SLE病人及其子代與SLE相關(guān)基因及抗體關(guān)系研究

SLE病人及其子代與SLE相關(guān)基因及抗體關(guān)系研究sle病人及其子代與sle相關(guān)基因及抗體關(guān)系研究【本文關(guān)鍵詞語(yǔ)】紅斑狼瘡,系統(tǒng)性;hla抗原;疾病遺傳易感性;等位基因【內(nèi)容摘要】目的討論緩解期系統(tǒng)性紅斑狼瘡(sle)病人所生后代罹患sle的危險(xiǎn)性。方法應(yīng)用實(shí)時(shí)定量pcr技術(shù)檢測(cè)14例sle病人、病人后代及18例對(duì)照者h(yuǎn)ladrb1*1501、drb1*0301、dqa1*0102、dqb1*0602的頻率，免疫印跡法檢測(cè)入組者ena抗體譜。結(jié)果sle病人組dqa1*0102頻率顯著高于對(duì)照組(rr=2.02,p0.05)，而兩組間drb1*1501、drb1*0301、dqb1*0602頻率比較差別無(wú)顯著意義(p0.05);sle病人組dqb1*0602頻率顯著高于其后代組(rr=2.06,p0.05)，而兩組間drb1*1501、drb1*0301、dqa1*0102頻率比較差別無(wú)顯著性(p0.05);sle后代組dqa1*0102頻率顯著高于對(duì)照組(rr=2.14，p0.05);而兩組間drb1*1501、drb1*0301、dqb1*0602頻率比較差別無(wú)顯著性(p0.05)。sle病人組本身抗體ssa及dsdna出現(xiàn)頻率明顯高于對(duì)照組(p=0.019、0.015)，兩組間ssb及ro52差別無(wú)顯著性(p0.05);sle病人后代組所測(cè)本身抗體檢出率為0。結(jié)論hladqa1*0102為sle的易感等位基因，dqa1*0102有一定的遺傳傾向。經(jīng)過(guò)系統(tǒng)治療到達(dá)緩解期的sle病人生育的后代罹患sle的危險(xiǎn)性無(wú)明顯增長(zhǎng)趨勢(shì)?！颈疚年P(guān)鍵詞語(yǔ)】紅斑狼瘡,系統(tǒng)性;hla抗原;疾病遺傳易感性;等位基因associationofslepatientsandtheirfilialgenerationwithslerelatedgenesandantibodiessunhuanxia,suhouheng,cuijiajia,etal(departmentofimmunologyandrheumatology,qingdaouniversitymedicalcollege,qingdaomunicipalhospital,qingdao266071,china);[abstract]objectivetoexploretheriskofsufferingfromsystemiclupuserythematosus(sle)inchildrenbornbypatientswithsleatparacmasis.methodsthefrequenciesofhladrb1*1501,drb1*0301,dqa1*0102anddqb1*0602allelesof14slepatientsandtheirchildren,and20healthycontrolsweredetectedbyrealtimepcrtechnologyandenaantibodyrepertoirebyimmunoblotting.resultsinslegroup,thefrequencyofdqa1*0102allelewassignificantlyhigherthanthatinthecontrols(rr=2.02,p0.05),andnosignificantdifferencesoffrequenciesofdrb1*1501,drb1*0301,anddqb1*0602allelewerenotedbetweenthetwogroups(p0.05);thefrequencyofdqb1*0602alleleinslepatientswassignificantlyhigherthanthatoftheirchildren(rr=2.06,p0.05),andnosignificantdifferencewasfoundbetweenthemintermsofdrb1*1501,drb1*0301,dqa1*0102allele(p0.05).inslechildrengroup,dqa1*0102allelefrequencywassignificantlyhigherthanthatofthehealthycontrols(rr=2.14,p0.05),andthedifferencesofdrb1*1501,drb1*0301,anddqb1*0602allelewerenotsignificantbetweenthetwogroups.thefrequenciesofautoantibodiesssaanddsdnainslepatientswerehigherthanthatofthecontrols(p=0.019,0.015),andnostatisticaldifferencesofssbandro52wererecordedbetweenthetwogroups(p0.05).thedetectionrateofautoantibodywasnilinthepatients’children.conclusionhladqa1*0102isasusceptibleallelewithgeneticpredisposition.theriskofsufferingsleinsonsordaughtersbornbyslepatients,atcatabasisaftersystematictherapy,isnotincreased.[keywords]iupuserythematosus,systemic;hlaantigen;geneticpredispositiontodisease;allele系統(tǒng)性紅斑狼瘡(sle)是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的難治性本身免疫性疾病。近年來(lái)，隨著、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展、微衛(wèi)星標(biāo)記和掃描技術(shù)的應(yīng)用以及醫(yī)生對(duì)sle認(rèn)識(shí)的不斷提升，sle檢出率呈上升趨勢(shì)。sle固然好發(fā)于20～45歲的育齡女性，但卻不影響女性病人的生育能力。如今，大多數(shù)sle病人能夠成功妊娠并生育健康的孩子[1]，但其后代罹患sle的危險(xiǎn)性一直是人們極其關(guān)注的問(wèn)題。大量的研究表示清楚，遺傳因素在sle的易感性及其表達(dá)方面起側(cè)重要作用，其中hladr2、dr3等基因與sle的相關(guān)性在很大水平上已被證明。有關(guān)sle母親帶有hlaⅱdr2、dr3基因能否增長(zhǎng)其后代患sle的危險(xiǎn)性，經(jīng)系統(tǒng)治療緩解后sle病人生育的后代sle相關(guān)基因及本身抗體的研究，國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少。本研究對(duì)2003—2009年在我院住院和門(mén)診就診的sle病人及其后代進(jìn)行研究,以探究緩解期sle病人所生后代罹患sle的危險(xiǎn)性?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。1對(duì)象與方法1.1研究對(duì)象本文14例sle病人(b組)系無(wú)血緣關(guān)系的山東漢族sle母親，均符合1982年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(acr)修正的sle診斷標(biāo)準(zhǔn)4條或4條以上，年齡26～37歲,平均32歲。14例sle后代均為sle病人經(jīng)系統(tǒng)性治療完全緩解后所生后代(c組),年齡1～17歲,平均6歲(其中2例sle病人后代因年齡小血樣未收集到，故入組sle后代共12例)。同時(shí)，選擇同種族同地域健康對(duì)照者(a組)18例,年齡23～37歲,平均26歲;均排除本身免疫性疾病及其家族史。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1dna抽提受試者收集外周靜脈血2ml于edta抗凝管中。采取invitrigen的purelinktmgenomicdna提取試劑盒,按操作步驟提取上述實(shí)驗(yàn)對(duì)象全血dna,置4℃保存，備用。1.2.2pcr擴(kuò)增采取實(shí)時(shí)定量pcr技術(shù)檢測(cè)所有入組者的hladrb1*1501、drb1*0301、dqa1*0102、dqb1*0602等位基因。目的基因引物序列見(jiàn)表1，各對(duì)引物分別特異性擴(kuò)增等位基因hladrb1*1501、dqa1*0102、dqb1*0602、drb1*0301。另外，設(shè)計(jì)一對(duì)上下游引物βaction作為內(nèi)參照引物,以檢測(cè)擴(kuò)增體系。表1hladrb1*1501、dqa1*0102、dqb1*0602、drb1*0301引物序列等位基因引物序列引物源于cellmolneurobiol[2]，引物均由上海生工生物工程技術(shù)效勞設(shè)計(jì)合成。pcr反應(yīng)體系20μl,各反應(yīng)體系均含有下面組分：帶有rox的platinumsybrgreenqpcrsupermixudg10μl，10μmol/l正向引物(f)1μl,10μmol/l反向引物(r)1μl,模板dna2μl,高壓滅菌蒸餾水6μl。三步循環(huán)法pcr擴(kuò)增條件:預(yù)先50℃udg孵育2min，95℃預(yù)變性2min;然后95℃變性15s，退火溫度退火45s,72℃延伸30s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后4℃保存。hladrb1*0301、drb1*1501、dqa1*0102、dqb1*0602基因退火溫度分別為56.7℃、62.3℃、58.4℃、62.3℃。研究對(duì)象部分pcr產(chǎn)品經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)等位基因擴(kuò)增情況。1.2.3本身抗體ena譜的檢測(cè)采取免疫印跡法檢測(cè)所有研究對(duì)象本身抗體ena譜。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理基因頻率的計(jì)算采取直接計(jì)數(shù)法,用精到準(zhǔn)確檢驗(yàn)四格表資料的fasher確切概率法計(jì)算確切概率p值。對(duì)基因頻率的差別有統(tǒng)計(jì)意義的等位基因進(jìn)一步做疾病相關(guān)性分析，計(jì)算相對(duì)危險(xiǎn)度rr。2結(jié)果2.1sle病人drb1*1501、drb1*0301、dqa1*0102、dqb1*0602等位基因檢測(cè)b組病人dqa1*0102等位基因頻率顯著高于a組(rr=2.02,p0.05);兩組間dqb1*0602、drb1*1501、drb1*0301等位基因頻率比較，差別無(wú)顯著性(p0.05)。b組病人dqb1*0602頻率顯著高于c組，差別有顯著性(rr=2.06,p0.05);而drb1*1501、drb1*0301、dqa1*0102等位基因兩組比較差別無(wú)顯著意義(p0.05)。c組dqa1*0102等位基因頻率顯著高于a組(rr=2.14,p0.05);而其drb1*1501、drb1*0301、dqb1*0602等位基因兩組間比較差別無(wú)顯著性(p0.05)。見(jiàn)表2。2.2各組本身抗體ena譜檢測(cè)b組本身抗體出現(xiàn)頻率均較a、c組高。其中，本身抗體ssa及dsdna出現(xiàn)頻率明顯高于a組(p=0.019,0.015)，而ssb及ro52頻率雖高于a組，但差別無(wú)顯著性(p0.05);a組除ssa、ssb、dsdna、ro52等4種本身抗體外，另外5種抗體均未測(cè)出。c組所測(cè)本身抗體均未測(cè)出。各種抗體出現(xiàn)頻率和百分率見(jiàn)表3。3討論當(dāng)前，國(guó)內(nèi)外對(duì)sle的研究報(bào)道重要集中于不同人種、種族的易感基因及家族同患病例。而同時(shí)將sle病人及其經(jīng)系統(tǒng)治療到達(dá)完全緩解后病人生育的后代，從基因和本身抗體等方面進(jìn)行研究，探表2hladrb1、dqa1、dqb1基因與sle的關(guān)聯(lián)情況表3各組ena譜檢測(cè)情況(例)抗體究緩解期sle病人所生后代罹患sle的危險(xiǎn)性的報(bào)道尚屬罕見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)sle病人、病人后代從基因及抗體等方面進(jìn)行研究，探究sle后代罹患sle的危險(xiǎn)性。本實(shí)驗(yàn)sle相關(guān)基因研究結(jié)果顯示，sle病人dqa1*0102等位基因頻率較a組顯著增高，差別具有顯著性，因而以為dqa1*0102等位基因可能為sle的易感基因，這與國(guó)內(nèi)外dqal*0102對(duì)sle有遺傳易感傾向的結(jié)論相一致[3];b組與a組dqb1*0602等位基因的出現(xiàn)頻率比較差別無(wú)顯著意義，提示無(wú)法確定dqb1*0602等位基因能否為sle的風(fēng)險(xiǎn)基因。本實(shí)驗(yàn)drb1*1501、drb1*0301等位基因頻率b組與a組比較差別無(wú)顯著意義,而對(duì)上海等地區(qū)的研究表示清楚，dqa1*0102、dqb1*0602、drb1*1501、drb5*0101為漢族的sle易感基因型。b組dqa1*0102等位基因頻率與c組比較差別無(wú)顯著性，而c組dqa1*0102等位基因頻率顯著高于a組,這提示sle母親增長(zhǎng)了sle易感等位基因dqa1*0102在其后代中出現(xiàn)的危險(xiǎn)性，dqa1*0102有一定的遺傳易感性。c組等位基因drb1*1501、drb1*0301、dqb1*0602與a組比較差別無(wú)顯著意義，這表示清楚經(jīng)系統(tǒng)性治療到達(dá)緩解期的sle病人所生育的后代與健康者相比攜帶sle相關(guān)基因drb1*1501、drb1*0301、dqb1*0602的危險(xiǎn)無(wú)明顯增長(zhǎng)的趨勢(shì)。sle的特征是產(chǎn)生大量致病性ena[4]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，sle病人多種本身抗體同時(shí)出現(xiàn)的頻率高。其中抗sm抗體和ssb抗體陽(yáng)性率分別為14.3%、7.1%，較sle病人上述2種抗體陽(yáng)性率分別為29.6%、15%的報(bào)道低[5]，可能與病例數(shù)較少有關(guān)?？筪sdna抗體具有較高特異性,幾乎僅發(fā)現(xiàn)于sle病人中。文獻(xiàn)報(bào)道sle病人抗dsdna抗體陽(yáng)性率為52.7%[4]，而本實(shí)驗(yàn)抗dsdna抗體陽(yáng)性率為71.4%，可能與入組sle病人病情處于活動(dòng)期有關(guān)?？筪sdna抗體是sle病情活動(dòng)的指標(biāo)，抗體效價(jià)隨病情緩解而下降。本文抗ssa抗體陽(yáng)性率57.1%，較抗ssa抗體在sle中陽(yáng)性率35%的報(bào)道高[6];許多研究證明抗ssa抗體可造成新生兒狼瘡及先天性房室傳導(dǎo)阻滯，本文sle病人后代9種本身抗體中的5種均未測(cè)出，這從一定水平上說(shuō)明經(jīng)系統(tǒng)性治療到達(dá)緩解期的sle病人所生育的后代，固然有攜帶sle易感基因的危險(xiǎn)，但出現(xiàn)sle本身抗體的概率很低。sle本身抗體與其相關(guān)基因有關(guān)聯(lián)。olsen等[7]報(bào)道，碧眼兒sle的抗dsdna抗體與hladr3、dr2、dq2、dq6相關(guān);國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道，江蘇漢族sle病人抗dsdna抗體與hladrb1*1501、dqa1*0102、dqb1*0602相關(guān)，云南漢族sle病人抗dsdna抗體的產(chǎn)生與dqb1*0602相關(guān)，與drb1*1501*1502dqa1*0102dqb1*0602單倍型相關(guān)，這提示不同種族、地區(qū)sle病人本身抗體與hla的關(guān)聯(lián)存在等位基因差別。本實(shí)驗(yàn)由于病例數(shù)較少,未做本身抗體與基因的相關(guān)分析,b組抗dsdna抗體與等位基因dqa1*0102、dqb1*0602檢出率均相當(dāng)高。hladrb1*0301、dqa1*0102以及dqb1*0602均陽(yáng)性的sle母親，其所生子代出現(xiàn)本身抗體ssa()、ro52()、ssb(+)、dsdna()、nu(+)的頻率高，這提示sle母親存在多個(gè)sle相關(guān)基因、多種本身抗體，十分是ssa、ssb、ro52高滴度可能是sle病人子代罹患sle的高度危險(xiǎn)因素，這與抗ro/ssa和抗la/ssb抗體與新生兒狼瘡高度相關(guān)的報(bào)道結(jié)果相符[8]。buyon[9]的研究也證明，chb病人的母親血清中均含抗ro抗體和(或)抗la抗體。本實(shí)驗(yàn)從hladr、dq基因和ena抗體譜等方面進(jìn)行分析，結(jié)果顯示完全緩解期sle病人生育后代罹患sle的危險(xiǎn)性無(wú)明顯增長(zhǎng)趨勢(shì)，與sle病人病情控制穩(wěn)定后能夠安全妊娠的報(bào)道相符[10]。但有研究報(bào)道7～16歲的sle病人后代的學(xué)習(xí)無(wú)能發(fā)病率增長(zhǎng)，其中誦讀困難最普遍，與誦讀困難相關(guān)的抗體分別為抗ro/ssa抗體和抗磷脂抗體[11]。因而，采集sle病人所生后代的資料,進(jìn)行神經(jīng)功能檢測(cè)等遠(yuǎn)期隨訪是很需要的，但當(dāng)前這方面的資料尚少見(jiàn)?！疽韵聻閰⒖嘉墨I(xiàn)】[1]doriaa,tincania,lockshinm.challengesoflupuspregnancies[j].rheumatology,2008,47ⅲ9ⅲ12.[2]ghabaeem,bayatia,sadeghianh,etal.analysisofhladr2dq6(drb1*1501,dqa1*0102,dqb1*0602)haplotypesiniranianpatientswithmultiplesclerosis[j].cellmolneurobiol,2009,29:109114.[3]schreuderg,hurleyck,marshge,etal.thehladictionary2001:asummaryofhlaa,b,c,dqa1/3/4/5,dqb1allelesandtheirassociationwithserologicallydefinedhlaa,b,c,dr,anddqantigens[j].eurjimmunogenet,2001,28:565596.[4]劉豐海,原江水,宋衛(wèi)青.系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人本身抗體的變化及意義[j].青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,45(1):30.[5]nijd,yaox,panhf,etal.clinicalandserologicalcorrelatesofantismautoantibodi