電針不同頻率對阿爾茨海默病大鼠海馬突觸傳遞功能影響研究課件

電針不同頻率對阿爾茨海默病大鼠海馬突觸傳遞功能影響研究

電針不同頻率對阿爾茨海默病大鼠海馬突觸傳遞功能影響研究

課題來源

電針不同頻率調(diào)控糖原合酶激酶3

β對阿爾茨海默病大鼠神經(jīng)突觸可塑性影響及機(jī)制研究

（國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目）課題來源報(bào)告內(nèi)容

4123研究內(nèi)容技術(shù)路線可行性分析目的意義立項(xiàng)依據(jù)研究方法預(yù)期結(jié)果研究進(jìn)度報(bào)告內(nèi)容4123研究內(nèi)容技術(shù)路線可行性分析目的意義目的意義

阿爾茨海默病((Alzheimer.sdisease,AD)又稱老年癡呆是一種以進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶力損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以老年斑(SP)，神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFT)和神經(jīng)元丟失為主要病理改變。

目前全世界有2600萬人患AD，65歲以上的人AD的發(fā)病率為8.4%，我國老年癡呆患者約占世界的四分之一，達(dá)600萬-700萬人，發(fā)病率正以每年1.4%的速度上升,為威脅我國老年健康的主要疾病之一

臨床研究表明,針灸治療AD安全、有效,在治療效果和總有效率方面較藥物具有優(yōu)勢。本實(shí)驗(yàn)以益腎調(diào)督為治則，選取百會和腎腧穴，借助神經(jīng)電生理學(xué)檢測來觀察不同頻率電針對神經(jīng)突觸可塑性的影響，從而研究針灸延緩衰老、防治AD的作用機(jī)制，為臨床治療AD提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目的意義阿爾茨海默病((Alzheimer.s立題依據(jù)AD病因及防治是一個非常復(fù)雜的問題,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對它的研究已深入到基因、分子水平，但仍不能揭示其確切的病因和發(fā)病機(jī)制。學(xué)習(xí)記憶障礙是AD的主要臨床表現(xiàn),而神經(jīng)突觸可塑性被認(rèn)為是學(xué)習(xí)與記憶的重要細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。

突觸是兩個神經(jīng)元間高度局限性、特異性的連接位點(diǎn).在此點(diǎn)神經(jīng)遞質(zhì)由一個突觸前神經(jīng)元軸突終末釋放，激活突觸后神經(jīng)元上受體完成信息傳遞，突觸是神經(jīng)傳輸、加工的樞紐，是受體、通道、蛋白的密集之地其變化是學(xué)習(xí)記憶形成的一個重要的形態(tài)學(xué)和功能學(xué)基礎(chǔ)突觸的喪失會中斷許多功能通路的聯(lián)系，引起多方面的功能障礙，尤其是嚴(yán)重的認(rèn)知和記憶功能障礙從而導(dǎo)致癡呆立題依據(jù)AD病因及防治是一個非常復(fù)雜的問題,立題依據(jù)

突觸可塑性包括結(jié)構(gòu)和功能兩方面,突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)的可塑性表現(xiàn)為突觸活性區(qū)數(shù)量與面積的改變、突觸間隙的變化以及各種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變等;突觸功能的可塑性主要表現(xiàn)為突觸傳遞功能的增強(qiáng)或減弱，而對機(jī)體活動造成直接影響的是突觸(信息傳遞)功能的可塑性。

長時(shí)程增強(qiáng)

(long-termpotentiation,LTP)和長時(shí)程抑制(long-termdepression,LTD)是表示突觸傳遞功能的兩個重要電生理指標(biāo),也是可塑性的重要表現(xiàn)形式，LTP作為突觸可塑性的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵呀?jīng)被神經(jīng)科學(xué)家們廣泛地用于學(xué)習(xí)和記憶的研究中，現(xiàn)一般認(rèn)為,LTP和LTD均為某些學(xué)習(xí)記憶活動的細(xì)胞水平的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ),LTP與記憶的形成和儲存有關(guān),而LTD與記憶的整合、遺忘和恢復(fù)突觸產(chǎn)生LTP的能力(去飽和)等有關(guān),兩者共同組成一個能學(xué)習(xí)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)突觸可塑性（LTP、LTD）學(xué)習(xí)記憶AD立題依據(jù)突觸可塑性包括結(jié)構(gòu)和功能兩方面,突觸形立題依據(jù)AD病，在中醫(yī)學(xué)中，屬于神志病，病變在腦，腎為先天之本，藏精，主骨生髓，上通于腦,腦為元神之府，腦和神明有賴于髓之榮養(yǎng),腎精充足則腦髓充足，腦髓充足則神自旺,老年癡呆皆因至腎虧之年，腎氣已衰，精髓乏源，腦失所養(yǎng)，再加其他因素誘發(fā)而成。

百會位居頭之巔頂，又名三陽五會，是督脈與足太陽、手太陽、足少陽、足厥陰等經(jīng)脈交會處，具有安神、補(bǔ)腦益智之功，是治療腦病的首選穴位。

針刺“百會”不但可以激發(fā)局部頭部經(jīng)氣治療腦病，還可以激發(fā)諸經(jīng)經(jīng)氣治療十四經(jīng)病，使機(jī)體陰陽平衡，氣血調(diào)和

腎腧穴位于背部屬于足太陽膀胱經(jīng)，足太陽膀胱經(jīng)與足少陰腎經(jīng)為表里經(jīng)，加上腎腧穴是腎的背腧穴，因此刺激腎腧穴可以起到調(diào)節(jié)腎經(jīng)，滋補(bǔ)腎精的作用

由此可見，百會及腎俞二穴同用，可起到益腎調(diào)督，延緩腦生理老化，從而達(dá)到防治AD的目的。立題依據(jù)AD病，在中醫(yī)學(xué)中，屬于神志病研究內(nèi)容觀察各組大鼠行為學(xué)的改變觀察AD模型大鼠海馬神經(jīng)突觸傳遞功能電生理LTP和LTD的改變與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系電針不同頻率對AD模型大鼠神經(jīng)元突觸可塑性的影響及與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系研究內(nèi)容觀察各組大鼠行為學(xué)的改變觀察AD模型大鼠海馬神經(jīng)突觸研究方法

4123實(shí)驗(yàn)動物及分組主要實(shí)驗(yàn)器材和藥品動物模型制備方法動物取材5誘發(fā)電位的記錄研究方法4123實(shí)驗(yàn)動物及分組主要實(shí)驗(yàn)器材和藥品動物模選用SPF級健康wistar雄性大鼠,3-4月齡,由湖北省實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供（許可證號：SCXK（鄂）

2008-0005）。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)，正常飲食，飲水，7天后進(jìn)行Morris水迷宮測試，剔除不合格者（即反應(yīng)過于遲鈍或靈敏者），保留合格大鼠50只，隨機(jī)分為正常組、模型組、假手術(shù)組、2Hz電針治療組、50Hz電針治療組，共5組，每組10只實(shí)驗(yàn)動物及分組選用SPF級健康wistar雄性大鼠,3-4月齡,由湖北省實(shí)

（1）正常組：與其他治療組用同樣的方法進(jìn)行抓取，但不予任何處理。

（2）模型組：即腦室內(nèi)注射Aβ1-42建立AD大鼠模型(具體方法見下文)。造模成功后，不進(jìn)行任何治療。與其他治療組用同樣的方法進(jìn)行抓取。

（3）假手術(shù)組：制作方法同模型組，僅注射相同量的生理鹽水。與其他治療組用同樣的方法進(jìn)行抓取。

（4）2Hz電針治療組：即在成功造模后立即開始施于電針刺激。針刺大鼠“百會”（頂骨正中）、“腎俞”（第二腰椎下兩旁）穴(穴位定位參照中國針灸學(xué)會實(shí)驗(yàn)針灸分會制定的《動物針灸穴位圖譜》)，百會向前平刺3-5mm，腎俞穴稍向內(nèi)斜刺5mm，接上海產(chǎn)G6805Ⅱ型電針治療儀，百會接負(fù)極，腎俞接正極，左右側(cè)腎俞每日交替使用。選用連續(xù)被，頻率2Hz，電壓2-4V，電流1-2mA，留針20min，每日1次，7日為1療程，療程間休息1日，共治療2個療程。

（5）50Hz電針治療組：電針選用連續(xù)波，頻率50Hz，電壓、電流、操作方法同2Hz電針治療

組。（1）正常組：與其他治療組用同樣的方法進(jìn)行抓取，但不予任何主要實(shí)驗(yàn)器材大鼠腦立體定位儀電針治療儀主要實(shí)驗(yàn)器材大鼠腦立體定位儀電針治療儀主要實(shí)驗(yàn)器材膜片鉗系統(tǒng)Morris水迷宮測試系統(tǒng)主要實(shí)驗(yàn)器材膜片鉗系統(tǒng)Morris水迷宮測試系統(tǒng)主要實(shí)驗(yàn)試劑試劑廠家Aβ1-42注射液Sigma青霉素國藥集團(tuán)生理鹽水國藥集團(tuán)4%多聚甲醛國藥集團(tuán)10%水合氯醛國藥集團(tuán)主要實(shí)驗(yàn)試劑試劑廠家Aβ1-42注射液Sigma青霉素國藥集

實(shí)驗(yàn)前將Aβ1-42用磷酸鹽緩沖液（PBS）配制成１ug/μl的溶液３７℃孵育7d，使其變成聚合狀態(tài)從而具有神經(jīng)毒性；實(shí)驗(yàn)用大鼠置于安靜清潔環(huán)境中，分籠喂養(yǎng)，溫度控制在（２４±２）℃，定時(shí)給予充足清潔飲水和定量大鼠專用飼料。適應(yīng)性喂養(yǎng)１周后，無不良反應(yīng)，飲食、飲水正常者，開始進(jìn)行Morris水迷宮測試篩選，剔除不符合評定標(biāo)準(zhǔn)的大鼠動物模型制備方法實(shí)驗(yàn)前將Aβ1-42用磷酸鹽緩沖液（PBS）評定后的合格大鼠進(jìn)行稱重，用10%的水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉后，俯臥位固定于大鼠腦立體定位儀上保持前后囟在同一水平。無菌環(huán)境下，顱頂區(qū)備皮，剝開皮下筋膜暴露頂骨，進(jìn)行手術(shù)區(qū)皮膚消毒，于兩側(cè)冠狀縫后鉆出小孔，取出碎骨屑，保持硬腦膜的完整。按照“大鼠腦立體定位圖譜”選擇大鼠海馬區(qū)域用微量注射器緩慢將藥物Aβ1-42（10μl）注入海馬（前囟后3.3mm，中線左右各旁開1.5mm，深度3mm），5min內(nèi)注完，注射后留針5min，按1.0mm/min的速度緩慢出針，以免拔針時(shí)藥物溢出。術(shù)后牙托粉封固顱骨孔，縫合皮膚，３日內(nèi)每日肌內(nèi)注射青霉素Ｇ10萬Ｕ防止感染，并經(jīng)Morris水迷宮進(jìn)行模型評價(jià)，剔除不合格者。動物模型制備方法評定后的合格大鼠進(jìn)行稱重，用10%的水合氯醛（300mg/k

動物取材

1、大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉(0.4ml/100g)下斷頭

在以

95%O2+5%CO2

混合氣飽和的

4℃人工腦脊液(artificialcerebrospinalfluid,ACSF)持續(xù)沖洗下,迅速取腦并置于預(yù)先用

ACSF濕潤的濾紙上,沿正中線切開兩大腦半球。2、

由腦腹內(nèi)側(cè)沿皮層邊緣仔細(xì)分離出海馬,在通有混合氣的4℃ACSF中,用切片刀垂直于海馬長軸將其切成厚約400um的腦薄片,所有腦片置于

30～32℃ACSF中,并不斷通入

95%O2+5%CO2混合氣,孵育

1～2h待用。3、ACSF的成分為(mmol/L):NaCl124,KCl5.0,NaH2PO41.25,MgSO42.0,CaCl22.5,NaHCO322.0和葡萄糖

10.0。動物取材誘發(fā)電位記錄

1、LTP(或

LTD)中突觸可塑性改變程度用

HFS(或LFS)后

PS幅值與條件刺激

PS幅值均值之比表示。

2、取一個腦片置于記錄小室內(nèi),將雙極鎢絲電極置于

Schaffer側(cè)支通路,以內(nèi)充

ACSF的兩根玻璃微電極(阻抗

5～15MΩ)分別置于

CA1區(qū)的輻射層和錐體細(xì)胞層,細(xì)胞外記錄群體峰電位（PS）,PS的幅值用第一個下降相最低點(diǎn)到兩個上升波峰連線中點(diǎn)距離來度量。

RecordingelectrodeRecordingelectrode誘發(fā)電位記錄1、LTP(技術(shù)路線技術(shù)路線預(yù)期結(jié)果1234電針對AD模型大鼠海馬神經(jīng)元突觸傳遞功能存在影響圓滿完成實(shí)驗(yàn)大鼠海馬部位注射Aβ1-42成功復(fù)制出AD模型電針不同頻率對AD模型大鼠海馬神經(jīng)元突觸傳遞功能的影響不同5預(yù)期結(jié)果1234電針對AD模型大鼠海馬神經(jīng)元突觸傳遞功能存在可行性分析

1.本課題立題依據(jù)可靠，目的明確。2.所選穴位合理。3.本課題所選擇AD模型是研究阿爾茨海默病的常用模型。4.整個實(shí)驗(yàn)過程和操作熟練掌握，實(shí)驗(yàn)在針灸重點(diǎn)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，擁有先進(jìn)膜片鉗系統(tǒng)，并有長期從事相關(guān)研究的專家教授親自指導(dǎo)。5.實(shí)驗(yàn)指標(biāo)LTP、LTD等已有相關(guān)研究可行性分析

研究進(jìn)度安排時(shí)間內(nèi)容2013年10月——2014年2月采購實(shí)驗(yàn)大鼠，所需試劑，準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)所需器材。2014年3月——2014年5月模型制備，取材等2014年6月——2014年9月實(shí)驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析，準(zhǔn)備開題報(bào)告及論文。研究進(jìn)度安排時(shí)間內(nèi)容20ThankYou!ThankYou!

電針不同頻率對阿爾茨海默病大鼠海馬突觸傳遞功能影響研究

電針不同頻率對阿爾茨海默病大鼠海馬突觸傳遞功能影響研究

課題來源

電針不同頻率調(diào)控糖原合酶激酶3

β對阿爾茨海默病大鼠神經(jīng)突觸可塑性影響及機(jī)制研究

（國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目）課題來源報(bào)告內(nèi)容

4123研究內(nèi)容技術(shù)路線可行性分析目的意義立項(xiàng)依據(jù)研究方法預(yù)期結(jié)果研究進(jìn)度報(bào)告內(nèi)容4123研究內(nèi)容技術(shù)路線可行性分析目的意義目的意義

阿爾茨海默病((Alzheimer.sdisease,AD)又稱老年癡呆是一種以進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶力損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以老年斑(SP)，神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFT)和神經(jīng)元丟失為主要病理改變。

目前全世界有2600萬人患AD，65歲以上的人AD的發(fā)病率為8.4%，我國老年癡呆患者約占世界的四分之一，達(dá)600萬-700萬人，發(fā)病率正以每年1.4%的速度上升,為威脅我國老年健康的主要疾病之一

臨床研究表明,針灸治療AD安全、有效,在治療效果和總有效率方面較藥物具有優(yōu)勢。本實(shí)驗(yàn)以益腎調(diào)督為治則，選取百會和腎腧穴，借助神經(jīng)電生理學(xué)檢測來觀察不同頻率電針對神經(jīng)突觸可塑性的影響，從而研究針灸延緩衰老、防治AD的作用機(jī)制，為臨床治療AD提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目的意義阿爾茨海默病((Alzheimer.s立題依據(jù)AD病因及防治是一個非常復(fù)雜的問題,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對它的研究已深入到基因、分子水平，但仍不能揭示其確切的病因和發(fā)病機(jī)制。學(xué)習(xí)記憶障礙是AD的主要臨床表現(xiàn),而神經(jīng)突觸可塑性被認(rèn)為是學(xué)習(xí)與記憶的重要細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。

突觸是兩個神經(jīng)元間高度局限性、特異性的連接位點(diǎn).在此點(diǎn)神經(jīng)遞質(zhì)由一個突觸前神經(jīng)元軸突終末釋放，激活突觸后神經(jīng)元上受體完成信息傳遞，突觸是神經(jīng)傳輸、加工的樞紐，是受體、通道、蛋白的密集之地其變化是學(xué)習(xí)記憶形成的一個重要的形態(tài)學(xué)和功能學(xué)基礎(chǔ)突觸的喪失會中斷許多功能通路的聯(lián)系，引起多方面的功能障礙，尤其是嚴(yán)重的認(rèn)知和記憶功能障礙從而導(dǎo)致癡呆立題依據(jù)AD病因及防治是一個非常復(fù)雜的問題,立題依據(jù)

突觸可塑性包括結(jié)構(gòu)和功能兩方面,突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)的可塑性表現(xiàn)為突觸活性區(qū)數(shù)量與面積的改變、突觸間隙的變化以及各種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變等;突觸功能的可塑性主要表現(xiàn)為突觸傳遞功能的增強(qiáng)或減弱，而對機(jī)體活動造成直接影響的是突觸(信息傳遞)功能的可塑性。

長時(shí)程增強(qiáng)

(long-termpotentiation,LTP)和長時(shí)程抑制(long-termdepression,LTD)是表示突觸傳遞功能的兩個重要電生理指標(biāo),也是可塑性的重要表現(xiàn)形式，LTP作為突觸可塑性的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵呀?jīng)被神經(jīng)科學(xué)家們廣泛地用于學(xué)習(xí)和記憶的研究中，現(xiàn)一般認(rèn)為,LTP和LTD均為某些學(xué)習(xí)記憶活動的細(xì)胞水平的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ),LTP與記憶的形成和儲存有關(guān),而LTD與記憶的整合、遺忘和恢復(fù)突觸產(chǎn)生LTP的能力(去飽和)等有關(guān),兩者共同組成一個能學(xué)習(xí)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)突觸可塑性（LTP、LTD）學(xué)習(xí)記憶AD立題依據(jù)突觸可塑性包括結(jié)構(gòu)和功能兩方面,突觸形立題依據(jù)AD病，在中醫(yī)學(xué)中，屬于神志病，病變在腦，腎為先天之本，藏精，主骨生髓，上通于腦,腦為元神之府，腦和神明有賴于髓之榮養(yǎng),腎精充足則腦髓充足，腦髓充足則神自旺,老年癡呆皆因至腎虧之年，腎氣已衰，精髓乏源，腦失所養(yǎng)，再加其他因素誘發(fā)而成。

百會位居頭之巔頂，又名三陽五會，是督脈與足太陽、手太陽、足少陽、足厥陰等經(jīng)脈交會處，具有安神、補(bǔ)腦益智之功，是治療腦病的首選穴位。

針刺“百會”不但可以激發(fā)局部頭部經(jīng)氣治療腦病，還可以激發(fā)諸經(jīng)經(jīng)氣治療十四經(jīng)病，使機(jī)體陰陽平衡，氣血調(diào)和

腎腧穴位于背部屬于足太陽膀胱經(jīng)，足太陽膀胱經(jīng)與足少陰腎經(jīng)為表里經(jīng)，加上腎腧穴是腎的背腧穴，因此刺激腎腧穴可以起到調(diào)節(jié)腎經(jīng)，滋補(bǔ)腎精的作用

由此可見，百會及腎俞二穴同用，可起到益腎調(diào)督，延緩腦生理老化，從而達(dá)到防治AD的目的。立題依據(jù)AD病，在中醫(yī)學(xué)中，屬于神志病研究內(nèi)容觀察各組大鼠行為學(xué)的改變觀察AD模型大鼠海馬神經(jīng)突觸傳遞功能電生理LTP和LTD的改變與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系電針不同頻率對AD模型大鼠神經(jīng)元突觸可塑性的影響及與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系研究內(nèi)容觀察各組大鼠行為學(xué)的改變觀察AD模型大鼠海馬神經(jīng)突觸研究方法

4123實(shí)驗(yàn)動物及分組主要實(shí)驗(yàn)器材和藥品動物模型制備方法動物取材5誘發(fā)電位的記錄研究方法4123實(shí)驗(yàn)動物及分組主要實(shí)驗(yàn)器材和藥品動物模選用SPF級健康wistar雄性大鼠,3-4月齡,由湖北省實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供（許可證號：SCXK（鄂）

2008-0005）。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)，正常飲食，飲水，7天后進(jìn)行Morris水迷宮測試，剔除不合格者（即反應(yīng)過于遲鈍或靈敏者），保留合格大鼠50只，隨機(jī)分為正常組、模型組、假手術(shù)組、2Hz電針治療組、50Hz電針治療組，共5組，每組10只實(shí)驗(yàn)動物及分組選用SPF級健康wistar雄性大鼠,3-4月齡,由湖北省實(shí)

（1）正常組：與其他治療組用同樣的方法進(jìn)行抓取，但不予任何處理。

（2）模型組：即腦室內(nèi)注射Aβ1-42建立AD大鼠模型(具體方法見下文)。造模成功后，不進(jìn)行任何治療。與其他治療組用同樣的方法進(jìn)行抓取。

（3）假手術(shù)組：制作方法同模型組，僅注射相同量的生理鹽水。與其他治療組用同樣的方法進(jìn)行抓取。

（4）2Hz電針治療組：即在成功造模后立即開始施于電針刺激。針刺大鼠“百會”（頂骨正中）、“腎俞”（第二腰椎下兩旁）穴(穴位定位參照中國針灸學(xué)會實(shí)驗(yàn)針灸分會制定的《動物針灸穴位圖譜》)，百會向前平刺3-5mm，腎俞穴稍向內(nèi)斜刺5mm，接上海產(chǎn)G6805Ⅱ型電針治療儀，百會接負(fù)極，腎俞接正極，左右側(cè)腎俞每日交替使用。選用連續(xù)被，頻率2Hz，電壓2-4V，電流1-2mA，留針20min，每日1次，7日為1療程，療程間休息1日，共治療2個療程。

（5）50Hz電針治療組：電針選用連續(xù)波，頻率50Hz，電壓、電流、操作方法同2Hz電針治療

組。（1）正常組：與其他治療組用同樣的方法進(jìn)行抓取，但不予任何主要實(shí)驗(yàn)器材大鼠腦立體定位儀電針治療儀主要實(shí)驗(yàn)器材大鼠腦立體定位儀電針治療儀主要實(shí)驗(yàn)器材膜片鉗系統(tǒng)Morris水迷宮測試系統(tǒng)主要實(shí)驗(yàn)器材膜片鉗系統(tǒng)Morris水迷宮測試系統(tǒng)主要實(shí)驗(yàn)試劑試劑廠家Aβ1-42注射液Sigma青霉素國藥集團(tuán)生理鹽水國藥集團(tuán)4%多聚甲醛國藥集團(tuán)10%水合氯醛國藥集團(tuán)主要實(shí)驗(yàn)試劑試劑廠家Aβ1-42注射液Sigma青霉素國藥集

實(shí)驗(yàn)前將Aβ1-42用磷酸鹽緩沖液（PBS）配制成１ug/μl的溶液３７℃孵育7d，使其變成聚合狀態(tài)從而具有神經(jīng)毒性；實(shí)驗(yàn)用大鼠置于安靜清潔環(huán)境中，分籠喂養(yǎng)，溫度控制在（２４±２）℃，定時(shí)給予充足清潔飲水和定量大鼠專用飼料。適應(yīng)性喂養(yǎng)１周后，無不良反應(yīng)，飲食、飲水正常者，開始進(jìn)行Morris水迷宮測試篩選，剔除不符合評定標(biāo)準(zhǔn)的大鼠動物模型制備方法實(shí)驗(yàn)前將Aβ1-42用磷酸鹽緩沖液（PBS）評定后的合格大鼠進(jìn)行稱重，用10%的水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉后，俯臥位固定于大鼠腦立體定位儀上保持前后囟在同一水平。無菌環(huán)境下，顱頂區(qū)備皮，剝開皮下筋膜暴露頂骨，進(jìn)行手術(shù)區(qū)皮膚消毒，于兩側(cè)冠狀縫后鉆出小孔，取出碎骨屑，保持硬腦膜的完整。按照“大鼠腦立體定位圖譜”選擇大鼠海馬區(qū)域用微量注射器緩慢將藥物Aβ1-42（10μl）注入海馬（前囟后3.3mm，中線左右各旁開1.5mm，深度3mm），5min內(nèi)注完，注射后留針5min，按1.0mm/min的速度緩慢出針，以免拔針時(shí)藥物溢出。術(shù)后牙托粉封固顱骨孔，縫合皮膚，３日內(nèi)每日肌內(nèi)注射青霉素Ｇ10萬Ｕ防止感染，并經(jīng)Morris水迷宮進(jìn)行模型評價(jià)，剔除不合格者。動物模型制備方法評定后的合格大鼠進(jìn)行稱重，用10%的水合氯醛（300mg/k

動物取材

1、大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉(0.4ml/100g)下斷頭

在以

95%O2+5%CO2

混合氣飽和的

4℃人工腦脊液(artificialcerebrospinalfluid,ACSF)持續(xù)沖洗下,迅速取腦并置于預(yù)先用

ACSF濕潤的濾紙上,沿正中線切開兩大腦半球。2、

由腦腹內(nèi)側(cè)沿皮層邊緣仔細(xì)分離出海馬,在通有混合氣的4℃ACSF中,用切片刀垂直于海馬長軸將其切成厚約400um的腦薄片,所有腦片置于

30～32℃ACSF中,并不斷通入

95%O2+5%CO2混合氣,孵育

1～2h待用。3