細菌的黏附與侵襲課件

細菌的粘附與侵襲

粘附的定義粘附是細菌的粘附素(配體)與宿主細胞相應(yīng)受體之間的特異性結(jié)合過程，宿主細胞是否具有相應(yīng)的受體及受體的類型，決定著細菌能否在特定的部位粘附定植。非特異性粘附細菌的非特異性粘附主要由細菌與靶細胞表面的分子疏水性、分子間力(范德華氏力)和靜電引力的大小起主要作用，不依賴于粘附素的存在，其中分子的疏水性尤為重要。細菌表面疏水性的強弱，是由疏水物質(zhì)的含量決定的。非特異性粘附的特點細菌或細菌某一成分既能吸附于疏水物質(zhì)(如疏水膠、碳氫化合物等)，又能粘附于上皮細胞，這種粘附可被外源性非特異性疏水物質(zhì)或親水物質(zhì)所阻斷。特異性粘附細菌的特異性粘附是借特異性識別分子(粘附素，配體)和靶細胞表面的相應(yīng)受體相結(jié)合，在空間構(gòu)型上兩個分子相匹配。特異性的分類宿主特異性:由于不同種系動物在遺傳學上的差異，細胞膜表面成分不盡相同。只有宿主組織內(nèi)有相應(yīng)的受體，細菌才能在宿主體內(nèi)定居、繁殖。這由同一細菌表面的抗原性決定。組織特異性:一種細菌只能在特定的組織或器官內(nèi)定居。病原菌

組織淋病奈瑟菌尿道上皮細胞腦膜炎奈瑟菌鼻炎上皮細胞霍亂弧菌腸道上皮細胞百日咳博帶式桿菌呼吸道上皮細鼠傷寒沙門氏菌

腸道上皮細胞幽門螺旋桿菌

胃粘膜釀膿鏈球菌

咽上皮細胞空腸彎曲菌

腸道上皮細胞肺炎支原體

呼吸道上皮細胞同一型細胞表面成分改變后，能被不同的細菌粘附:頰粘膜細胞表面包被血漿纖維粘連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)n)時，有革蘭氏陽性菌粘附，無Fn時，粘附革蘭氏陰性菌，F(xiàn)n存在一定量時，革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均可粘附。配體（粘附素）和受體細菌表面的特異識別分子—配體(ligand)和宿主上皮細胞表面對應(yīng)的識別分子—受體(receptor)是細菌實現(xiàn)粘附的物質(zhì)基礎(chǔ)，二者互相緊密粘附結(jié)合，有利于細菌定居、繁殖、內(nèi)化（侵襲）和致病。配體——粘附素

使細菌粘附在敏感細胞的表面，利于細菌的定植、繁殖,與細菌的致病性密切相關(guān)，稱為粘附素。根據(jù)來源分為菌毛粘附素和非菌毛粘附素。菌毛粘附素：由細菌菌毛分泌并存在于菌毛頂端；非菌毛粘附素：來自于細菌表面的其他組分，如G-菌外膜蛋白和G+菌細胞壁。如鼠疫桿菌的外膜蛋白、A群鏈球菌細胞壁的脂磷壁酸等。菌毛粘附素普通菌毛是細菌的粘附結(jié)構(gòu)，能與宿主細胞表面的特異性受體結(jié)合，菌毛的受體常為糖蛋白或糖脂，與菌毛結(jié)合的特異性決定了宿主感染的易感部位。有菌毛的粘附可抵抗腸蠕動或尿液的沖洗作用而有利于定居，一旦喪失菌毛，其致病力亦隨之消失。許多細菌導致人類疾病,菌毛介導粘附到宿主細胞是哺乳動物感染的第一步。經(jīng)常引發(fā)細菌粘附的細胞骨架的重排。細菌可以通過自然哺乳動物宿主信號轉(zhuǎn)導通路為吞噬作用準備宿主骨架。bacteriaAfimbrialadhesinsonthecellsurfaceAfimbrialAdhesins鞭毛（霍亂弧菌，百日咳桿菌，空腸彎曲菌），血凝素（霍亂弧菌，幽門螺桿菌），表面蛋白（志賀氏菌），LTA（多數(shù)G＋菌）Usedbymanybacteria,particularlyGram(+)Individualproteinsorclustersofproteinonthecellsurface–mediateatightinteractionwithhostcells非菌毛粘附素的粘附機制壁磷壁酸參與細菌粘附的作用機理:a.磷壁酸的游離端可以直接與宿主細胞的表面分子(受體)結(jié)合;b.磷壁酸分子本身帶負電荷，可以與宿主細胞表面帶正電荷的大分子或大分子的某些帶正電區(qū)域結(jié)合;c.磷壁酸與細菌本身的表面蛋白結(jié)合，通過表面蛋白介導再與宿主細胞表面受體結(jié)合，此時的磷壁酸和蛋白質(zhì)共同組成粘附因子?？梢?，壁磷壁酸在致病性方面具有重要意義。脂磷壁酸(lipoteichoic

acid，LTA)粘附機制

a.LTA的重復單位及疏水鏈都含有脂質(zhì)結(jié)合點，它們可以與宿主細胞表面的脂質(zhì)區(qū)結(jié)合，特別是一些糖脂及脂蛋白受體;b.細菌在生長過程中不斷向周圍釋放LTA(或dLTA)，其中一部分LTA是游離的，而另一部分則通過鏈的親水端與細菌表面蛋白結(jié)合，能與膜結(jié)合的疏水端則有機會同宿主細胞表面的脂質(zhì)受體或蛋白質(zhì)受體結(jié)合;c.LTA分子本身帶弱負電荷，它的游離端可直接與宿主細胞表面帶正電荷的大分子(或某一部分)結(jié)合，從而介導細菌的粘附。粘附素與相應(yīng)受體細菌的特異性粘附機制直接粘附間接粘附-經(jīng)由ECM蛋白的粘附EPEC粘附動物模型是細菌粘附研究中應(yīng)用最早最廣泛的實驗模型，可選普通動物，SPF動物，GF動物。形成動物模型的條件中，外因包括所用細菌濃度、實驗步驟、動物機體的免疫狀態(tài)，內(nèi)因動物的品種、細胞的受體系統(tǒng)和選用菌株的特性。細菌粘附動物模型應(yīng)用過程中可長時間觀察細菌的粘附作用，也可用于短期觀察。長時間觀察可通過定期檢測動物排泄物中攻擊菌的數(shù)量間接反映細菌的粘附;短期觀察通過將動物急性處死后，通過對粘附與粘膜上皮表面的細菌進行掃描電鏡觀察或進行細菌培養(yǎng)計數(shù)來確定細菌在粘膜上皮表面有無粘附及粘附能力的強弱。細胞模型近年來應(yīng)用較多的一類細菌粘附模型，具有重復性好和周期短的優(yōu)點，如Hela細胞（人子宮宮頸癌上皮細胞）Int407

細胞(人胚胎腸粘膜細胞系)Vero細胞（非洲綠猴腎異倍體細胞）CHO細胞（中國倉鼠卵巢細胞）等。由于這些細胞系多為來自腫瘤細胞的無限繁殖細胞系已失去某些細胞表面的受體標志，現(xiàn)在開始采用原代培養(yǎng)細胞作為細胞粘附模型用細胞。

粘膜上皮組織體外粘附模型為近年來受到重視的一類細菌粘附模型，此模型可避免動物模型中各種干擾因素的影響，方便、重復性好為一類能直接反應(yīng)細菌粘附素與細胞表面受體相互作用的理想模型。粘膜上皮組織選擇的原則：１.受體特異性原則２.年齡選擇，５月齡以上胎兒的胃腸道粘膜上皮組織表面的大部分受體系統(tǒng)才能充分表達。３.部位選擇，細菌對同一組織器官不同部位粘膜上皮組織的粘附能力有較大差異。粘膜上皮組織體外模型的應(yīng)用注意事項：１.粘膜上皮組織片的制備，先將上皮組織均勻展平后用ＨＣＨＯ固定，粘膜上皮片組織片大小要均勻。２.細菌活力的維持。３.非特異性粘附的減少或避免

。Sectiontwo

Invasion(internalization)ObtainingnutrientsAvoidhostdefenses指某些毒力強或具有侵襲能力的病原菌主動侵入非吞噬細胞（主要為粘膜上皮細胞）的感染過程。侵襲素：EntryIntracellularlife-styleThevacuoleasanintracellularreplicationcompartmentLifeinthecytosolandactin-basedintra-andintercelluarmotilityCellresponsestointracellularpathogensBacterialInvasionStepsinbacterialinvasionTheZipperMechanismofEntryTheTriggerMechanismofEntry一、EntryMechanismsAliciaE.SmithandAriHeleniusScience

304237(2004)TheZipperMechanismofEntry：ContactandadherencePhagocyticcupformationthreesuccessivestepsreceptorclusteringActinpolymerizationMembraneextensionTransientsignalstriggerPhagocyticcupclosureandretraction,andactindepolymerization配體介導的內(nèi)化拉鏈式Zippermodelforinvasin-mediatedBacteriumIntegrinreceptorsECMActinNotsufficientreceptorsforinternalizationofbacteriabecausemostoftheb1-integrinpopulationisboundtoECM...Zippermodelforinvasin-mediatedBacteriumECMActinIntegrinreceptors…butduetohighaffinitybindingofinvasintointegrinsthereceptorsaresequestredandthebacteriabeginstobeinternalizedZippermechanism耶爾森氏菌Yersinia侵襲素Invasin-整合素Integrin李氏桿菌Listeria內(nèi)化素Internalin-鈣粘連蛋白EcadherinInlB-MetGraphicoftheYersiniauptakemechanism（A）“拉鏈”機制，主要見于耶爾森菌和李斯特菌；（B）“觸發(fā)”機制，主要見于沙門菌和志賀菌。排他性，個體行為TheZipperMechanismofEntry：配體介導的內(nèi)化EntryMechanismsAliciaE.SmithandAriHeleniusScience

304237(2004)TheTriggerMechanismofEntry：信號轉(zhuǎn)導的細胞膜皺變Foursuccessivestepspre-interactionstageinteractionstageformationofamacropinocyticpocketActindepolymerizationandclosingofthemacropinocytic“巨胞飲”

pocketEffectormoleculesDedicatedchaperonesTheformationofasignalingplatformavoidprematureassociationoftheeffectormoleculesandtheirproteolyticdegradationLocalizedbutmassiverearrangementofthecellsurfaceCharacterizations:Theformationofintricatefilopodialandlamellipodialstructures觸發(fā)式TriggermechanismSalmonellaSPI-1TypeIIIsecretionsystem“triggers”invasion頂面（api-calsurface）ShigellaMxi-SpaTypeIIIsecrectionsystem“triggers”invasion基底面（basolat-eralface）Mcells:theweakpointoftheintestinalepitheliumMembranousepithelialcells(Mcells)arekeysitesofantigensamplingforthemucosal-associatedlymphoidsystemCossartandSansonetti,Science2004ModelofinvasionoftheintestinalepitheliumbySalmonellaInvasionoftheintestinalepitheliumbyShigellaCossartandSansonetti,Science2004兼容性，群體行為TheTriggerMechanismofEntry：信號轉(zhuǎn)導的細胞膜皺變invitroinvasionandinvivoinvasionexperimentCellmodel：粘附試驗：

1.培養(yǎng)細胞于

24孔細胞培養(yǎng)板（內(nèi)置載玻片）

2.加入細菌（計數(shù)，標記），培養(yǎng)1.5h3.用Hanks液洗6次

4.加入含1%TritonX-100的PBS10min5.吸出各孔懸液,稀釋,傾注培養(yǎng)基，培養(yǎng),計數(shù)菌落數(shù)。細菌侵襲實驗：1.培養(yǎng)細胞于

24孔細胞培養(yǎng)板（內(nèi)置載玻片）

2.加入細菌（計數(shù)，標記），培養(yǎng)1.5h3.用Hanks液洗6次

4.加入含慶大霉素的培養(yǎng)液于各孔,孵育90min5.用PBS洗3次

6.加入含1%Trito