蛋白質類藥物的分離純課件

四.生物藥物的制備3.蛋白質類藥物的分離純化方法四.生物藥物的制備1生產(chǎn)過程上游構建（基因工程）發(fā)酵生產(chǎn)(發(fā)酵工程)純化制備生產(chǎn)過程上游構建發(fā)酵生產(chǎn)純化制備2●來源：微生物細胞、動物細胞和植物細胞；●分離和純化過程都必須在溫和條件下進行。蛋白質的分離純化●來源：微生物細胞、動物細胞和植物細胞；蛋白質的分離純化3產(chǎn)物特性作用等電點決定離子交換種類及條件相對分子量選擇不同孔徑的介質疏水性與疏水、反相介質結合的程度生物特異性決定親和配基溶解性決定分離體系及蛋白濃度穩(wěn)定性決定工藝采用溫度及流程時間1）蛋白質的基本特性產(chǎn)物特性作用等電點4蛋白質分子中存在游離氨基和羧基，具有兩性解離性質。當?shù)鞍踪|溶液處于某pH時，蛋白質分子解離成正、負離子的趨勢相等，凈電荷為零，此時溶液pH稱為蛋白質的等電點pI。①兩性解離與等電點蛋白質分子中存在游離氨基和羧基，具有兩性解離性質。①5利用蛋白質兩性電離的性質，可通過電泳、離子交換層析、等電聚焦等技術分離蛋白質。利用蛋白質兩性電離的性質，可通過電泳、離子交換層析、6蛋白質分子量很大，分子粒徑為1～100nm，屬親水膠體在水中能形成穩(wěn)定膠體溶液。蛋白質分子表面的水化膜和表面電荷是穩(wěn)定親水溶膠的兩個重要因素。②蛋白質的膠體性質蛋白質分子量很大，分子粒徑為1～100nm，屬親水膠7③蛋白質的沉淀蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作用有關。改變溶液的條件，將影響蛋白質的溶解性質在適當?shù)臈l件下，蛋白質能夠從溶液中沉淀出來蛋白質沉淀——蛋白質的肽鏈相互聚集，從溶液中析出。③蛋白質的沉淀蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所8++蛋白質膠體顆粒的沉淀++++-------+-（沉淀）（疏水膠體）（疏水膠體）++蛋白質膠體顆粒的沉淀+++++-（沉淀）（9●沉淀過程中，蛋白質結構和性質都不發(fā)生變化，在適當條件下，可以重新溶解形成溶液?！袷欠蛛x、純化蛋白質的基本方法。如：等電點沉淀法、鹽析法、有機溶劑沉淀法等?！袢コ冃砸蛩睾螅謴驮锌臻g構象和生物活性。蛋白質的非變性沉淀●沉淀過程中，蛋白質結構和性質都不發(fā)生變化，蛋白質的非變10核糖核酸酶可逆變性核糖核酸酶可逆變性11在強烈沉淀條件下，蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性、蛋白質分子結構和性質均被破壞，沉淀不能重新溶解于水。由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質的結構和性質的變化，所以是變性沉淀。加熱沉淀、強酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀、生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。蛋白質的變性沉淀在強烈沉淀條件下，蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性、蛋白質分子結構和性12鹽析電泳透析層析分子篩超速離心2）蛋白質的分離純化方法鹽析2）蛋白質的分離純化方法13定義：加入大量中性鹽以破壞Pr的穩(wěn)定因素并使從溶液中沉淀析出的現(xiàn)象。原理：破壞Pr兩個穩(wěn)定因素：水化膜和電荷層。中性鹽：(NH4)2SO4；Na2SO4；NaCl等。優(yōu)點：Pr不變性，常用。①鹽析（Saltingout)定義：加入大量中性鹽以破壞Pr的穩(wěn)定因素并①鹽析（Sa14定義：帶電粒子在電場力作用下向著所帶電荷相反方向泳動的現(xiàn)象叫電泳。原理：●Pr分子在溶液中可帶凈負電荷或凈正電荷，可在電場中移動?！癫煌琍r分子攜帶電荷量不同，分子大小也不同，故在電場中泳動速度不同，可彼此分離。②

電泳（electrophoresis)定義：帶電粒子在電場力作用下向著所帶電荷相②電泳（elec15電場中，帶凈電荷Q的粒子所受電荷引力：溶液中，運動粒子與溶液之間存在阻力F阻：當F引=F阻時：電場中，帶凈電荷Q的粒子所受電荷引力：16●粒子泳動速度V與場強E、粒子電量Q成正比；●V與粒子半徑r、溶液粘度η成反比；●V與粒子形狀有關。非球形分子（如線狀DNA）在電泳過程中受到更大的阻力?！窳Ｗ佑緞铀俣萔與場強E、粒子電量Q成正比；17電泳過程示意圖電泳過程示意圖18蛋白質類藥物的分離純課件19A.聚丙烯酰胺凝膠電泳

（PolyacrylamideGelElectrophoresis，PAGE）以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質的電泳方法。聚丙烯酰胺凝膠機械強度好，有彈性，透明，化學性質穩(wěn)定，對pH和溫度變化小，吸附和電滲作用小，是很好的電泳支持介質。丙烯酰胺——單體N，N’-甲叉雙丙烯酰胺——交聯(lián)劑催化合成A.聚丙烯酰胺凝膠電泳

（PolyacrylamideG20CH2=CHC=ONH2丙烯酰胺N,N’-甲叉雙丙烯酰胺CH2=CHC=ONHCH2NHC=O

CH2=CH聚丙烯酰胺CH2-CHC=ONH2CH2-CHC=ONHCH2NHC=O

CH2-CHCH2ˉ

CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CHCH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CH()n()n()m()mCH2=CHC=ONH2丙烯酰胺N,N’-甲叉CH2=CH21常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳主要特點凝膠由上、下兩層凝膠組成上層——大孔徑濃縮膠，濃度2～3％；下層——小孔徑分離膠，濃度5～15％；緩沖液中主要陰離子——Gly-,Cl-；凝膠pH不同電極緩沖液——pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液；濃縮膠——pH6.8的Tris-HCl緩沖液；分離膠——pH8.9的Tris-HCl緩沖液；三種物理效應——樣品濃縮效應，凝膠分子篩效應，電荷效應?！蛛x效果好，分辨率高。常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳主要特點凝膠由上、下兩層凝膠組成22蛋白質類藥物的分離純課件23Tris-GlypH=8.3Tris-GlypH=8.3Tris-HClpH=6.8T=3%Tris-HClpH=8.9T=7.5%Tris-GlypH=8.3Tris-GlypH=824板狀電泳板狀電泳25B.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳當電泳體系含有十二烷基硫酸鈉（SDS）時,電泳遷移率的大小只取決于蛋白質的分子量，可直接由電泳遷移率計算蛋白質分子量。

B.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳當電泳體系含有十二烷基硫26SDS的作用原理

陰離子SDS能與蛋白質結合。當SDS總量為蛋白量的3～10倍、且SDS單位濃度大于1mol./L時，兩者的結合是定量的，每克蛋白質約結合1.4克SDS。蛋白質分子結合SDS后，所帶負電荷的量遠遠超過其原有電荷量，從而消除了不同種類蛋白質間電荷負荷的差異。SDS的作用原理陰離子SDS能與蛋白質結合。27

蛋白質-SDS復合物的電荷密度趨于一致。不同蛋白質-SDS復合物形狀相似（長橢球狀）。電泳過程中，遷移率僅取決于蛋白質-SDS復合物的大小，即取決于蛋白質分子量的大小，而與蛋白質原來所帶電荷量無關。SDS的作用原理

蛋白質-SDS復合物的電荷密度趨于一致。SDS的作用原理28測定蛋白質分子量當?shù)鞍踪|分子量為17,000～165,000時，復合物電泳遷移率與蛋白質分子量的對數(shù)呈線性關系：lgMW=lgK－bm

MW——蛋白質分子量；m——相對遷移率；K——常數(shù)；b——斜率。測定蛋白質分子量當?shù)鞍踪|分子量為17,000～165,00029將已知分子量的標準蛋白質在SDS-聚丙烯酰胺凝膠中的電泳遷移率對分子量的對數(shù)作圖，即可得到一條標準曲線。測定未知分子量的蛋白質在相同條件下的電泳遷移率，根據(jù)標準曲線求得其分子量。測定蛋白質分子量將已知分子量的標準蛋白質在SDS-聚丙烯酰30蛋白質類藥物的分離純課件31SDSseparatesproteinsbyMW十二烷基硫酸鈉SDSseparatesproteinsby32③凝膠色譜

利用生物大分子的相對分子質量差異，進行層析/色譜分離的方法。凝膠層析介質主要是以葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等為原料，通過特殊工藝合成的層析介質。目前已成為生物化學、分子生物學和生物制藥在研究和生產(chǎn)中必不可少的分離介質。

凝膠層析介質是惰性球狀凝膠顆粒，內部為多孔網(wǎng)狀結構，形成很多孔穴。③凝膠色譜利用生物大分子的相對分子質量差異，進33凝膠層析原理

凝膠顆粒內部具有多孔網(wǎng)狀結構，被分離的混合物流過層析柱時，比凝膠孔徑大的分子不能進入凝膠孔內，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內外，在柱內經(jīng)過的路程較長移動速度較慢，最后被洗脫出來。凝膠層析原理凝膠顆粒內部具有多34凝膠色譜分離凝膠色譜分離35蛋白質類藥物的分離純課件36蛋白質類藥物的分離純課件37蛋白質類藥物的分離純課件38蛋白質類藥物的分離純課件39洗脫體積洗脫體積40凝膠色譜分離的應用生物大分子物質的分離純化分子量的測定分級分離溶液濃縮平衡常數(shù)的測定細胞及顆粒的分離凝膠色譜分離的應用生物大分子物質的分離純化41分子量的測定蛋白質通過凝膠柱的速度，即洗脫體積與其分子量有關:LogM=k1-k2Ve（Ve為洗脫體積）先測得幾種標準蛋白質的Ve，并以其分子量對數(shù)對Ve作圖得一直線，再測出待測樣品的Ve，查標準曲線即可確定分子量。LogMABCLogM測V測分子量的測定蛋白質通過凝膠柱的速度，即洗脫體積與其分子量有關42定義:利用離子交換樹脂作為支持物，將帶有不同電荷的Pr進行分離的方法。分類:陽離子交換樹脂,如羧甲基纖維素等，

陰離子交換樹脂,如二乙基氨基乙基纖維素④離子交換色譜定義:利用離子交換樹脂作為支持物，將帶有不同電荷的Pr進行43原理:帶正電荷多的Pr與樹脂結合較強，而帶正電荷少的Pr與樹脂結合則較弱。用不同濃度的陽離子洗脫液，如NaCl溶液進行梯度洗脫，通過Na+的離子交換作用，可以將帶有不同正電荷的Pr進行分離。原理:帶正電荷多的Pr與樹脂結合較強，而帶正電荷少的Pr與樹44帶正電荷多蛋白緊密結合帶負電荷多蛋白流過層析柱陽離子交換樹脂工作示意圖帶正電荷多蛋白緊密結合帶負電荷多蛋白流過層析柱陽離子交換樹脂45離子交換色譜離46柱層析柱47⑤親和層析法瓊脂糖凝膠連接臂蛋白質分子⑤親和層析法瓊脂糖凝膠連接臂蛋白質分子48配體蛋白質蛋白質和配體復合物交聯(lián)試劑載體配體載體與配體交聯(lián)體雜質雜質游離配體配體蛋白質蛋白質和配體復合物交聯(lián)試劑載體配體載體與配體交聯(lián)體49親和色譜親50親和層析的特點純化效率極高：親和層析由于配體與待分離物質進行特異性結合，所以分離提純的效率極高，提純度可達幾千倍。親和層析的特點純化效率極高：親和層析由于配體與待分離物質進行51⑥透析法（Dialysis）定義：利用半透膜把大小分子分開的方法。Pr溶液置半透膜袋中，置流動溶劑（如蒸餾水）中，使小分子雜質（如無機鹽、單糖、雙糖、AA、小肽等透出）蛋白質留于袋中而得到分離。材料：特制的半透膜，截止分子量一般為一萬。應用：1.腹膜透析和人工腎；

2.超濾利用壓力或離心力強行使水和小分子雜質通過超濾膜除去，Pr留在膜上而稱之。操作:⑥透析法（Dialysis）定義：利用半透膜把大小分子分開52透析工作圖透析工作圖53

超速離心超速離心54四.生物藥物的制備3.蛋白質類藥物的分離純化方法四.生物藥物的制備55生產(chǎn)過程上游構建（基因工程）發(fā)酵生產(chǎn)(發(fā)酵工程)純化制備生產(chǎn)過程上游構建發(fā)酵生產(chǎn)純化制備56●來源：微生物細胞、動物細胞和植物細胞；●分離和純化過程都必須在溫和條件下進行。蛋白質的分離純化●來源：微生物細胞、動物細胞和植物細胞；蛋白質的分離純化57產(chǎn)物特性作用等電點決定離子交換種類及條件相對分子量選擇不同孔徑的介質疏水性與疏水、反相介質結合的程度生物特異性決定親和配基溶解性決定分離體系及蛋白濃度穩(wěn)定性決定工藝采用溫度及流程時間1）蛋白質的基本特性產(chǎn)物特性作用等電點58蛋白質分子中存在游離氨基和羧基，具有兩性解離性質。當?shù)鞍踪|溶液處于某pH時，蛋白質分子解離成正、負離子的趨勢相等，凈電荷為零，此時溶液pH稱為蛋白質的等電點pI。①兩性解離與等電點蛋白質分子中存在游離氨基和羧基，具有兩性解離性質。①59利用蛋白質兩性電離的性質，可通過電泳、離子交換層析、等電聚焦等技術分離蛋白質。利用蛋白質兩性電離的性質，可通過電泳、離子交換層析、60蛋白質分子量很大，分子粒徑為1～100nm，屬親水膠體在水中能形成穩(wěn)定膠體溶液。蛋白質分子表面的水化膜和表面電荷是穩(wěn)定親水溶膠的兩個重要因素。②蛋白質的膠體性質蛋白質分子量很大，分子粒徑為1～100nm，屬親水膠61③蛋白質的沉淀蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作用有關。改變溶液的條件，將影響蛋白質的溶解性質在適當?shù)臈l件下，蛋白質能夠從溶液中沉淀出來蛋白質沉淀——蛋白質的肽鏈相互聚集，從溶液中析出。③蛋白質的沉淀蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所62++蛋白質膠體顆粒的沉淀++++-------+-（沉淀）（疏水膠體）（疏水膠體）++蛋白質膠體顆粒的沉淀+++++-（沉淀）（63●沉淀過程中，蛋白質結構和性質都不發(fā)生變化，在適當條件下，可以重新溶解形成溶液?！袷欠蛛x、純化蛋白質的基本方法。如：等電點沉淀法、鹽析法、有機溶劑沉淀法等?！袢コ冃砸蛩睾?，恢復原有空間構象和生物活性。蛋白質的非變性沉淀●沉淀過程中，蛋白質結構和性質都不發(fā)生變化，蛋白質的非變64核糖核酸酶可逆變性核糖核酸酶可逆變性65在強烈沉淀條件下，蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性、蛋白質分子結構和性質均被破壞，沉淀不能重新溶解于水。由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質的結構和性質的變化，所以是變性沉淀。加熱沉淀、強酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀、生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。蛋白質的變性沉淀在強烈沉淀條件下，蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性、蛋白質分子結構和性66鹽析電泳透析層析分子篩超速離心2）蛋白質的分離純化方法鹽析2）蛋白質的分離純化方法67定義：加入大量中性鹽以破壞Pr的穩(wěn)定因素并使從溶液中沉淀析出的現(xiàn)象。原理：破壞Pr兩個穩(wěn)定因素：水化膜和電荷層。中性鹽：(NH4)2SO4；Na2SO4；NaCl等。優(yōu)點：Pr不變性，常用。①鹽析（Saltingout)定義：加入大量中性鹽以破壞Pr的穩(wěn)定因素并①鹽析（Sa68定義：帶電粒子在電場力作用下向著所帶電荷相反方向泳動的現(xiàn)象叫電泳。原理：●Pr分子在溶液中可帶凈負電荷或凈正電荷，可在電場中移動?！癫煌琍r分子攜帶電荷量不同，分子大小也不同，故在電場中泳動速度不同，可彼此分離。②

電泳（electrophoresis)定義：帶電粒子在電場力作用下向著所帶電荷相②電泳（elec69電場中，帶凈電荷Q的粒子所受電荷引力：溶液中，運動粒子與溶液之間存在阻力F阻：當F引=F阻時：電場中，帶凈電荷Q的粒子所受電荷引力：70●粒子泳動速度V與場強E、粒子電量Q成正比；●V與粒子半徑r、溶液粘度η成反比；●V與粒子形狀有關。非球形分子（如線狀DNA）在電泳過程中受到更大的阻力。●粒子泳動速度V與場強E、粒子電量Q成正比；71電泳過程示意圖電泳過程示意圖72蛋白質類藥物的分離純課件73A.聚丙烯酰胺凝膠電泳

（PolyacrylamideGelElectrophoresis，PAGE）以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質的電泳方法。聚丙烯酰胺凝膠機械強度好，有彈性，透明，化學性質穩(wěn)定，對pH和溫度變化小，吸附和電滲作用小，是很好的電泳支持介質。丙烯酰胺——單體N，N’-甲叉雙丙烯酰胺——交聯(lián)劑催化合成A.聚丙烯酰胺凝膠電泳

（PolyacrylamideG74CH2=CHC=ONH2丙烯酰胺N,N’-甲叉雙丙烯酰胺CH2=CHC=ONHCH2NHC=O

CH2=CH聚丙烯酰胺CH2-CHC=ONH2CH2-CHC=ONHCH2NHC=O

CH2-CHCH2ˉ

CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CHCH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CH()n()n()m()mCH2=CHC=ONH2丙烯酰胺N,N’-甲叉CH2=CH75常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳主要特點凝膠由上、下兩層凝膠組成上層——大孔徑濃縮膠，濃度2～3％；下層——小孔徑分離膠，濃度5～15％；緩沖液中主要陰離子——Gly-,Cl-；凝膠pH不同電極緩沖液——pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液；濃縮膠——pH6.8的Tris-HCl緩沖液；分離膠——pH8.9的Tris-HCl緩沖液；三種物理效應——樣品濃縮效應，凝膠分子篩效應，電荷效應?！蛛x效果好，分辨率高。常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳主要特點凝膠由上、下兩層凝膠組成76蛋白質類藥物的分離純課件77Tris-GlypH=8.3Tris-GlypH=8.3Tris-HClpH=6.8T=3%Tris-HClpH=8.9T=7.5%Tris-GlypH=8.3Tris-GlypH=878板狀電泳板狀電泳79B.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳當電泳體系含有十二烷基硫酸鈉（SDS）時,電泳遷移率的大小只取決于蛋白質的分子量，可直接由電泳遷移率計算蛋白質分子量。

B.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳當電泳體系含有十二烷基硫80SDS的作用原理

陰離子SDS能與蛋白質結合。當SDS總量為蛋白量的3～10倍、且SDS單位濃度大于1mol./L時，兩者的結合是定量的，每克蛋白質約結合1.4克SDS。蛋白質分子結合SDS后，所帶負電荷的量遠遠超過其原有電荷量，從而消除了不同種類蛋白質間電荷負荷的差異。SDS的作用原理陰離子SDS能與蛋白質結合。81

蛋白質-SDS復合物的電荷密度趨于一致。不同蛋白質-SDS復合物形狀相似（長橢球狀）。電泳過程中，遷移率僅取決于蛋白質-SDS復合物的大小，即取決于蛋白質分子量的大小，而與蛋白質原來所帶電荷量無關。SDS的作用原理

蛋白質-SDS復合物的電荷密度趨于一致。SDS的作用原理82測定蛋白質分子量當?shù)鞍踪|分子量為17,000～165,000時，復合物電泳遷移率與蛋白質分子量的對數(shù)呈線性關系：lgMW=lgK－bm

MW——蛋白質分子量；m——相對遷移率；K——常數(shù)；b——斜率。測定蛋白質分子量當?shù)鞍踪|分子量為17,000～165,00083將已知分子量的標準蛋白質在SDS-聚丙烯酰胺凝膠中的電泳遷移率對分子量的對數(shù)作圖，即可得到一條標準曲線。測定未知分子量的蛋白質在相同條件下的電泳遷移率，根據(jù)標準曲線求得其分子量。測定蛋白質分子量將已知分子量的標準蛋白質在SDS-聚丙烯酰84蛋白質類藥物的分離純課件85SDSseparatesproteinsbyMW十二烷基硫酸鈉SDSseparatesproteinsby86③凝膠色譜

利用生物大分子的相對分子質量差異，進行層析/色譜分離的方法。凝膠層析介質主要是以葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等為原料，通過特殊工藝合成的層析介質。目前已成為生物化學、分子生物學和生物制藥在研究和生產(chǎn)中必不可少的分離介質。

凝膠層析介質是惰性球狀凝膠顆粒，內部為多孔網(wǎng)狀結構，形成很多孔穴。③凝膠色譜利用生物大分子的相對分子質量差異，進87凝膠層析原理

凝膠顆粒內部具有多孔網(wǎng)狀結構，被分離的混合物流過層析柱時，比凝膠孔徑大的分子不能進入凝膠孔內，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內外，在柱內經(jīng)過的路程較長移動速度較慢，最后被洗脫出來。凝膠層析原理凝膠顆粒內部具有多88凝膠色譜分離凝膠色譜分離89蛋白質類藥物的分離純課件90蛋白質類藥物的分離純課件91蛋白質類藥物的分離純課件92蛋白質類藥物的分離純課件93洗脫體積洗脫體積94凝膠色譜分離的應用生物大分子物質的分離純化分子量的測定分級分離溶液濃縮平衡常數(shù)的測定細