形成包涵體β-內(nèi)酰胺酶形成間區(qū)包涵體人胰島素原5%~26%形成包涵體81外源蛋白在大腸桿菌中的積累蛋白產(chǎn)物占菌體總蛋白外源蛋白的82包涵體：一種蛋白質(zhì)不溶性聚集體，包括目標(biāo)蛋白、菌體蛋白等。目標(biāo)蛋白一級結(jié)構(gòu)是正確的，但立體結(jié)構(gòu)是錯誤的，所以沒有生物活性。包涵體的形成：大腸桿菌中目標(biāo)產(chǎn)物的表達(dá)水平過高，超過正常代謝水平，過多表達(dá)產(chǎn)物聚集在細(xì)胞內(nèi)，形成不溶性的包涵體。高表達(dá)產(chǎn)生的積聚物在細(xì)胞內(nèi)部形成不溶物原因？蛋白過量積聚，超過溶解度，導(dǎo)致沉淀；②蛋白生成太快，分子間疏水基團(tuán)相互作用而聚集沉淀；③蛋白生成太快，分子內(nèi)部二硫鍵的錯誤連接導(dǎo)致沉淀；④表達(dá)蛋白過多，與其結(jié)合/誘導(dǎo)組分不足，不能形成溶解狀態(tài)⑤蛋白質(zhì)自身不穩(wěn)定。包含體的構(gòu)成82包涵體：一種蛋白質(zhì)不溶性聚集體，包括目標(biāo)蛋白、菌體蛋白等83基因工程包涵體的純化方法收集菌體細(xì)胞細(xì)胞破碎包涵體的洗滌目標(biāo)蛋白的變性溶解目標(biāo)蛋白的復(fù)性包含體的出現(xiàn)不僅增加了生物分離設(shè)計(jì)的難度，也為蛋白質(zhì)折疊機(jī)理研究提出了新的課題。欲獲得天然活性態(tài)的目標(biāo)產(chǎn)物，必需分離包含體后，溶解包含體并使其中的目標(biāo)蛋白恢復(fù)應(yīng)有的天然活性。83基因工程包涵體的純化方法收集菌體細(xì)胞細(xì)胞破碎包涵體的洗滌841）包涵體的洗滌細(xì)胞破碎后，包含體呈顆粒狀，致密。洗滌的重要性：收集的沉淀中，除包涵體外，還包括許多雜質(zhì)，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，復(fù)性時(shí)會與目標(biāo)蛋白一起復(fù)性形成雜交分子而聚集，給后步純化帶來困難。洗滌劑：溫和的表面活性劑、蔗糖、低濃度的弱變性劑（如尿素）或脫氧膽酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂質(zhì)類雜質(zhì)。洗滌劑濃度以溶解雜質(zhì)，不溶解包涵體中表達(dá)產(chǎn)物為原則。841）包涵體的洗滌85

2）目標(biāo)蛋白的變性溶解

包涵體中不溶性的目標(biāo)蛋白必須溶解到液相中，才能進(jìn)一步純化。一般水溶液很難將其溶解，只有采用蛋白質(zhì)變性才能使其形成可溶性的形式。常用變性劑：▲

5-8mol/L鹽酸胍和6-8mol/L尿素,作用：破壞離子間相互作用；▲

表面活性劑如1-2％SDS，作用：破壞蛋白質(zhì)肽鏈間的疏水相互作用。▲

PH>9.0的堿溶液和有機(jī)溶劑，使用較少。影響變性因素：時(shí)間、pH、離子強(qiáng)度、變性劑種類和濃度。852）目標(biāo)蛋白的變性溶解86原理：在變性劑溶液中，溶解的蛋白質(zhì)呈變性狀態(tài)，即蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)被破壞，但一級結(jié)構(gòu)和共價(jià)鍵沒有破壞。當(dāng)部分變性劑被除去后，蛋白質(zhì)會重新折疊成具有活性的正確構(gòu)型，該過程稱復(fù)性。復(fù)性方法：稀釋法除變性劑－加入大量水或緩沖液。膜分離法除變性劑－透析、超濾、電滲析。層析法：凝膠層析，高效疏水層析3）目標(biāo)蛋白的復(fù)性86原理：在變性劑溶液中，溶解的蛋白質(zhì)呈變性狀態(tài)，即蛋白質(zhì)高87

蛋白質(zhì)復(fù)性影響因素：變性劑濃度目標(biāo)蛋白濃度；pH和離子強(qiáng)度；氧化還原條件。

還原劑：

二硫蘇糖醇、β-巰基乙醇、還原型谷胱甘肽；氧化劑：氧化型谷胱甘肽;堿性下通空氣。

復(fù)性區(qū)

多聚物生成區(qū)

絮凝沉淀區(qū)鹽酸胍濃度mol/L紅血球碳酐酶復(fù)性操作中變性劑與蛋白質(zhì)濃度對復(fù)性的影響蛋白質(zhì)濃度mol/L87蛋白質(zhì)復(fù)性影響因素：鹽酸胍濃度mol/L紅血球碳酐酶復(fù)88腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白在E.coli中的高密度發(fā)酵過程中以兩種形式表達(dá)：◆細(xì)胞內(nèi)有活性的可溶性蛋白形式（約占目標(biāo)蛋白的30%）◆無活性的包涵體形式（約占目標(biāo)蛋白的70%）。懸浮破壁PBS洗滌離心硫銨沉淀親和層析陽離子交換層析溶解復(fù)性親和層析濕菌體發(fā)酵液干凈菌體上清液包涵體純品活性檢測破壁液離心離心液洗滌舉例：TRAIL的分離純化88腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白在E.coli中的高密度891.包涵體的洗滌①粗制包涵體用50mM磷酸鹽緩沖液，含150mMNaClpH=7.4(1:3w/v)洗滌2-3次；②用含有1MNaCl的磷酸緩沖液洗滌1次(1:3w/v)，將粘附其表面的大部分蛋白及水溶性雜質(zhì)除去；③用6M尿素及0.5%TritonX-100聯(lián)合洗滌1次(1:3w/v)，去除另一些雜蛋白，這時(shí)得較純包涵體（純度達(dá)80%左右）；④用SDS電泳檢測純度。2.包涵體的變性溶解①洗滌后包涵體用含有30mMDTT及5mol/l鹽酸胍的Tris緩沖液pH=8.0(1:5w/v)變性溶解→室溫?cái)嚢?h，95%以上的包涵體可被溶解；②離心，13000rpm，20min→棄沉淀得到溶解液。891.包涵體的洗滌2.包涵體的變性溶解903.包涵體復(fù)性（間歇式流加稀釋復(fù)性法）以含DTT和ZnSO4的Tris-HCl為復(fù)性緩沖液，再添加0.4ML-Arg，0.5M尿素，0.5MNaCl作為蛋白聚集抑制劑，變性溶解液可多次流加，每次流加的時(shí)間是以上一次流加蛋白已達(dá)到部分復(fù)性為準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)中，流加間隔時(shí)間確定為90min，每次流加濃度為150mg/L，變性液流加次數(shù)可高達(dá)6次，最終濃度可達(dá)到1mg/ml，4℃緩慢攪拌一段時(shí)間，對50mMTris-HCl，300mMNaCl，0.1M尿素及0.2mMZnSO4混合液透析過夜，透析后離心除去復(fù)性過程中聚集的蛋白，超濾濃縮（也可用硫酸銨沉淀進(jìn)行濃縮）得復(fù)性蛋白液。903.包涵體復(fù)性（間歇式流加稀釋復(fù)性法）915.復(fù)性后純化復(fù)性濃縮后蛋白金屬親和層析吸附洗滌：40mmol/L咪唑，洗除非特異性吸附的雜蛋白洗脫：100mmol/L咪唑目標(biāo)蛋白

純度達(dá)95%以上（由SDS和RP-HPLC鑒定）收率75%915.復(fù)性后純化92包含體產(chǎn)物分離工藝（牛生長激素分離提?。?2包含體產(chǎn)物分離工藝（牛生長激素分離提?。?3

來自發(fā)酵罐的菌體經(jīng)過離心除去培養(yǎng)液后加入緩沖液懸浮，通入高壓勻漿器反復(fù)破碎三次。勻漿經(jīng)過離心和水洗除去細(xì)胞碎片，再添加溶菌酶、EDTA和促進(jìn)劑以除去脂蛋白和未破碎的細(xì)胞。包含體經(jīng)離心沉淀和水洗后進(jìn)行變性溶解，溶解劑為6mol/L鹽酸胍。溶解的同時(shí)通入空氣氧化以打斷錯誤連接的雙硫鍵。離心除去沉淀，含變性蛋白質(zhì)的上清液經(jīng)超濾濃縮后過凝膠柱除去雜蛋白，再加入復(fù)性緩沖液進(jìn)行透析復(fù)性。復(fù)性過程中產(chǎn)生的絮凝沉淀用離心除去。包含體產(chǎn)物分離工藝

（牛生長激素分離提取）93來自發(fā)酵罐的菌體經(jīng)過離心除去培養(yǎng)液后

質(zhì)譜在蛋白質(zhì)、多肽分析中的應(yīng)用

質(zhì)譜在蛋白質(zhì)、多肽分析中的應(yīng)用質(zhì)譜在蛋白質(zhì)、多肽分析中的應(yīng)用分子量的測定蛋白質(zhì)、多肽純度的鑒定肽質(zhì)量指紋譜肽序列測定技術(shù)蛋白質(zhì)的翻譯后修飾鑒定其他蛋白質(zhì)鑒定質(zhì)譜在蛋白質(zhì)、多肽分析中的應(yīng)用分子量的測定蛋白質(zhì)鑒定分子量的測定用ESI-MS和MALDI-TOF-MS測定蛋白質(zhì)和多肽的分子量，精確度可達(dá)0.1％～0.01％，這遠(yuǎn)比其它方法(如SDS、凝膠過濾、超離心等）精確。正確測定蛋白質(zhì)的分子量，可以提供很多信息，如確定分子大小，從氨基酸組成分析的結(jié)果求得準(zhǔn)確的氨基酸組成，驗(yàn)證已測定的一級結(jié)構(gòu)是否正確等。分子量的測定用ESI-MS和MALDI-TOF-MS測定蛋白分子量測定實(shí)例采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，高效凝膠過濾色譜以及電噴霧離子化質(zhì)譜三種方法對新發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)（來源于福建尖吻蝮蛇蛇毒,是一種具有類凝血酶活性的弱酸性蛋白質(zhì)）的分子量進(jìn)行了測定。測定方法分子量非還原SDS-PAGE26.2kDa(二硫鍵未打開)還原SDS-PAGE29kDa(二硫鍵被還原)HPGFC24.5kDaESI-MS30298Da分子量測定實(shí)例采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，高效凝膠過濾色譜以及電分子量測定實(shí)例天花粉蛋白的一級結(jié)構(gòu)測定，在86年時(shí)曾出現(xiàn)差錯，當(dāng)時(shí)測定的結(jié)果表明它是由234個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為25682Da。90年，我們發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)測定有誤，重新修正了其一級結(jié)構(gòu)。它應(yīng)由247個(gè)氨基酸殘基組成，正確分子量為27141.32Da。93年，用MALDL-TOF-MS和ESI-MS測定了天花粉的分子量。分子量測定實(shí)例天花粉蛋白的一級結(jié)構(gòu)測定，在86年時(shí)曾出現(xiàn)差錯天花粉蛋白（TCS）的MALDI-TOF-MS的分子量圖譜天花粉蛋白（TCS）的MALDI-TOF-MS的分子量圖譜天花粉蛋白（TCS）的ESI-MS的分子量圖譜天花粉蛋白（TCS）的ESI-MS的分子量圖譜分子量測定實(shí)例β-苦瓜子蛋白的一級結(jié)構(gòu)計(jì)算(包括糖部分)的分子量為29156Da，用MALDI-TOF-MS測定的分子量為29074Da，二者相差82Da。這種差異可能是個(gè)別氨基酸測定的差錯造成，估計(jì)整個(gè)結(jié)構(gòu)測定不會有大錯誤。分子量測定實(shí)例β-苦瓜子蛋白的一級結(jié)構(gòu)計(jì)算(包括糖部分)的分分子量測定實(shí)例β-苦瓜子蛋白其C端用羧肽酶的方法測定為-S-T-A-D-E-N，但尚不能完全確定?？喙献拥鞍自?90位有一個(gè)色氨酸，我們用BNPS-Skatole降解色氨酸，降解后的肽用HPLC分離，得到含有C端的一段小肽(59個(gè)氨基酸殘基)用MALDI-TOF-MS測定其分子量為6443與計(jì)算得到的59肽的分子量為6442.9非常相符，因此也就證明了C端59個(gè)氨基酸殘基的順序是正確的。

分子量測定實(shí)例β-苦瓜子蛋白其C端用羧肽酶的方法測定為-Sβ-苦瓜子蛋白Trp降解C端肽分子量β-苦瓜子蛋白Trp降解C端肽分子量蛋白質(zhì)、多肽純度的鑒定

根據(jù)質(zhì)譜測定分子量的作用，質(zhì)譜還可用來作蛋白質(zhì)、多肽純度的鑒定。只要質(zhì)量有差異的雜質(zhì)都可以被檢出，此方法靈敏度高，用量少(pmol水平)、速度快，并有獨(dú)到之處。蛋白質(zhì)、多肽純度的鑒定根據(jù)質(zhì)譜測定分子量的作用，質(zhì)譜還可用蛋白質(zhì)、多肽純度的鑒定實(shí)例1：天花粉蛋白C-端微觀不均一，即有二個(gè)C末端，一個(gè)多一個(gè)Ala(即247個(gè)氨基酸殘基)，一個(gè)少一個(gè)Ala(即246個(gè)氨基酸殘基)，用ESI-MS完全能夠分辨出來

蛋白質(zhì)、多肽純度的鑒定實(shí)例1：天花粉蛋白C-端微觀不均一，即實(shí)例2：如豬胰島素和人胰島素混在一起，用MALDI-TOF-MS也能夠清楚地分出二個(gè)峰。兩者的差異僅在豬胰島素B鏈的第30位為Ala(89.09Da)，而人胰島素相應(yīng)的位置為Thr(119.12Da)，兩者相差30Da（如圖13-11）。這些差異用其他方法是很難檢出的。

實(shí)例2：蛋白質(zhì)鑒定肽質(zhì)量指紋譜+基于串聯(lián)質(zhì)譜多肽測序蛋白質(zhì)鑒定蛋白質(zhì)鑒定肽質(zhì)量指紋譜+基于串聯(lián)質(zhì)譜多肽質(zhì)量指紋譜由于各種蛋白質(zhì)的氨基酸序列(一級結(jié)構(gòu))不同，蛋白質(zhì)被酶解后產(chǎn)生的肽段序列也各異，肽混合物質(zhì)量數(shù)亦具特征性，稱為肽質(zhì)量指紋譜(peptidemassfingerprint,PMF)，可用于蛋白質(zhì)的鑒定。

肽質(zhì)量指紋譜由于各種蛋白質(zhì)的氨基酸序列(PMF流程PMF流程肽質(zhì)量指紋譜

MALDI-TOF-MS是最有效的分析肽混合物的質(zhì)譜儀，肽混合物不需分離可直接分析，基質(zhì)輔助激光電離方法能耐受一定濃度的鹽，儀器靈敏度高，標(biāo)準(zhǔn)樣品1pmol的量就足夠，質(zhì)量數(shù)準(zhǔn)確度可達(dá)0.1‰～0.01‰，且操作簡單，分析速度快，依儀器型號不同一次可分析十幾個(gè)到幾十個(gè)樣品。肽質(zhì)量指紋譜MALDI-TOF-MS是PMF實(shí)例蓖麻毒素(ricin)

利用MALDI-TOF生物質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合肽質(zhì)量指紋譜方法，經(jīng)過數(shù)據(jù)庫檢索，建立了鑒定檢測Ricin的新方法。PMF實(shí)例蓖麻毒素(ricin)MALDI-TOF質(zhì)譜的測定，得到Ricin的分子量為62925DaMALDI-TOF質(zhì)譜的測定，得到Ricin的分子量為629Ricin的肽質(zhì)量指紋譜，共檢出22條肽譜峰Ricin的肽質(zhì)量指紋譜，共檢出22條肽譜峰將這些肽片段的質(zhì)譜數(shù)據(jù)用MASCOT搜索引擎在SwissProt數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行PMF檢索，檢索參數(shù)如表1所示。返回前5個(gè)檢索結(jié)果，如表2所示。其中符合要求的結(jié)果(置信區(qū)間為得分大于66分)只有一種蛋白即蓖麻毒素:Ricinprecursor(P02879，RICI_RICCO)，得分107，匹配肽段13條，肽譜的實(shí)驗(yàn)值與理論值的對比見表3，其余未檢出的肽段中有4條經(jīng)過與理論值對照也找到了歸屬。將這些肽片段的質(zhì)譜數(shù)據(jù)用MASCOT搜索引擎在SwissPr肽序列測定技術(shù)

兩種經(jīng)典測序方法：

DNA順序測定解決不了翻譯后加工所導(dǎo)致的氨基酸殘基的修飾的問題；

Edman降解不能解決N端封閉的測序的問題。肽序列測定技術(shù)兩種經(jīng)典測序方法：

蛋白梯形測序

(proteinladdersequencing)①使用少量鏈終止劑，進(jìn)行快速分步降解，在人為控制下產(chǎn)生一系列肽段，其中每個(gè)肽段于下一個(gè)之間只相差一個(gè)殘基；②用MALDI-TOF-MS讀出肽段信息。用此方法可在磷酸肽中定位磷酸絲氨酸殘基。研究N-端封閉的肽和蛋白，必須了解其C-端序列的信息。蛋白梯形測序

(proteinladderseque蛋白梯形測序

(proteinladdersequencing)蛋白梯形測序

(proteinladdersequenc肽測序一般方法（MS/MS）使用串聯(lián)質(zhì)譜，利用待測分子在電離及飛行過程中產(chǎn)生的亞穩(wěn)離子，通過分析相鄰?fù)M類型峰的質(zhì)量差，識別相應(yīng)的氨基酸殘基。其中亞穩(wěn)離子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用誘導(dǎo)碎裂。肽測序一般方法（MS/MS）使用串聯(lián)質(zhì)譜，利用待測分子在電離基于串聯(lián)質(zhì)譜的肽序列測定用特定蛋白水解酶作用于蛋白質(zhì)，將得到的肽段送入一級質(zhì)譜，產(chǎn)生前體離子，經(jīng)過一定選擇的前體離子在碰撞室發(fā)生CID。結(jié)果是前體離子肽骨架酰胺鍵的特異性斷裂，并產(chǎn)生了一系列可用于確定氨基酸序列的y型和b型等離子。獲得CID二級質(zhì)譜圖后可算出肽序列。基于串聯(lián)質(zhì)譜的肽序列測定用特定蛋白水解經(jīng)過MS/MS分析的多肽片段

經(jīng)過MS/MS分析的多肽片段N端和C端多肽GFPNAGFPNAGFPNAGFPNAGFPNAN-terminalpeptidesC-terminalpeptides415

486

30115457

71185332429N端和C端多肽GFPNAGFPNAGFPNAGFPNAGFP理論質(zhì)譜圖理論質(zhì)譜圖理論質(zhì)譜圖與實(shí)際質(zhì)譜圖理論質(zhì)譜圖與實(shí)際質(zhì)譜圖理論質(zhì)譜圖與實(shí)際質(zhì)譜圖理論質(zhì)譜圖與實(shí)際質(zhì)譜圖標(biāo)準(zhǔn)肽Glu-fib的MS/MS圖譜

標(biāo)準(zhǔn)肽Glu-fib的MS/MS圖譜MS/MS優(yōu)點(diǎn)

MS/MS質(zhì)譜測序可對N端封閉的肽進(jìn)行測序;并可以通過CID得到部分至完全的序列信息后，做出MS肽譜，這可對修飾的氨基酸殘基定性，并確證其位置，包括二硫鍵的分布。而且質(zhì)譜技術(shù)與分離技術(shù)直接相連也可相互驗(yàn)證，同時(shí)還可對混合肽進(jìn)行測序。另外它還有快速、靈敏的優(yōu)點(diǎn)。MS/MS優(yōu)點(diǎn)MS/MS質(zhì)譜測序可對N基于MS/MS蛋白質(zhì)鑒定獲得二級質(zhì)譜圖后可通過下列方法鑒定蛋白質(zhì)：①較常用的肽序列標(biāo)簽鑒定方法（peptidesequencetag，PST：從一級質(zhì)譜產(chǎn)生的肽段中選擇母離子，進(jìn)入二級質(zhì)譜，經(jīng)惰性氣體碰撞后肽段沿肽鏈斷裂，由所得到的各肽段質(zhì)量數(shù)差值推定肽段序列，用于數(shù)據(jù)庫查尋；②肽碎片離子搜索：直接用前體離子產(chǎn)生的未解析的CID圖譜與數(shù)據(jù)庫中的CID圖譜比較，如Sequest、Mascot、Sonat等算法；③從頭測序法（denovosequence），通過直接解釋MS/MS數(shù)據(jù)識別肽序列，這類系統(tǒng)和算法有Lutefisk、SHERENG、PEAKS、AuDeNS等。

基于MS/MS蛋白質(zhì)鑒定獲得二級質(zhì)譜圖后可通過下列方法鑒定蛋基于MS/MS的蛋白質(zhì)鑒定基于MS/MS的蛋白質(zhì)鑒定串聯(lián)質(zhì)譜在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用測序其它方法先用幾種不同的蛋白水解酶對蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解，胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)SV8酶(staphylococcusaureusV8)各種酶解片段用HPLC等分離得到的純肽或簡單的混合肽，可用MS/MS測定其各組分的順序，然后從不同蛋白水解酶酶解片段順序，找到其重疊部分，即可得到整個(gè)蛋白質(zhì)順序。測序其它方法先用幾種不同的蛋白水解酶對蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解，蛋白質(zhì)的翻譯后修飾鑒定磷酸化修飾糖基化修飾巰基和二硫鍵定位氨基的乙?；核鼗揎椀鞍踪|(zhì)的翻譯后修飾鑒定磷酸化修飾磷酸化修飾已知的磷酰氨基酸的類型有四種：

1．O-磷酸鹽，通過羥氨酸的磷酸化形成的，如絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸。

2．N-磷酸鹽，通過精氨酸，賴氨酸或組氨酸中的氨基的磷酸化形成的。

3．乙酰磷酸鹽，通過天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成的。

4．S-磷酸酯，通過半胱氨酸的磷酸化形成的。

磷酸化修飾已知的磷酰氨基酸的類型有四種：磷酸化肽富集分離技術(shù)有：雙向磷酸多肽譜圖(2D-PP)；高分辨率的凝膠電泳(2DE)和反相高效液相色譜(RP-HPLC)。對于32P標(biāo)記的磷酸化肽或蛋白可用放射自顯影或磷儲屏檢測，提取后可以高靈敏度MALDI-MS分析；如果32P標(biāo)記不可行，就要用LC-MS/MS分析，常用HPLC與質(zhì)譜聯(lián)用。

常用的富集方法有：固定金屬親和色譜(IMAC)；抗體免疫沉淀；化學(xué)修飾。磷酸化肽富集分離技術(shù)有：雙向磷酸多肽譜圖(2D-PP)；高分質(zhì)譜檢測磷酸化肽和確定磷酸化位點(diǎn)的方法

①

MALDI-TOF-MS可以通過肽指紋譜(PMF)鑒定蛋白質(zhì)，與磷酸酯酶處理相結(jié)合可以確定磷酸化位點(diǎn)。

原理：磷酸酯酶處理后，磷酸化的肽丟失磷酸基團(tuán)而產(chǎn)生特定質(zhì)量數(shù)的變化，MALDI-TOF-MS通過檢測這種質(zhì)量數(shù)的變化而確定磷酸化位點(diǎn)。質(zhì)譜檢測磷酸化肽和確定磷酸化位點(diǎn)的方法

②串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)進(jìn)行前體離子掃描，這一方法是通過檢測磷酸基團(tuán)產(chǎn)生的特定片段來報(bào)告磷酸肽的存在。

原理：磷酸化肽經(jīng)CID后會產(chǎn)生磷酸基團(tuán)的特異性片段，這些特異性的片段在用串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行前體離子掃描時(shí)可作為磷酸肽的“報(bào)告離子”。

質(zhì)譜檢測磷酸化肽和確定磷酸化位點(diǎn)的方法質(zhì)譜檢測磷酸化肽和串聯(lián)質(zhì)譜還可進(jìn)行中性丟失掃描，這種方法是用MS/MS檢測經(jīng)CID后發(fā)生中性丟失H3PO4(98u)的肽段。LC-MS/MS分析磷酸化位點(diǎn)傅立葉變換質(zhì)譜進(jìn)行電子捕獲解離

質(zhì)譜檢測磷酸化肽和確定磷酸化位點(diǎn)的方法質(zhì)譜檢測磷酸化肽和糖基化修飾蛋白質(zhì)糖基化可分為4類:N-糖基化

O-糖基化

C-甘露糖化聚糖磷脂酰肌醇錨(GPI-anchor)糖基化糖基化修飾蛋白質(zhì)糖基化可分為4類:糖蛋白糖苷內(nèi)切酶還原、烷基化、蛋白酶解MALDI-TOF-MS糖含量相對分子質(zhì)量ESI串聯(lián)質(zhì)譜MALDI-TOF-MS凝集素提取氨基酸序列糖基化位點(diǎn)糖肽片段糖蛋白結(jié)構(gòu)分析示意圖糖蛋白糖苷內(nèi)切酶還原、烷基化、蛋白酶解MALDI-TOF-M糖基化位點(diǎn)確定先用蛋白酶將糖蛋白酶解成含有和不含有糖鏈的肽片段，獲得糖蛋白的肽質(zhì)量指紋譜，再用糖苷內(nèi)切酶將肽鏈切除，PMF發(fā)生變化，原含有糖肽段的質(zhì)量由于糖鏈的丟失在質(zhì)譜圖上發(fā)生位移，通過網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫檢索可以得到位移肽片段的氨基酸序列，而在這個(gè)序列中必含有糖基化位點(diǎn)，由此我們可以確定糖蛋白分子中的糖基化位點(diǎn)。糖基化位點(diǎn)確定先用蛋白酶將糖蛋白酶解成糖基化分析用糖苷內(nèi)切酶將糖鏈切除，將反應(yīng)前后的質(zhì)譜圖進(jìn)行比較，就能直接表述糖鏈的平均質(zhì)量，而糖蛋白的平均含糖量可由糖鏈的平均質(zhì)量占糖蛋白平均相對分子質(zhì)量的百分比來表示。應(yīng)用ESI，對PMF中的肽片段進(jìn)行分析，可以得到蛋白某中間片段的序列，對已知蛋白，依靠此序列，判斷其歸屬，從而對糖蛋白的氨基酸序列加以證實(shí)。不同的質(zhì)譜方法可以產(chǎn)生多糖的源后裂解(PSD)和碰撞誘導(dǎo)解離(CID)譜，這可以給出有關(guān)糖的序列，分支及糖間的連接等信息。

糖基化分析用糖苷內(nèi)切酶將糖鏈切除，將反應(yīng)前后的質(zhì)譜圖進(jìn)行比較南農(nóng)-生物技術(shù)制藥--第二章基因工程藥物課件糖基化修飾常用的糖蛋白質(zhì)分離富集技術(shù)有:凝集素親和技術(shù)、肼化學(xué)富集法、親水相互作用色譜法、β消除麥克爾加成反應(yīng)。基于質(zhì)譜的糖蛋白質(zhì)鑒定及糖基化位點(diǎn)確定方法有:PNGaseF酶法、EndoH酶法、β-消除麥克爾加成反應(yīng)、三氟甲基磺酸法。糖基化修飾常用的糖蛋白質(zhì)分離富集技術(shù)有:凝集素親和技術(shù)、肼化巰基和二硫鍵定位

原理：利用碘乙酰胺、4-乙烯吡啶、2-巰基蘇糖醇等試劑對蛋白質(zhì)進(jìn)行烷基化和還原烷基化,結(jié)合蛋白酶切、肽譜技術(shù),利用生物質(zhì)譜的準(zhǔn)確分子量測定,可實(shí)現(xiàn)對二硫鍵和自由巰基的快速定位與確定。這在含有多二硫鍵結(jié)構(gòu)的活性多肽與蛋白質(zhì)研究中有重要用途。巰基和二硫鍵定位原理：利用碘乙酰胺、4-乙烯吡啶、2-巰基泛素化修飾原理：由于泛素的C末端是Arg-Gly-Gly結(jié)構(gòu)，經(jīng)胰蛋白酶水解后，Gly-Gly留在被修飾蛋白質(zhì)的肽鏈上，使肽段質(zhì)量增加114

，起到質(zhì)量標(biāo)記泛素化位點(diǎn)的作用，進(jìn)而通過串聯(lián)質(zhì)譜鑒定泛素化位點(diǎn)。泛素化修飾原理：由于泛素的C末端是Arg-Gly-Gly其他翻譯后修飾乙?；谆入赘孰幕渌g后修飾乙?；|(zhì)譜的其他應(yīng)用蛋白質(zhì)的折疊抗原決定部位指認(rèn)蛋白和蛋白、低聚核苷酸及金屬之間的作用細(xì)胞和病毒分析等藥物代謝鑒定質(zhì)譜的其他應(yīng)用蛋白質(zhì)的折疊蛋白質(zhì)類藥物的體外聚乙二醇修飾（PEG化）(1)增大藥物分子量，避免被腎小球過濾(2)阻礙蛋白酶的降解作用(3)屏蔽藥物的免疫位點(diǎn)(4)增加藥物在體液中的溶解度(5)與藥物間的化學(xué)鍵在體內(nèi)隨時(shí)間水解，緩慢釋放藥物

+蛋白或多肽偶聯(lián)物聚乙二醇CH3(-O-CH-CH)n-OH蛋白質(zhì)類藥物的體外聚乙二醇修飾（PEG化）(1)增大藥物分子國際上PEG修飾技術(shù)的研究進(jìn)展美國Rutgers大學(xué)Davis教授70年代的工作甲氧基PEG的應(yīng)用美國Enzon公司美國最早從事PEG修飾蛋白質(zhì)藥物的公司美國Shearwaters公司各種PEG修飾劑的生產(chǎn)商美國羅氏、先靈寶雅、安進(jìn)PEG藥物：PEG-INF，PEG-G-CSF其它：輝瑞、默克、葛蘭素史克、施貴寶。。。國際上PEG修飾技術(shù)的研究進(jìn)展美國Rutgers大學(xué)Davi國內(nèi)PEG修飾技術(shù)的研究進(jìn)展國家863重大機(jī)密項(xiàng)目：人工血液代用品的研制，1997-2000中國科學(xué)院重點(diǎn)項(xiàng)目：血液代用品和血液凈化，2001-2005國家重大科技專項(xiàng)課題《創(chuàng)新藥物和中藥現(xiàn)代化》：長效基因工程蛋白質(zhì)和多肽制劑關(guān)鍵技術(shù)，2002-2005國家863重點(diǎn)項(xiàng)目課題：核酸和多肽的修飾和劑型化技術(shù)，2007-2010PEG修飾血紅蛋白：I期臨床（中科院過程所、凱正公司）PEG修飾G-CSF：III期臨床（格蘭百克）國內(nèi)PEG修飾技術(shù)的研究進(jìn)展國家863重大機(jī)密項(xiàng)目：人工血液修飾粒細(xì)胞集落刺激因子（rhG-CSF） 延長半衰期修飾人腫瘤壞死因子 消除副作用修飾白介素I受體拮抗劑（rhIL-1Ra） 延長半衰期修飾牛胰核糖核酸酶（RNase） 提高抗腫瘤活性修飾超氧化物歧化酶（SOD） 提高半衰期修飾天冬酰氨酶（Aspartase） 克服免疫原性 提高半衰期修飾人干擾素（IFN） 提高半衰期修飾血紅蛋白（Hb） 血液代用品修飾胰島素 提高半衰期我國在PEG修飾蛋白質(zhì)方面的一些工作我國在PEG修飾蛋白質(zhì)方面的一些工作Sc-PEG專利分析以PEG-OH