DB37∕T 4436-2021 禽白血病病毒與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒聯(lián)合凈化技術(shù)規(guī)程

ICS11.220CCSB4137山東省地方標準DB37/T4436—2021禽白血病病毒與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒聯(lián)合凈化技術(shù)規(guī)程Technicalregulationsforeliminationofavianleukosisvirusandreticuloendotheliosisvirus2021-11-17發(fā)布2021-12-17實施DB37/T4436—2021前言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。IDB37/T4436—2021禽白血病病毒與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒聯(lián)合凈化技術(shù)規(guī)程1范圍本文件規(guī)定了禽白血病病毒和禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒的實驗室檢測技術(shù)要求和聯(lián)合凈化程序。實驗室檢測包括抗原的ELISA檢測、RT-PCR檢測和病毒分離鑒定。本文件適用于原種雞群、祖代雞群和父母代種雞群的凈化。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4禽白血病病毒與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增殖病病毒實驗室檢測技術(shù)4.1器材高溫高壓滅菌鍋(溫度范圍：105℃～134℃；額定壓力：0.23Mpa)、離心機（轉(zhuǎn)速：2000rpm～14000rpm）、PCR儀、二氧化碳恒溫細胞培養(yǎng)箱、分光光度計、酶標儀、冰箱。4.2材料與試劑4.2.14.2.2無RNase水。商品化的ALV與REVELISA抗原檢測試劑盒。ALV和REVELISA抗原檢測試劑盒均通過檢測泄殖腔拭子，分別檢測ALV所有亞群共有的抗原p27蛋白，或REV的主要免疫原性蛋白p30，從而對ALV和REV的感染情況進行判定。4.2.34.2.4商品化的RNA提取試劑盒。商品化的RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒。4.2.5PBS緩沖液：NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO41.42g（Na2HPO4·12H2O3.58g），KH2P040.27g溶于蒸餾水，定容為1000mL，過濾后高溫高壓滅菌備用。4.2.6細胞生長培養(yǎng)基：商品化的DMEM液，加10%胎牛血清，青霉素、鏈霉素各250IU/mL，儲存于4℃冰箱備用。4.2.7細胞維持培養(yǎng)基：配制方法同4.2.6，使用胎牛血清濃度為1%。4.2.8ALV-Agp85、ALV-Bgp85、ALV-Jgp85及REVgp90基因片段的特異性引物，具體引物序列見附錄A。4.2.9除特別規(guī)定外，在檢測中使用的試劑均為分析純，實驗用水應(yīng)符合GB/T6682的要求。1

DB37/T4436—20214.3樣品4.3.1血液樣品：母雞翅下靜脈抽取1mL靜脈血，制備血清；公雞抽取1mL靜脈血，2000rpm離心，制備血漿，儲存于-20℃冰箱備用。4.3.2泄殖腔棉拭子樣品：用無菌棉簽插入泄殖腔內(nèi)，擦拭后將棉簽放入裝有1mLPBS緩沖液的離心管內(nèi)，12000rpm離心2min后將上清等分為2份，將進行抗原檢測的樣品儲存于-20℃冰箱備用，將進行病毒分離及RNA提取的樣品儲存于-80℃冰箱備用。檢測樣品前，棉拭子應(yīng)反復(fù)凍融2次～3次，4℃，12000rpm離心2min～3min，吸取上清。血清樣品于室溫融化，500倍稀釋，用于檢測。4.3.3蛋清樣品：將蛋殼滅菌后，用鑷子將種蛋鈍端敲破，使用移液器從破殼處沿蛋殼內(nèi)壁伸入蛋內(nèi)約1cm，吸取1mL蛋清，并儲存于-20℃冰箱備用。4.4病毒抗原的ELISA檢測4.4.1操作方法：采用商品化的ELISA試劑盒檢測泄殖腔棉拭子或蛋清。按照試劑盒提供的檢測步驟操作。4.4.2結(jié)果判定：按試劑盒提供的算法判定。ALV-p27和REV-p30抗原其中之一為陽性，淘汰來源雛雞。如兩者均可疑或其中之一為可疑，則需進行RT-PCR檢測或病毒分離。4.5RT-PCR檢測4.5.1操作方法4.5.1.1RNA及cDNA提取：將凍存于液氮罐內(nèi)的棉拭子PBS溶液用商品化試劑盒提取RNA，用分光光度計測濃度后，用商品化試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。RNA儲存于-80℃冰箱，cDNA儲存于-20℃冰箱。4.5.1.2PCR及電泳檢測：完成RNA提取和將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以cDNA為模板，利用ALV-Agp85、ALV-Bgp85、ALV-Jgp85及REVgp90基因片段的特異性引物分別進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物于120V，120mA，使用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。剩余的RNA保存于-80℃冰箱，cDNA保存于-20℃冰箱。4.5.2結(jié)果判定瓊脂糖凝膠電泳中出現(xiàn)ALV-A特異的1020bp片段、ALV-B特異的1038bp片段、ALV-J特異的545bp片段或REV特異的292bp的片段時，可判定病毒檢測陽性。具體反應(yīng)體系及條件參見附錄B。4.6病毒分離4.6.1操作方法4.6.1.1DF-1細胞傳代培養(yǎng)：取生長狀態(tài)良好的DF-1細胞傳代并用細胞生長培養(yǎng)基培養(yǎng)至少8h，待細胞密度達到60%～70%后用于病毒分離。4.6.1.2病毒液感作DF-1細胞：在二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)了至少8h的DF-1細胞棄去細胞生長培養(yǎng)基，將1mL棉拭子樣品PBS液或1mL血清/血漿注入培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)板/培養(yǎng)皿內(nèi)，作用于DF-1細胞，將細胞放在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)作用1h后更換細胞維持培養(yǎng)基，培養(yǎng)至少3d。4.6.1.3p27/p30抗原檢測：采用商品化的ELISA檢測試劑盒檢測。4.6.2結(jié)果判定p27抗原陽性，可判定為ALV感染；p30抗原陽性，可判定REV感染。4.7結(jié)果處理2

DB37/T4436—2021淘汰泄殖腔棉拭子ALV-p27與REV-p30均為陽性或任一為陽性的雞只；淘汰泄殖腔棉拭子ALV-p27與REV-p30均為可疑或任一為可疑且RT-PCR為陽性的雞只；淘汰泄殖腔棉拭子ALV-p27與REV-p30均為可疑或任一為可疑且病毒分離為陽性的雞只。5養(yǎng)禽場禽白血病與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病聯(lián)合凈化程序在養(yǎng)禽場對禽白血病與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病進行聯(lián)合凈化，需按以下順序開展凈化工作，依次完成多個世代的ALV與REV檢測、凈化，直至建立陰性禽群。5.1孵化室雛雞檢測5.1.1操作方法：檢測應(yīng)從原種雞群開始，收集雞群的種蛋，同一只種雞來源的種蛋放在一起，分群孵化，采集全部1日齡雛雞的胎糞，分別用ALV-p27抗原ELISA檢測試劑盒檢測p27抗原，用REV-p30抗原ELISA檢測試劑盒檢測p30抗原。任一檢測中有一只雛雞為陽性，則同一種雞來源的雛雞均判為陽性，淘汰而不作種用。對選留的陰性雛雞，以母雞為單位，同一母雞的雛雞放于一個籠中隔離飼養(yǎng)（25只～50只）。5.1.2注意事項：每個籠間不可直接接觸，包括避免直接氣流的對流。飼養(yǎng)期間要采取避免橫向傳播的各種措施。接種疫苗時避免共用注射器。5.2后備種雞檢測采集全部5周～6周齡雞血清和泄殖腔棉拭子，分離培養(yǎng)ALV和REV。選出陰性雞，隔離飼養(yǎng)，作為后備種雞。5.3種雞開產(chǎn)初期檢測開產(chǎn)初期，每只雞取2枚～3枚蛋，取蛋清的混合樣品，使用ALV-p27抗原ELISA檢測試劑盒檢測蛋清中的p27抗原，使用REV-p30抗原ELISA試劑盒檢測蛋清中的p30抗原。淘汰抗原陽性雞。5.420周～25周齡留種前檢測每只雞取2枚～3枚蛋對蛋清進行p27、p30抗原檢測，淘汰陽性雞。原則同上。公雞則采集血漿接種DF-1細胞分離病毒，淘汰陽性種蛋。5.5種蛋的選留和孵化在經(jīng)8.4步留種前檢測淘汰陽性雞后，每只母雞僅選用1只檢測陰性公雞的精液授精。按規(guī)定時間留足種蛋，每只母雞的種蛋均標號。在出殼前，將每只母雞的種蛋置于同一標母雞號的專用紙袋中，置于出雛箱中出雛。5.6第二世代雞的檢測淘汰經(jīng)上述8.1～8.5的檢測淘汰后種雞的出殼的雛雞，作為凈化后第二代雞。繼續(xù)按8.1～8.5的程序，實施第二世代的檢測和凈化。第三世代后可按此程序繼續(xù)循環(huán)進行。5.7公雞檢測程序5.7.15.7.2次。孵化室1日齡雛雞檢測，同母雞（先收集胎糞一次，再鑒別雌雄）。第一次挑選公雞時，采集血漿進行病毒分離檢測。在開始供精之前，至少經(jīng)過病毒分離檢測一3

DB37/T4436—20215.7.35.7.4在生產(chǎn)階段采血漿進行病毒分離檢測一次。每6個月抽檢血清樣品，監(jiān)測p27抗原和p30抗原。5.8凈化標準連續(xù)進行多個世代種雞的ALV與REV檢測與凈化，病原學抽檢，原種場全部為陰性，祖代場和父母代場陽性率低于1%；血清學抽檢，A/B亞群抗體和J亞群抗體（采用商品化的ELISA檢測試劑盒檢測），原種場全部為陰性，祖代場和父母代場陽性率低于1%；連續(xù)兩年以上無臨床病例；即為達到禽白血病與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病凈化狀態(tài)。5.9耗材的無害化處理檢測陽性的雞和所有用畢的耗材見《病死及病害動物無害化處理技術(shù)規(guī)范》（農(nóng)醫(yī)發(fā)〔2017〕25號）。4

DB37/T4436—2021附錄A（資料性）RT-PCR引物信息禽白血病病毒（ALV）與網(wǎng)狀內(nèi)皮增殖病病毒（REV）RT-PCR檢測所需引物序列。引物濃度均為10pmol。表A.1ALV與REVRT-PCR檢測所需引物序列、產(chǎn)物長度、擴增目的及其用途病毒引物名稱上游引物序列長度擴增目的用途5’-CGCGGATCCGATGTTCACTTACTCGAGC-3’禽白血病病毒A擴增出的gp85特ALV-A1020bp亞群（ALV-A）gp85基因片段異性片段進行瓊脂糖凝膠電泳檢測下游引物上游引物下游引物上游引物下游引物上游引物下游引物5’-CGCTGCAGTCGTTTACGTCTTATACCTG-3’5’-CGCTGCAGGATGTCCACTTACTCGAGCA-3’5’-CCGAAGCTTTCGTTTGCGTCTTATACCTG-3’5’-GGATGAGGTGACTAAGAAAG-3’禽白血病病毒B擴增出的gp85特ALV-BALV-JREV1038bp545bp292bp亞群（ALV-B）gp85基因片段異性片段進行瓊脂糖凝膠電泳檢測禽白血病病毒J擴增出的gp85特亞群（ALV-J）gp85基因片段異性片段進行瓊脂糖凝膠電泳檢測5’-CGAACCAAAGGTAACACACG-3’F:5'-CATACTGGAGCCAATGGTT-3'5'-AATGTTGTAGCGAAGTACT-3'網(wǎng)狀內(nèi)皮增殖病病毒（REV）gp90基因片段擴增出的gp90特異性片段進行瓊脂糖凝膠電泳檢測5DB37/T4436—2021附錄B（資料性）RT-PCR反應(yīng)條件B.1反轉(zhuǎn)錄體系為：采用20μL體系，在PCR管中依次加入5XFastKing-RTSuperMix4μL，模板RNAxμL（x=2000/RNA濃度），用RNaseFreeddH2O補足20μL，使用42℃15min，95℃3min的條件進行反轉(zhuǎn)錄。B.2PCR反應(yīng)體系為：反應(yīng)總體系為25μL，在PCR管中依次加入，2×TapPCRMasterMix12.5μL，10pmol/μL的上下游引物各0.5μL，模板cDNA1μL，其余用RNaseFreeddH2O補至25μL。循環(huán)條件（ALV）：95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸40s，進行35個循環(huán)