基因重組與基因工程

關(guān)于基因重組與基因工程第一頁，共四十九頁，2022年，8月28日第二節(jié)工具酶第三節(jié)自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組第一節(jié)概述第四節(jié)基因載體第五節(jié)目的基因第六節(jié)重組DNA技術(shù)的基本過程第七節(jié)基因工程在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用第十五章基因重組與基因工程第二頁，共四十九頁，2022年，8月28日分子克?。涸隗w外對DNA分子按照既定的目地和方案進行人工重組，將重組DNA分子導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞中，使其在細(xì)胞中擴增繁殖，以獲得目地DNA分子的大量拷貝，并使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的過程?；蚬こ蹋豪梅肿涌寺〖夹g(shù)操作目地基因，并改變生物遺傳性狀的過程，即采用類似工程技術(shù)的方法，在體外進行基因重組，使重組基因在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中得到表達(dá)。第一節(jié)概述結(jié)束放映返回目錄第三頁，共四十九頁，2022年，8月28日第二節(jié)工具酶指能用于DNA和RNA分子的切割、連接、聚合、反轉(zhuǎn)錄等基因操作有關(guān)的各種酶系，統(tǒng)稱為工具酶。結(jié)束放映返回目錄第四頁，共四十九頁，2022年，8月28日結(jié)束放映返回目錄常用的工具酶(接下表)DNA連接酶連接雙鏈DNA分子中的單鏈切口形成磷酸二酯鍵 工具酶名稱 主要功能DNA聚合酶I5`→3`DNA聚合酶活性限制性核酸識別雙鏈DNA的特異序列，切割DNA5`→3`外切酶活性3`→5`外切酶活性內(nèi)切酶第五頁，共四十九頁，2022年，8月28日常用的工具酶工具酶名稱 主要功能在3`-OH末端進行同一多聚物加尾反轉(zhuǎn)錄酶DNA末端轉(zhuǎn)移酶堿性磷酸酶去除DNA、RNA、dNTP的5`磷酸基團結(jié)束放映返回目錄以RNA或DNA鏈為模板合成互補的cDNA鏈，水解雜化雙鏈中的RNATaqDNA聚合酶能在高溫（72℃）下，以單鏈DNA為模板，從5`→3`方向合成新生的互補DNA鏈 第六頁，共四十九頁，2022年，8月28日<一>限制性核酸內(nèi)切酶按限制性核酸內(nèi)切酶的分解模式，分為三類類型I

有識別位點,切割長短不一且無特異性類型II具有識別和切割的特異性，切割后產(chǎn)生粘性末端或平頭末端類型III

界于I和II之間1、限制性核酸內(nèi)切酶的分類結(jié)束放映返回目錄第七頁，共四十九頁，2022年，8月28日①均能嚴(yán)格地識別特定核苷酸的序列（4－8個堿基對）。②大多數(shù)識別位點具有180度旋轉(zhuǎn)對稱的結(jié)構(gòu)形式（回文結(jié)構(gòu)）。③能在識別的核苷酸序列當(dāng)中或附近切割雙鏈DNA。2、II型酶識別序列特點：結(jié)束放映返回目錄第八頁，共四十九頁，2022年，8月28日3、II型限制性內(nèi)切酶的切割方式三種切割方式

一種是在對稱軸5`側(cè)切割產(chǎn)生5`粘端，EcoRI5`----NGAATTCN----3`

5`----NGAATTGN----3`結(jié)束放映返回目錄3`----NCTTAAGN----5`3`----NCTTAACN----5`5`粘性末端GAATTCCTTAAG第九頁，共四十九頁，2022年，8月28日結(jié)束放映返回目錄另一種是在對稱軸的3`側(cè)切割產(chǎn)生3`粘端，PstI5`----NCTGCAGN----3`3`----NGACGTCN----5`CTGCAGGACGTC5`----NCTGCA3`----NGCTGCAGGN----3`ACGTCN----5`GACGTC3`-粘性末端第十頁，共四十九頁，2022年，8月28日第三種切割方式是在對稱軸處切割，就產(chǎn)生平末端SmaI5`----NCCCGGGN----3`3`----NGGGCCCN----5`CCCGGGGGGCCC5`----NCCC3`----NGGGCCCGGGGGGN----3`CCCN----5`GGGCCC平頭末端結(jié)束放映返回目錄第十一頁，共四十九頁，2022年，8月28日4、某些限制性內(nèi)切酶的識別切割序列結(jié)束放映返回目錄HindⅢNotⅠPstⅠPvuⅡTthⅢBamHⅠClaⅠEcoRⅠEcoRⅤHaeⅢ5`---GGATCC---3`

5`---ATCGAT---3`

5`---GAATTC---3`

5`---GATATC---3`

5`---GGCC---3`

5`---AAGCTT---3`

5`---GCGGCCGC---3`

5`---CTGCAG---3`

5`---CAGCTG---3`

5`---GACNNNGTC---3`

第十二頁，共四十九頁，2022年，8月28日<二>DNA連接酶連接雙鏈DNA分子中的單鏈切口,形成磷酸二酯鍵主要應(yīng)用：DNA片段粘性末端連接。DNA片段平頭末端連接（效率低100-200倍）

結(jié)束放映返回目錄OH5`5`3`3`P連接酶5`5`3`3`第十三頁，共四十九頁，2022年，8月28日<三>末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶能催化dNTP依次聚合到DNA的3`末端。以3`端突出的DNA末端最好。主要應(yīng)用：給目的DNA、cDNA和載體加上互補的多聚脫氧核苷酸尾巴(人工粘性末端)。結(jié)束放映返回目錄第十四頁，共四十九頁，2022年，8月28日結(jié)束放映返回目錄5’3’3’5’5’5’3’3’載體DNA+dGTP目的DNA+dCTP末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶3’3’3’3’PolyGPolyGPolyCPolyCPolyGPolyC同聚物加尾連接法第十五頁，共四十九頁，2022年，8月28日<四>逆轉(zhuǎn)錄酶以

mRNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成與mRNA互補的DNA。合成的產(chǎn)物稱cDNA(complementaryDNA)主要應(yīng)用：逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA及DNA探針，補平和標(biāo)記粘性末端。結(jié)束放映返回目錄第十六頁，共四十九頁，2022年，8月28日mRNA3`…AAAAAA…5`TTTTTT…5`逆轉(zhuǎn)錄酶4種dNTPRNA-DNA…AAAAAA…5`3`3`TTTTTT…5`結(jié)束放映返回目錄RNA-DNA雜交體的生成第十七頁，共四十九頁，2022年，8月28日<五>DNA聚合酶I?主要應(yīng)用：DNA序列分析、催化DNA切口平移制備探針、DNA3`端標(biāo)記、cDNA第二鏈的合成。結(jié)束放映返回目錄第十八頁，共四十九頁，2022年，8月28日第三節(jié)自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組---細(xì)菌中遺傳物質(zhì)的幾種轉(zhuǎn)移形式:接合轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)座結(jié)束放映返回目錄第十九頁，共四十九頁，2022年，8月28日接合染色體DNAF因子轉(zhuǎn)移細(xì)菌接合：指通過細(xì)菌鞭毛的直接接觸，遺傳信息從供體細(xì)胞單向轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞的過程。1、接合作用結(jié)束放映返回目錄供體細(xì)胞受體細(xì)胞第二十頁，共四十九頁，2022年，8月28日2、轉(zhuǎn)化作用轉(zhuǎn)化：自動的獲取或人為的供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型。細(xì)胞溶解新細(xì)菌攝取DNA重組圖15-2轉(zhuǎn)化作用結(jié)束放映返回目錄供體細(xì)胞受體細(xì)胞第二十一頁，共四十九頁，2022年，8月28日3、轉(zhuǎn)導(dǎo)作用轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過病毒或噬菌體介導(dǎo)發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組。溶菌感染重組感染細(xì)菌噬菌體結(jié)束放映返回目錄供體細(xì)胞受體細(xì)胞第二十二頁，共四十九頁，2022年，8月28日4、轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座：由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移或重排。

結(jié)束放映返回目錄第二十三頁，共四十九頁，2022年，8月28日第四節(jié)基因載體一、載體的概念攜帶和運載目的DNA進入宿主細(xì)胞的一些DNA分子,它可以使目的DNA隨著宿主細(xì)胞的增殖而無性繁殖或/和在宿主細(xì)胞中表達(dá)目的DNA。可分為克隆載體和表達(dá)載體。

結(jié)束放映返回目錄第二十四頁，共四十九頁，2022年，8月28日作為載體的DNA分子有質(zhì)粒DNA，噬菌體DNA和病毒DNA等。它們經(jīng)人為改造后在宿主細(xì)胞中只具有自我復(fù)制能力的DNA為克隆載體；能使插入的目的DNA無性繁殖，并使其在宿主細(xì)胞中表達(dá)而特意設(shè)計的DNA為表達(dá)載體。結(jié)束放映返回目錄二、載體的種類第二十五頁，共四十九頁，2022年，8月28日

質(zhì)粒：是存在于細(xì)菌染色體外小型雙鏈環(huán)狀DNA，能在宿主細(xì)胞中獨立地復(fù)制，并在細(xì)胞分裂時傳遞給子代細(xì)胞，其DNA分子上的基因?qū)λ拗骷?xì)胞的代謝活動和抗藥性的表型均有一定的作用。可賦予細(xì)菌特定的表型，如抗生素抗性，是篩選轉(zhuǎn)化子細(xì)菌的遺傳標(biāo)志。結(jié)束放映返回目錄第二十六頁，共四十九頁，2022年，8月28日pUC192686bpEcoRISaclKpnlSmalXmalBamHlXbalHincllPstlSphlHindlllamprlacllacZ`ori0447Amlll806Ppai1765Ctr10i11779Gsul1784Scal2177Xmnl2294Sspl2501Aatll26117EcoO1092674Ndel183Narl235Plac質(zhì)粒pUC19結(jié)束放映返回目錄第二十七頁，共四十九頁，2022年，8月28日三、載體的特點1、載體必須是復(fù)制子，在宿主細(xì)胞中能大量復(fù)制。2、同一限制性核酸內(nèi)切酶在載體上只有單一酶切位點。3、具有選擇性遺傳標(biāo)志。第二十八頁，共四十九頁，2022年，8月28日

一、概念為基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究的需要而分離獲得的某一感興趣的基因（DNA序列），或者是為得到某一感興趣的蛋白質(zhì)或RNA所對應(yīng)的DNA序列。有兩種類型，既cDNA和基因組DNA。二、目的基因的獲?。ㄒ姾螅┑谖骞?jié)目的基因結(jié)束放映返回目錄第二十九頁，共四十九頁，2022年，8月28日第六節(jié)重組DNA技術(shù)的基本過程制備目的基因和相關(guān)載體。將目的基因和載體進行體外連接。將重組的載體DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞。DNA重組體的篩選和鑒定。DNA重組體的擴增表達(dá)。結(jié)束放映返回目錄第三十頁，共四十九頁，2022年，8月28日載體+重組子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染目的DNA細(xì)菌重組DNA增殖篩選含重組質(zhì)粒的細(xì)菌（以質(zhì)粒為載體的DNA克隆過程）結(jié)束放映返回目錄陽性克隆的篩選及擴增第三十一頁，共四十九頁，2022年，8月28日一、目的基因的獲取1、從基因組DNA中分離獲得2、從基因文庫中篩選獲得（基因組文庫及cDNA文庫）3、化學(xué)合成法4、PCR擴增5、mRNA逆轉(zhuǎn)錄結(jié)束放映返回目錄第三十二頁，共四十九頁，2022年，8月28日1、從基因組DNA文庫中篩選獲得（1）基因組DNA文庫：分離組織或細(xì)胞染色體DNA，用限制性核酸內(nèi)切酶將其切割成許多片段后將它們與克隆載體拼接成重組DNA，將所有的重組DNA分子都引入宿主細(xì)胞并進行擴增，得到分子克隆的混合體稱基因組DNA文庫。結(jié)束放映返回目錄第三十三頁，共四十九頁，2022年，8月28日（2）文庫的篩選：直接選擇法：抗藥性選擇、分子探針、標(biāo)志補救（如α-互補篩選）。

免疫學(xué)方法：利用特異抗體與目的基因表達(dá)產(chǎn)物相互作用進行的篩選（如酶免檢測分析）。結(jié)束放映返回目錄第三十四頁，共四十九頁，2022年，8月28日多克隆位點

啟動子裂開的N端裂開的N端外源DNA半乳糖苷酶N端編碼序列染色體重組體pUC18細(xì)菌在含X-gal和乳糖操縱子誘導(dǎo)劑的瓊脂上培養(yǎng)細(xì)菌在含X-gal和乳糖操縱子誘導(dǎo)劑的瓊脂上培養(yǎng)pUC18含重組體pUC18的白色菌落藍(lán)色菌落含載體pUC18的藍(lán)色菌落半乳糖苷酶C端編碼序列轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化amprAmpr(利用互補原理篩選重組子Puc18)pUC182686bppUC182686bp結(jié)束放映返回目錄第三十五頁，共四十九頁，2022年，8月28日藍(lán)白斑篩選重組質(zhì)粒與PCR鑒定重組質(zhì)粒結(jié)束放映返回目錄第三十六頁，共四十九頁，2022年，8月28日硝酸纖維膜菌落瓊脂培養(yǎng)板硝酸纖維膜復(fù)制培養(yǎng)溶菌、中和蛋白酶處理漂洗、烘干1、32P探針雜交

2、放射自顯影

鑒定克?。ê信d趣DNA）

原位雜交結(jié)束放映返回目錄第三十七頁，共四十九頁，2022年，8月28日2、從cDNA文庫中篩選獲得（1）cDNA文庫：將總mRNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，再復(fù)制成雙鏈cDNA的混合體并與適當(dāng)?shù)妮d體進行拼接成重組DNA，使每一個cDNA分子只與一個載體分子拼接成重組DNA。將所有的重組DNA分子都引入宿主細(xì)胞并進行擴增，得到分子克隆的混合體，這樣一個混合體就稱為cDNA文庫（2）cDNA文庫的篩選：（見上）結(jié)束放映返回目錄第三十八頁，共四十九頁，2022年，8月28日3、化學(xué)合成法

用DNA合成儀合成所需要的目的基因片斷。結(jié)束放映返回目錄

PCR是一種在體外利用DNA聚合酶催化反應(yīng)獲得特異序列的基因組DNA或cDNA的技術(shù)。（詳見后第22章PCR）4、PCR法：第三十九頁，共四十九頁，2022年，8月28日二、目的基因與載體的連接粘性末端連接利用人工接頭連接加入同聚體尾連接結(jié)束放映返回目錄第四十頁，共四十九頁，2022年，8月28日細(xì)菌質(zhì)粒CCGGGGCCHpaIICGGCCGGCCCGGCCGGGGCCGGCC哺乳動物DNA片斷HpaIICGGCCGGC+混合、DNA連接酶催化細(xì)菌質(zhì)粒與哺乳動物DNA片斷共同構(gòu)重的重組質(zhì)粒(同一限制酶切割DNA粘性末端的連接)CCGGGGCCCCGGGGCC結(jié)束放映返回目錄第四十一頁，共四十九頁，2022年，8月28日三、重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞常