通過對LB培養(yǎng)基的配制課件

2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作1

分子生物學(xué)實驗

三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院

湖北省生物學(xué)實驗教學(xué)示范中心

2014年3月

2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作1分子生物學(xué)2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作2實驗內(nèi)容

實驗一實驗準(zhǔn)備及培養(yǎng)基的制備與滅菌實驗二質(zhì)粒DNA的提取實驗三瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測質(zhì)粒DNA實驗四大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化實驗五DNA重組（連接反應(yīng)）實驗六植物DNA的提取及瓊脂糖凝膠電泳檢測實驗七PCR基因擴(kuò)增22022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作2實驗內(nèi)容實驗2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作31.實驗準(zhǔn)備：

器皿清洗、試劑配制、滅菌分裝、取用保存

2.離心機(jī)的使用

①打開離心機(jī)電源開關(guān)，進(jìn)入待機(jī)狀態(tài)。

②選擇合適的轉(zhuǎn)頭

③離心管平衡誤差應(yīng)在0.1克以內(nèi)。

④選擇離心參數(shù)：

主要掌握離心機(jī)、微量移液器及高壓滅菌鍋的使用機(jī)及實驗操作注意事項實驗一實驗準(zhǔn)備及培養(yǎng)基制備與滅菌【實驗準(zhǔn)備內(nèi)容】【實驗?zāi)康摹?022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作31.實驗準(zhǔn)備：2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作4⑤將平衡好的離心管對稱放入轉(zhuǎn)頭內(nèi)。蓋好轉(zhuǎn)頭蓋子擰緊螺絲。⑥按下離心機(jī)蓋門，如蓋門未蓋牢，離心機(jī)將不能啟動。

⑦按START鍵，開始離心。離心開始后（特別是高速離心時）應(yīng)等離心速度達(dá)到所設(shè)的速度時才能離開，一旦發(fā)現(xiàn)離心機(jī)有異常（如不平衡而導(dǎo)致機(jī)器明顯震動，或噪音很大），應(yīng)立即按STOP鍵，必要時直接按電源開關(guān)切斷電源，停止繼續(xù)離心，并找出原因。⑧機(jī)器如發(fā)現(xiàn)故障，請及時與有關(guān)人員聯(lián)系。⑨使用結(jié)束后請清潔轉(zhuǎn)頭和離心機(jī)腔，不要關(guān)閉離心機(jī)蓋，利于濕氣蒸發(fā)。

⑩使用結(jié)束后必須登記，注明使用情況。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作4⑤將平衡好的離2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作5離心機(jī)的擺放位置2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作5離心機(jī)的擺放位2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作63.移液器的使用移液器是生化與分子生物學(xué)實驗室常用的小件精密設(shè)備，移液器能否正確是用，直接關(guān)系到實驗的準(zhǔn)確性與重復(fù)性，同時關(guān)系到移液器的使用壽命。移液器由聯(lián)系可調(diào)的機(jī)械裝置和可替換的吸頭組成，不同型號的移液器吸頭有所不同，實驗室常用的移液器根據(jù)最大吸用量有20ul,200ul,1ml等規(guī)格。微量移液器的操作步驟：

①將微量移液器裝上吸頭（不同規(guī)格的移液器用不同的吸頭）

②將微量移液器按鈕輕輕壓至第一停點；

2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作63.移液器的2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作7③垂直握持微量移液器，使吸嘴浸入液樣面下幾毫米，千萬不要將吸嘴直接插到液體底部；

④緩慢、平穩(wěn)地松開控制按鈕，吸上樣液。否則液體進(jìn)入吸嘴太快，導(dǎo)致液體倒吸入移液器內(nèi)部，或吸入體積減少；

⑤等一秒鐘后將吸嘴提離液面

⑥平穩(wěn)地把按鈕壓到第一停點，再把按鈕壓至第二停點以排出剩余液體；

⑦提起微量移液器，使吸嘴在容器壁擦過；

⑧然后按吸嘴彈射器除去吸嘴。

2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作7③垂直握持微量2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作82022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作82022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作9量液操作注意事項a.連續(xù)可調(diào)移液器的取用體積調(diào)節(jié)要輕緩，嚴(yán)禁超過最大或最小量程；b.在移液器吸頭中含有液體時禁止將移液器水平放置，平時不用時置移液器于架上；c.吸取液體時，動作應(yīng)輕緩，防止液體隨氣流進(jìn)入移液器的上部；d.在吸取不同的液體時，要更換吸頭；e.移液器要進(jìn)行定期校準(zhǔn)，一般由專業(yè)人員來進(jìn)行。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作9量液操作注意事2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作104.手提式高壓蒸氣滅菌鍋的使用及注意事項①首先將內(nèi)層鍋取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。切物忘記加水，同時加水量不可過少，以防滅菌鍋燒干而引起炸裂事故。②放入內(nèi)層鍋，并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免妨礙蒸氣流通而影響滅菌效果。三角瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。③加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層鍋的排氣槽內(nèi)。再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓，使螺旋松緊一致，務(wù)使漏氣。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作104.手提式高2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作11④用電加熱，并同時打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內(nèi)的空氣。待冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸氣壓力增加而逐漸上升。當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時，控制熱源，維持壓力至所需時間。本實驗用0.11MPa,121.5℃,20min滅菌。滅菌的主要因素是溫度而不是壓力。因此鍋內(nèi)冷空氣必須完全排盡，才能關(guān)上排氣閥，維持所需壓力。⑤滅菌所需時間到后，切斷電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至“0”時，打開排氣閥，旋松螺栓。打開蓋子，取出滅菌物品。壓力一定要降到“0”時，才能打開排氣閥，開蓋取物。否則就會因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出瓶口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染，甚至灼傷使用者。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作11④用電加熱2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作12⑥將取出的滅菌培養(yǎng)基放入37℃溫箱培養(yǎng)24小時，經(jīng)檢查若無雜菌生長，即可待用。5.實驗室安全與衛(wèi)生6.分組：5人一大組，2～3人一小組，一個實驗桌1套移液槍7.準(zhǔn)備：每組藍(lán)槍頭和黃槍頭各1盒，全班另加2包，EP管1盒或1包，30ml離心管12個，培養(yǎng)皿10個，全班1000ml的LB固體和液體培養(yǎng)基8.實驗報告與成績評定平時成績50％：考勤，實驗操作，實驗結(jié)果，預(yù)習(xí)報告考核成績50％：實驗報告2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作12⑥將取出的滅2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作13【思考題】1.高壓蒸氣滅菌之前，為什么要將鍋內(nèi)冷空氣排盡？滅菌完畢后，為什么待壓力降低到“0”時才能打開排氣閥，開蓋取物？2.移液操作應(yīng)注意哪些事項？2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作13【思考題】12022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作14【LB培養(yǎng)基的制備及滅菌】【實驗?zāi)康摹客ㄟ^對LB培養(yǎng)基的配制，掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟?！緦嶒炘怼?/p>

2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作14【LB培養(yǎng)基2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作15LB培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基，有時又稱為普通培養(yǎng)基。它含有酵母提取物、蛋白胨和NaCl。其中酵母提取物為微生物提供碳源和能源，磷酸鹽、蛋白胨主要提供氮源，而NaCl提供無機(jī)鹽。在配制固體培養(yǎng)基時還要加入一定量瓊脂作凝固劑。瓊脂在常用濃度下96℃時溶化，一般實際應(yīng)用時在沸水浴中或下面墊以石棉網(wǎng)煮沸溶化，以免瓊脂燒焦。瓊脂在40℃時凝固，通常不被微生物分解利用。固體培養(yǎng)基中瓊脂的含量根據(jù)瓊脂的質(zhì)量和氣溫的不同而有所不同。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作15LB培養(yǎng)基是2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作16LB培養(yǎng)基由于這種培養(yǎng)基多用于培養(yǎng)細(xì)菌，因此，要用稀酸或稀堿將其pH調(diào)至中性或微堿性，以利于細(xì)菌的生長繁殖LB固體培養(yǎng)基的配方如下：胰蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl10g瓊脂15～20g水1000mLpH7.02022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作16LB培養(yǎng)基由2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作17【試劑】酵母提取物，蛋白胨，NaCl，瓊脂；mol/LNaOH，1mol/LHCl；試管，三角燒瓶，燒杯，量筒，玻棒，培養(yǎng)基分裝器，天平，牛角匙，高壓蒸汽滅菌鍋，pH試紙（pH5.5～9.0），棉花，牛皮紙，記號筆，麻繩，紗布等。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作17【試劑】酵母2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作18【培養(yǎng)基配制】LB液體培養(yǎng)基：配制每升培養(yǎng)基，應(yīng)在950ml去離子水中加入胰蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl10g搖動容器直至完全溶解，加入200μl5mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，定容1L。LB固體培養(yǎng)基：每升培養(yǎng)基加入15克瓊脂，0.11MPa,121.5℃,20min滅菌。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作18【培養(yǎng)基配制2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作19【操作步驟】1．稱量按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確地稱取酵母提取物、蛋白胨、NaCl放入燒杯中。蛋白胨很易吸潮，在稱取時動作要迅速。另外，稱藥品時嚴(yán)防藥品混雜，一把牛角匙用于一種藥品，或稱取一種藥品后，洗凈、擦干，再稱取另一藥品，瓶蓋也不要蓋錯。2．溶化在上述燒杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解。待藥品全溶解后，補充水分到所需的總體積。如果配制固體培養(yǎng)基，將稱好的瓊脂放入已溶化的藥品中，再加熱溶化，在瓊脂溶化的過程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底使燒杯破裂。最后補足所失的水分。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作19【操作步驟】2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作20【操作步驟】3．調(diào)pH在未調(diào)pH前，先用精密pH試紙測量培養(yǎng)基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入1mol/LNaOH，邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙測其pH值，直至pH達(dá)7.6。反之，則用1mol/LHCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。注意pH值不要調(diào)過頭，以避免回調(diào)，否則，將會影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。對于有些要求pH值較精確的微生物，其pH的調(diào)節(jié)可用酸度計進(jìn)行（使用方法，可參考有關(guān)說明書）。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作20【操作步驟】2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作21【操作步驟】4．分裝按實驗要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)或三角燒瓶內(nèi)。分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。(1)液體分裝分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。(2)固體分裝分裝試管，其裝量不超過管高的1/5，滅菌后制成斜面，分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜(3)半固體分裝試管一般以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作21【操作步驟】2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作22【操作步驟】5．加塞培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角燒瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)而造成污染，并保證有良好的通氣性能。6．包扎加塞后，將全部試管用麻繩捆扎好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞，其外再用一道麻繩扎好。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、日期。三角燒瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結(jié)形式扎好，使用時容易解開，同樣用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、日期。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作22【操作步驟】2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作23【操作步驟】7．滅菌將上述培養(yǎng)基以1.1kg/cm2，121℃，20分鐘高壓蒸汽滅菌。如因特殊情況不能及時滅菌，則應(yīng)放入冰箱內(nèi)暫存。8．?dāng)R置斜面將滅菌的試管培養(yǎng)基冷至50℃左右，將試管棉塞端擱在玻棒上，擱置的斜面長度以不超過試管總長的一半為宜。9．無菌檢查將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24～48小時，以檢查滅菌是否徹底。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作23【操作步驟】2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作24【思考題

】1.培養(yǎng)基配制好后，為什么必須立即滅菌？如何檢查滅菌后的培養(yǎng)基是無菌的？2.在配制培養(yǎng)基的操作過程中應(yīng)注意些什么問題？為什么？2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作24【思考題】2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作25實驗二質(zhì)粒DNA的提取【實驗?zāi)康呐c意義】

質(zhì)粒DNA的提取是從事基因工程工作中的一項基本實驗技術(shù)，但提取方法有很多種，以下介紹一種最常用的方法。

堿裂解法：此方法適用于小量質(zhì)粒DNA的提取，提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切、PCR擴(kuò)增、銀染序列。

通過本實驗學(xué)習(xí)和掌握堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作25實驗二質(zhì)粒2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作26【實驗原理】

堿變性抽提質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離的目的。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作26【實驗原理】2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作27細(xì)菌裂解的方法堿裂解法：0.2molNaOH+1%SDS煮沸裂解法:沸水煮沸40秒SDS裂解法：10%SDS,一般用于質(zhì)粒大量提取。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作27細(xì)菌裂解的方2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作28DNA抽提原理DNA是具有一定結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，一些特殊的環(huán)境會導(dǎo)致DNA的變性，如加熱、極端pH值、有機(jī)溶劑、尿素、酰胺試劑等，而適宜的環(huán)境又可以使DNA復(fù)性。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作28DNA抽提原2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作29DNA抽提原理

SDS是一種陰離子表面活性劑，既可使細(xì)菌細(xì)胞裂解，又可使一些蛋白質(zhì)變性，因此用SDS處理細(xì)菌，會導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁的破裂，從而使質(zhì)粒DNA以及基因組DNA從細(xì)胞中同時釋放出來。

釋放出來的DNA在強(qiáng)堿性（NaOH）條件下發(fā)生變性。再用酸性乙酸鉀來中和，使溶液處于中性，質(zhì)粒DNA將迅速復(fù)性，而基因組DNA因分子較大，難以復(fù)性。離心后，質(zhì)粒DNA將在上清中，而基因組DNA則與細(xì)胞碎片一起沉淀至離心管底部。通過這種方法即可將質(zhì)粒DNA從細(xì)菌中提取出來。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作29DNA抽提原2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作30【儀器、材料與試劑】（一）儀器1.恒溫培養(yǎng)箱2.臺式離心機(jī)3.恒溫?fù)u床4.高壓滅菌鍋（二）材料1.葡萄糖2.三羥甲基氨基甲烷（Tris)3.乙二胺四乙酸（EDTA)4.氫氧化鈉5.十二烷基硫酸鈉（SDS)6.乙酸鉀7.冰乙酸8.氯仿2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作30【儀器、材料2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作31【儀器、材料與試劑】9.乙酸10.胰RNA酶11.氨卞青霉素12.蔗糖13.溴酚藍(lán)14.酚15.8－羥基喹啉16.β巰基乙醇17.鹽酸18.含pUC19質(zhì)粒的大腸桿菌19.EcoRⅠ酶20.吸頭、小指管2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作31【儀器、材料2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作32【儀器、材料與試劑】（三）試劑1.溶液Ⅰ50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mMTris-HClpH8.0。2.溶液Ⅱ0.4mol/LNaOH,2%SDS，用前等體積混合3.溶液Ⅲ60mL的5mol/LKAc11.5ml冰乙酸28.5mLH2O4.TE緩沖液或水（+20μg/mlRNase）:10mmol/L，Tris-HClpH8.01mmol/L，EDTApH8.02022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作32【儀器、材料2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作33【儀器、材料與試劑】5.70％乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回）6.胰RNA酶將RNA酶溶于10mmol/LTris-HCl(pH7.5)、15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的濃度，于100℃加熱15min,緩慢冷卻至室溫，保存于－20℃。7.凝膠加樣緩沖液（6×）40％蔗糖、0.25％溴酚藍(lán)2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作33【儀器、材料2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作34Plasmidchromosome質(zhì)粒(plasmid)

Plasmid獨立于細(xì)菌染色體外的雙鏈環(huán)DNA分子。

2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作34Plasmi2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作35多克隆位點ori復(fù)制起始點遺傳標(biāo)記Amppolylinker2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作35多克隆位點o2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作36

質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)

2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作36質(zhì)粒的結(jié)2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作372022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作372022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作38【操作步驟】一、菌種的活化1.用接種環(huán)挑取

1環(huán)冷凍保存的含質(zhì)粒

DNA大腸桿菌工程菌（本實驗是含人

Bcl-2重組質(zhì)粒的

DH5α），劃線接種于含有

Amp的

LB固體培養(yǎng)基平板上，

37℃倒置培養(yǎng)約

12h(過夜

)。2.用接種針或消毒牙簽從新活化的E.coliDH5α菌平板上挑取一單菌落，接種于2mlLB液體培養(yǎng)中，37℃振蕩培養(yǎng)12h左右，直至對數(shù)生長期。3.取0.5ml菌液轉(zhuǎn)接于50mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)2－3h（OD600nm≤0.5，細(xì)胞數(shù)<108）。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作38【操作步驟】2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作39二、提取步驟1.將2ml含相應(yīng)抗生素（Amp:50μg/ml)deLB培養(yǎng)基加入到試管中，接入上述的含pUC19質(zhì)粒的大腸桿菌，37℃培養(yǎng)過夜。2.取2.0ml培養(yǎng)液在4℃、4000rpm離心2min，吸去培養(yǎng)液，使細(xì)胞沉淀盡可能干燥，3.加100μl的溶液I，使菌體充分懸浮，室溫靜置10min。4.加200μl新配置的溶液II，溫和上下顛倒2-3次，冰浴靜置5min。5.加150μl的溶液III，上下顛倒混勻數(shù)次，冰浴靜置15min。6.4℃，12000rpm離心15min。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作39二、提取步驟2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作407.取上清轉(zhuǎn)至另一離心管中，加等體積（400μl）的酚：氯仿（1：1），充分混勻，室溫，12000rpm離心5min。吸上清液至另一離心管中。8.向上清液中加入2倍體積（約1ml）預(yù)冷的無水乙醇，混勻后，室溫放置5～10min。12000rpm離心5min。倒去上清液，把離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體。9.加1ml預(yù)冷的70%乙醇，4℃，12000rpm離心5min，洗滌沉淀。10.棄上清，沉淀自然干燥后，加20μlTE緩沖液溶解沉淀。11.加2μl10mg/ml的RNaseA酶，-20℃保存。402022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作407.取上清轉(zhuǎn)2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作41產(chǎn)品序列號及組成K2200-50(50次)K2200-250(250次)KarrotenTM

DNAMiniColumn502502mlCollectionTube50250BufferK1(Cellresuspensionsolution)15ml75mlBufferK2(CellLysissolution)15ml75mlBufferK3(Neutralizationsolution)20ml100mlBufferKB(Columnbalancesolution)30ml150mlBufferKW(Wash

solution)使用前加入70%乙醇40ml使用前加入70%乙醇200mlBufferKE(Elution

solution)5ml25mlKarrotenPlasmidDNAExtractionkit

質(zhì)粒DNA提取試劑盒組成

2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作41產(chǎn)品序列號及2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作42KarrotenPlasmidDNAExtractionkit

質(zhì)粒DNA提取試劑盒

1.將帶有目的質(zhì)粒的E.coli接種于裝有5mlLB/適當(dāng)抗生素的10-20ml的培養(yǎng)管中，37℃搖床培養(yǎng)20-24h，以擴(kuò)增質(zhì)粒。用一個10-20ml培養(yǎng)管或培養(yǎng)瓶，其體積至少有培養(yǎng)液的3-4倍。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作42Karrot2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作432.取一KarrotenTMMiniColumn柱裝在一個2ml收集試管上(已備)。加入500μlBufferKB平衡液至柱子內(nèi)，室溫下10,000rpm離心1min，使平衡液完全流過柱子。棄去收集管中的平衡液.（保留空的收集管，繼續(xù)往下使用）。特別注意：柱子不平衡，將導(dǎo)致質(zhì)粒ＤＮＡ產(chǎn)率和純度的減少。

2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作432.取一Ka2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作443.取1.5~5.0ml的菌液，于室溫下12,000rpm離心3min以沉淀菌體。

4.倒出或吸出培養(yǎng)基。往沉淀中加入250μlBufferK1，振蕩使細(xì)胞完全懸浮。細(xì)胞沉淀的完全重懸對于獲得高產(chǎn)量是十分重要的。

5.往重懸混和液中加入250μlBufferK2，輕輕顛倒混勻5-10次。室溫靜置2-5分鐘。避免劇烈混和裂解液，否則會使染色體DNA斷裂而使得到的質(zhì)粒純度降低。裂解反應(yīng)不要超過5min。（當(dāng)使用完BufferK2以后，須蓋緊其瓶蓋保存好，避免與空氣中的CO2反應(yīng)。）2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作443.取1.2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作456.往上述混和液中加入350μlBufferK3(可以預(yù)冷至4℃，也可以在常溫)，并溫和地上下顛倒離心管10-20混勻，直至形成白色絮狀沉淀。7.在4℃，12000rpm離心10min,或者在常溫12000rpm離心3-4min.(提高離心速度和時間有利于沉淀貼壁更加緊密，但是常溫長時間的離心會造成質(zhì)粒DNA降解)8.小心將細(xì)胞離心的上清液轉(zhuǎn)至已平衡的柱子內(nèi)，室溫下10,000rpm離心1min，使裂解液完全流過柱子。棄去收集管中的過濾液.9.把柱子重新裝入2ml收集管中，加入700μlBufferKW(用70%乙醇溶解)至柱子，室溫10,000rpm離心1min，棄去洗滌液。

注意：凍干的BufferKW在使用之前必須按標(biāo)簽的提示用70%乙醇溶解。如果BufferKW在使用之前是置于冰箱中的，須將其拿出置于室溫下。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作456.往上述2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作4610.（可選）重復(fù)用700μl70%乙醇（室溫）洗滌柱子。室溫下10,000rpm離心1min。注意：這一步對需要提取細(xì)胞轉(zhuǎn)染用途的質(zhì)粒來說是必要的。其它的分子生物學(xué)實驗不需要。

11.棄收集管中的濾液，將空柱子套回2ml收集管內(nèi)收集管。室溫下,13,000rpm離心2min以甩干柱子基質(zhì)殘余的液體。（注意：省去這一步將導(dǎo)致殘留乙醇于質(zhì)粒ＤＮＡ中）。

12.把柱子裝在一個干凈的1.5ml離心管上，加入30-50μl（具體取決于預(yù)期的終產(chǎn)物濃度，如果需要高濃度，可以用15μl）的BufferKE(可用滅過菌的超純水或TE緩沖液代替)到柱基質(zhì)膜的中央，室溫放置0.5-1min,13,000rpm離心1min以洗脫DNA。第一次洗脫可以洗出80%左右的結(jié)合DNA。如果再洗脫一次的話，可以把殘余的DNA洗脫出來(不推薦)2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作4610.（可選2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作47常見問題可能原因?qū)Σ逥NA產(chǎn)量低細(xì)胞在加入BufferK2前未完全打散保證完全重懸細(xì)胞細(xì)胞裂解不好適當(dāng)增加Bufferk2的作用時間。BufferK2沒有蓋緊考慮更換新配制K2，成份：0.2MNaOH，1%SDS。純化柱未平衡使用前平衡BufferK2出現(xiàn)沉淀一般出現(xiàn)在低溫時

可以水浴提高溫度溶解產(chǎn)物出現(xiàn)高分子質(zhì)量DNA污染物加入BufferK2后過度混勻細(xì)胞裂解液加入溶液后不要渦旋或劇烈地混勻裂解時間太長適當(dāng)縮短裂解時間產(chǎn)物不能酶切乙醇沒有完全從柱子上去除掉在洗脫前甩干柱子2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作47常見問題可能2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作48【思考題

】1.在質(zhì)粒DNA提取過程中，BufferK1\BufferK2\

BufferK3各起什么作用？2.堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的原理是什么？3.分離基因組DNA和質(zhì)粒DNA有哪些不同之處？4.在BufferKE中為什么要加入EDTA？

【實驗安排】

一個上午2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作48【思考題】2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作49溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0);葡萄糖增稠，使懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部；EDTA抑制DNase的活性。這一步溶液中還可以加入RNase，不受EDTA影響，并且可以在后續(xù)步驟中被除去。其實作用不大，葡萄糖可用水來代替。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作49溶液Ⅰ：502022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作50實驗三瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測質(zhì)粒DNA

【實驗?zāi)康摹?/p>

通過本實驗學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法和技術(shù)

【實驗原理】

DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動。由于糖－磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動。在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。具有不同的相對分子質(zhì)量的DNA片斷泳動速度不一樣，可進(jìn)行分離。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作50實驗三瓊脂糖2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作51【實驗原理】

DNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比關(guān)系。凝膠電泳不僅可分離不同相對分子質(zhì)量的DNA，也可分離相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子。如上次實驗提取的pUC19質(zhì)粒，有3種構(gòu)型：超螺旋的共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA(covalentlyclosedcircularDNA,簡稱CCCDNA),開環(huán)質(zhì)粒DNA,即共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA1條鏈斷裂（opencircularDNA,簡稱OCDNA),線狀質(zhì)粒DNA,即共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA2條鏈發(fā)生斷裂（linearDNA,簡稱LDNA)。這3種構(gòu)型的質(zhì)粒DNA分子在凝膠電泳中的遷移率不同。因此電泳后呈3條帶，超螺旋質(zhì)粒DNA泳動最快，其次為線狀DNA，最慢的為開環(huán)質(zhì)粒DNA。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作51【實驗原理】2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作52影響瓊脂糖電泳遷移的主要因素DNA的大小DNA的構(gòu)象瓊脂糖濃度緩沖液2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作52影響瓊脂糖電2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作53【儀器、材料與試劑】（一）儀器1.恒溫培養(yǎng)箱2.瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)3.臺式離心機(jī)4.高壓滅菌鍋5.凝膠成像系統(tǒng)（二）材料1.三羥甲基氨基甲烷（Tris)2.乙二胺四乙酸（EDTA)3.溴化乙錠4.硼酸5.溴酚蘭6.蔗糖7.瓊脂糖8.DNAmarker9.pUC19質(zhì)粒2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作53【儀器、材料2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作54【儀器、材料與試劑】（三）試劑1.5×TBE(5倍體積的TBE貯存液)配1000ml5×TBE:Tris54g硼酸27.5g0.5mol/LEDTA20mlpH8.02.凝膠加樣緩沖液（6×）溴酚藍(lán)0.25％蔗糖40％3.瓊脂糖4.EB0.5μg/ml5.EcoRⅠ酶2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作54【儀器、材料2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作55【實驗步驟】1.取5μl質(zhì)粒DNA溶液，加1μl酶切緩沖液，EcoRⅠ酶1μl（2U),無菌水補至總體積10μl，37℃保溫3小時，加凝膠上樣緩沖液（6×）2μl，準(zhǔn)備電泳。酶切溶液：EcoRⅠ酶切位點5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-3’DNABufferEcoRⅠddH2OTotal5μl1μl1μl3μl10μl2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作55【實驗步驟】2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作562022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作562022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作572022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作572022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作582.制備瓊脂糖凝膠稱取0.3g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入30ml0.5×TBE緩沖液，置微波爐或水浴加熱至完全溶化，取出搖勻，則為1％瓊脂糖凝膠。3.膠板的制備①取有機(jī)玻璃內(nèi)槽，洗凈，晾干，用橡皮膏將有機(jī)玻璃內(nèi)槽的兩端邊緣封好（一定封嚴(yán)，不能留縫隙）。②將有機(jī)玻璃內(nèi)槽放置于一水平位置，并放好樣品梳子。③將冷卻到60℃左右的瓊脂糖凝膠液，緩緩倒入有機(jī)玻璃內(nèi)槽，直至有機(jī)玻璃板上形成一層均勻的膠面（注意不要形成氣泡）【實驗步驟】2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作582.制備瓊脂2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作59【實驗步驟】

④待膠凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放在電泳槽內(nèi)。⑤加入電泳緩沖也至電泳槽中。4.加樣用移液槍將已加入上樣緩沖液的DNA樣品加入加樣孔（記錄電樣順序及點樣量）。5.電泳①接通電泳槽與電泳儀的電源（注意正負(fù)極，DNA片斷從負(fù)極向正極移動）。DNA的遷移速度與電壓成正比，最高電壓不超過5V/cm。②當(dāng)溴酚藍(lán)燃料移動到距凝膠前沿1～2cm處，停止電泳。6.染色將電泳后的凝膠浸入EB溶液中，染色15min,以觀察在瓊脂糖凝膠中的質(zhì)粒DNA帶（戴手套操作）。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作59【實驗步驟】2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作60【凝膠電泳操作注意事項】1.緩沖系統(tǒng)：在沒有離子存在時，電導(dǎo)率最小，DNA不遷移，或遷移極慢，在高離子強(qiáng)度的緩沖液中，電導(dǎo)很高并產(chǎn)熱，可能導(dǎo)致DNA變性，因此應(yīng)注意緩沖液的使用是否正確。長時間高壓電泳時，常更新緩沖液或在兩槽間進(jìn)行緩沖液的循環(huán)是可取的。2.瓊脂糖：不同廠家、不同批號的瓊脂糖，其雜質(zhì)含量不同，影響DNA的遷移及熒光背景的強(qiáng)度，應(yīng)有選擇地使用。3.凝膠的制備：凝膠中所加緩沖液應(yīng)與電泳槽中的相一致，溶解的凝膠應(yīng)及時倒入板中，避免倒入前凝固結(jié)塊。倒入板中的凝膠應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡，影響電泳結(jié)果。4.樣品加入量：一般情況下，0.5cm寬的梳子可加0.5ug的DNA量，加樣量的多少依據(jù)加樣孔的大小及DNA中片段的數(shù)量和大小而定，過多的量會造成加樣孔超載，從而導(dǎo)致拖尾和彌散，對于較大的DNA此現(xiàn)象更明顯。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作60【凝膠電泳操2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作61【凝膠電泳操作注意事項】5.電泳系統(tǒng)的變化會影響DNA的遷移，加入DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物進(jìn)行判定是必要的。6.DNA樣品中鹽濃度會影響DNA的遷移率，平行對照樣品應(yīng)使用同樣的緩沖條件以消除這種影響。7.DNA遷移率取決于瓊脂糖凝膠的濃度，遷移分子的形狀及大小。采用不同濃度的凝膠有可能分辨范圍廣泛的DNA分子，制備瓊脂糖凝膠可根據(jù)DNA分子的范圍來決定凝膠的濃度。小片段的DNA電泳應(yīng)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳以提高分辨率。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作61【凝膠電泳操2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作62【實驗結(jié)果】在凝膠成像系統(tǒng)中紫外燈觀察拍照（戴手套操作）。DNA存在處顯出桔紅色熒光條帶。1234結(jié)果照片圖1.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物（marker)2.pUC19質(zhì)粒DNA經(jīng)EcoRⅠ完全酶解3.pUC19質(zhì)粒DNA經(jīng)EcoRⅠ部分酶解4.自提的pUC19質(zhì)粒DNA（此結(jié)果提得較好，為1條帶，以超螺旋質(zhì)粒DNA為主。有時結(jié)果是3條帶，分別為超螺旋質(zhì)粒，線狀質(zhì)粒和開環(huán)質(zhì)粒。還有時結(jié)果為2條帶）2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作62【實驗結(jié)果】2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作63【思考題】1.如何提高瓊脂糖凝膠電泳的分辨率？2.EB染色的特點和注意事項是什么？3.酶切緩沖液的功能是什么？4.凝膠加樣緩沖液的兩種成分的作用是什么？5.如果電泳圖譜出現(xiàn)連續(xù)模糊的帶紋，原因是什么？【實驗安排】時間實驗內(nèi)容14:00-17:008:00-11:00質(zhì)粒DNA的酶切17:00-18:3011:00-12:30瓊脂糖凝膠電泳18:30-19:0012:30-13:00染色、拍照2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作63【思考題】12022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作64實驗四大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化【實驗?zāi)康摹繉W(xué)習(xí)氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞和將外源質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入受體菌細(xì)胞的技術(shù)及轉(zhuǎn)化體篩選的技術(shù)方法?！緦嶒炘怼扛惺軕B(tài)細(xì)胞(Competentcells):

受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl等化學(xué)試劑法）的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許多有外源DNA的載體分子通過的感受態(tài)細(xì)胞(competentcell)。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作64實驗四大腸2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作65【實驗原理】轉(zhuǎn)化（transformation）：是將異源DNA分子引入受體細(xì)胞，使其獲得新的遺傳性狀的一種技術(shù)方法。進(jìn)入細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制表達(dá)，才能實現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制－修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作65【實驗原理】2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作66【實驗原理】轉(zhuǎn)化的方法：1.化學(xué)的方法(熱擊法)；使用化學(xué)試劑（如CaCl2）制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過熱擊處理將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞；2.電轉(zhuǎn)化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過高壓脈沖的作用將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作66【實驗原理】2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作67【實驗原理】克隆的篩選：主要用不同抗生素基因篩選。常用的抗生素有：氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素等；2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作67【實驗原理】2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作68【影響轉(zhuǎn)化率的因素】細(xì)胞生長狀態(tài)和密度。轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和濃度。試劑的質(zhì)量。防止雜菌和其它外源DNA的污染。

2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作68【影響轉(zhuǎn)化率2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作692022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作692022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作702022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作702022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作712022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作712022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作72【儀器、材料和試劑】（一）儀器1.無菌超凈臺2.離心機(jī)3.電熱恒溫水浴鍋4.分光光度計5.恒溫?fù)u床6.恒溫箱7.超低溫冰箱（二）材料和試劑1.菌株：E.coliDH5α2.質(zhì)粒：PUC19質(zhì)粒3.LB培養(yǎng)基4.含抗菌素的LB平板培養(yǎng)基（氨芐青霉素，濃度

50-100μg／ml5.預(yù)冷CaCl2溶液（0.1mol／L）2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作72【儀器、材料2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作73【實驗步驟】（一）菌種活化

1.用接種環(huán)直接取凍存的大腸桿菌DH5α，在LB培養(yǎng)基平板表面劃線，于37℃培養(yǎng)16小時。

2.挑取一個單菌落，轉(zhuǎn)到3－5mlLB培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)3－5小時

3.將培養(yǎng)液全部轉(zhuǎn)到100mlLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)2－3小時，到OD600＝0.3－0.42022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作73【實驗步驟】2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作74【實驗步驟】（二）感受態(tài)大腸桿菌的制備1.從新活化的E.coliDH5α菌平板上挑取一單菌落，接種于2mlLB液體培養(yǎng)中，37℃振蕩培養(yǎng)12h左右，直至對數(shù)生長期。2.取1.5ml菌液轉(zhuǎn)接于30mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)2－3h（OD600nm≤0.4-0.5，細(xì)胞數(shù)<108,此為實驗成功關(guān)鍵）。3.將菌液轉(zhuǎn)到30ml離心管中，冰上冷卻10min；2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作74【實驗步驟】2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作75【實驗步驟】4.于4℃，4000r／min離心10min；5.倒凈上清培養(yǎng)液，將管倒置10min以便培養(yǎng)液流盡；6.用6ml冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液輕輕懸浮細(xì)胞，冰浴30min；7.0～4℃，4000r／min離心10min，回收細(xì)胞；8.棄上清，加1.2ml冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液，小心懸浮細(xì)胞，分裝，200μl一份，冰上放置片刻后，即制成了感受態(tài)細(xì)胞懸液。9.制備好的感受態(tài)細(xì)胞懸液可直接用于轉(zhuǎn)化實驗，也可加入占總體積15％左右高壓滅菌過的甘油，混勻后分裝于1.5ml離心管中，置于-70℃條件下，可保存半年至一年。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作75【實驗步驟】2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作76（三）細(xì)胞轉(zhuǎn)化編號組別質(zhì)粒DNA/μlTEbuffer/μl0.1mo1／LGaCl2/μl感受態(tài)菌液1受體菌ck———10——2002質(zhì)粒ck10（0.5μg）——200——3陽性ck10（0.5μg）————2004轉(zhuǎn)化實驗組10（0.5μg）————2002022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作76（三）細(xì)胞轉(zhuǎn)2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作77【實驗步驟】（三）細(xì)胞轉(zhuǎn)化1.取200μl感受態(tài)細(xì)胞懸液加入pUC19質(zhì)粒DNA10μl(10-100ng),輕輕搖勻，冰上放置20-30min。同時設(shè)置兩管對照：受體菌對照：200μl感受態(tài)細(xì)胞＋10μlTEbuffer質(zhì)粒對照：200μl0.1mo1／LGaCl2溶液＋10μl質(zhì)粒DNA溶液陽性對照：200μl感受態(tài)細(xì)胞＋10μl純質(zhì)粒2.42℃水浴中保溫1－2min，然后迅速冰上冷卻2min。3.立即向上述管中加入0.8mlLB液體培養(yǎng)基，（即得轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液），搖勻后于37℃振蕩培養(yǎng)約60min，使受體菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并使轉(zhuǎn)化體表達(dá)抗生素基因產(chǎn)物(Ampr)。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作77【實驗步驟】2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作78【實驗步驟】（四）平板培養(yǎng)1.取各樣品培養(yǎng)液0.1ml，涂在含100μg/mlAmp的LB平板培養(yǎng)基上。2.菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)皿，于

37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12-16小時，待菌落生長良好而又未互相重疊時停止培養(yǎng)。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作78【實驗步驟】2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作79【實驗結(jié)果】在含氨卞青霉素的瓊脂平板上生長的菌落即為含有pUC19質(zhì)粒的大腸桿菌含有pUC19質(zhì)粒的大腸桿菌2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作79【實驗結(jié)果】2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作80【實驗結(jié)果】

不含抗菌素平板含抗菌素平板結(jié)果說明受體菌對照組有大量菌落長出無菌落長出本實驗未產(chǎn)生抗藥性突變株DNA對照組無菌落長出無菌落長出質(zhì)粒DNA溶液不含雜菌轉(zhuǎn)化實驗組（陽性對照）有大量菌落長出有菌落長出質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞便產(chǎn)生抗藥性表3.1培養(yǎng)皿內(nèi)各實驗組菌落的生長狀況及結(jié)果分析2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作80【實驗結(jié)果】2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作81【計算轉(zhuǎn)化率】

統(tǒng)計每個培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)。轉(zhuǎn)化后在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉(zhuǎn)化子，根據(jù)此皿中的菌落數(shù)可計算出轉(zhuǎn)化子總數(shù)和轉(zhuǎn)化頻率，公式如下：

轉(zhuǎn)化子總數(shù)＝菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積／涂板菌液體積轉(zhuǎn)化頻率（轉(zhuǎn)化子數(shù)／每mg質(zhì)粒DNA）＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)／質(zhì)粒DNA加入量(mg)

感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)＝對照組２菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×菌液總體積／涂板菌液體積感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)／感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作81【計算轉(zhuǎn)化率2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作82【思考題】1.感受態(tài)細(xì)胞有何特點？如何保證它的質(zhì)量2.為什么要設(shè)置陰性對照？3.如陰性對照中長出菌，原因？4.在Amp培養(yǎng)板中，菌的密度過高或培養(yǎng)時間過長時會在陽性菌的周圍長出一些小的衛(wèi)星菌落，它們是Amps的，原因？5.還有哪些方法可以將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞？各有什么優(yōu)缺點？【實驗安排】從制備感受態(tài)細(xì)胞到轉(zhuǎn)化一天可完成2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作82【思考題】12022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作83實驗五重組DNA（連接反應(yīng)）【試驗?zāi)康摹客ㄟ^本實驗學(xué)會重組DNA連接及鑒定重組子的方法【實驗原理】外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)過酶切的載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接。連接酶有兩種：E.coli和T4DNA連接酶。兩種連接酶都有將具黏性末端的DNA片段之間的連接在一起的功能。T4DNA連接酶還能使兩個具平末端的雙鏈DNA連接在一起。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作83實驗五重組2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作84【實驗原理】為防止載體本身的自連，可通過牛小腸堿性磷酸酶(CIP)處理克服：牛腸道分離，切除DNA、RNA和dNTP上的5‘磷酸基團(tuán),從DNA片段上除去5’磷酸以防自身連接。DNA重組的方法主要有：具互補黏性末端片段之間的連接和具平末端DNA片段之間的連接重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后，還需對轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行篩選鑒定。842022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作84【實驗原理】2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作85【實驗原理】利用α互補現(xiàn)象進(jìn)行篩選是最常用的一種鑒定方法:

載體：含有β-半乳糖苷酶基因lacZ的調(diào)控序列和β-半乳糖苷酶N端146個aa的編碼序列（α肽鏈）

宿主：缺失了lacZ基因，可編碼β-半乳糖苷酶C端序列

α-互補：宿主lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體可以與質(zhì)粒載體帶有完整的近操縱基因區(qū)段的β-半乳糖苷酶隱性突變體之間實現(xiàn)互補。

在這樣的系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的細(xì)菌獲得了amp抗性，自連質(zhì)粒可以合成正常的酶，而重組質(zhì)粒的細(xì)菌不能合成正常的酶。在培養(yǎng)基中添加酶的誘導(dǎo)物IPTG，乳糖的類似物X-gal乳糖酶作用下顯示藍(lán)色，藍(lán)斑是載體自連產(chǎn)物，而白色克隆是重組質(zhì)粒。852022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作85【實驗原理】2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作862022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作862022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作872022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作872022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作882022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作882022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作892022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作892022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作902022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作902022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作912022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作912022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作922022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作922022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作93pUC192686bpEcoRISaclKpnlSmalXmalBamHlXbalHincllPstlSphlHindlllamprlacllacZ`ori0447Amlll806Ppai1765Ctr10i11779Gsul1784Scal2177Xmnl2294Sspl2501Aatll26117EcoO1092674Ndel183Narl235Plac質(zhì)粒pUC19932022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作93pUC19E2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作94

質(zhì)粒pUC19示意簡圖942022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作94質(zhì)粒p2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作95多克隆位點啟動子裂開的N端裂開的N端外源DNA半乳糖苷酶N端編碼序列pUC192686bppUC192686bp染色體重組體pUC19細(xì)菌在含X-gal和乳糖操縱子誘導(dǎo)劑IPTG的瓊脂上培養(yǎng)細(xì)菌在含X-gal和乳糖操縱子誘導(dǎo)劑的瓊脂上培養(yǎng)pUC19含重組體pUC19的白色菌落藍(lán)色菌落含載體pUC19的藍(lán)色菌落半乳糖苷酶C端編碼序列轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化利用互補原理篩選重組子pUC19amprampr2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作95多克隆位點啟2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作96【儀器、材料和試劑】（一）儀器1.臺式離心機(jī)2.電熱恒溫水浴鍋3.恒溫?fù)u床4.恒溫培養(yǎng)箱5.超低溫冰箱（二）材料和試劑1.菌株：E.coliDH5α2.質(zhì)粒：PUC19質(zhì)粒3.LB培養(yǎng)基4.含抗菌素的LB平板培養(yǎng)基（氨芐青霉素，濃度

50-100μg／ml）5.培養(yǎng)皿、接種針、玻璃涂棒、試管、酒精燈、鑷子、牙簽等6.預(yù)冷CaCl2溶液（0.1mol／L）962022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作96【儀器、材料2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作97【儀器、材料和試劑】7.二甲基甲酰胺8.T4DNA連接酶9.λDNA10.EcoRⅠ酶11.3mol/LKAc(pH5.2)12.Xgal:將Xgal溶于二甲基甲酰胺，配成20mg/ml，不需過濾滅菌，分裝小包裝，避光貯存于－20℃。13.IPTG:取2gIPTG溶于8ml雙蒸水中，再用雙蒸水補至10ml,用0.22μm慮膜過濾除菌，每份1ml,貯存于－20℃。14.TE緩沖液

10mmol/LTris.HCl(Ph8.0)1mmol/LEDTA972022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作97【儀器、材料2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作98【實驗步驟】（一）質(zhì)粒DNA的提取按實驗一的方法提取質(zhì)粒（二）制備重組DNA1、在滅菌的Eppendorf管中，加入pUC19質(zhì)粒1μl（2ug/ul），2μl酶切緩沖液，1μlEcoRI酶，無菌雙蒸水15μl，至反應(yīng)混合物總體積為20μl，離心均勻，37℃反應(yīng)3h(酶及緩沖液應(yīng)放在冰上）。982022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作98【實驗步驟】2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作992、在另一無菌Eppendorf管中，加入λDNA1.5ug,加入1μl酶切反應(yīng)液，1μl（2U）EcoRI酶，無菌雙蒸水補到10μl，37℃反應(yīng)3h。3、反應(yīng)完畢后各取2μl酶解液做電泳分析。4、分別將余下的酶解液加入1/10體積的3mol/LKAc（pH5.2)溶液，再加入2倍體積的無水乙醇，－20℃冰箱，2h（沉淀DNA）。12000r/min4℃離心15min，棄上清，加70％乙醇洗滌沉淀物，再離心，去上清，真空干燥后，加5μlTE溶液。5、將酶切后的2個DNA片斷混合于一管中，加T4DNA連接酶緩沖液2.5μl，T4DNA連接酶1μl

,加16.5μl無菌雙蒸水,14℃保溫14h，并做轉(zhuǎn)化實驗。【實驗步驟】992022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作992、在另一無2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作100【實驗步驟】（三）制備涂菌的瓊脂板LB培養(yǎng)基含10μg/ml氨芐青霉素，瓊脂15g/l倒入培養(yǎng)皿，凝固4℃保存。（四）制備感受態(tài)細(xì)胞1、按實驗3的方法制備感受態(tài)細(xì)胞。2、在200μl新制備的感受態(tài)細(xì)胞中，記入5μl連接產(chǎn)物，混勻，冰上放置30min，同時做兩個對照管。受體菌對照：200μl感受態(tài)細(xì)胞＋2μl無菌水質(zhì)粒對照：200μl0.1mo1／LCaCl2溶液＋2μl質(zhì)粒DNA溶液3、將管放到42℃水浴中保溫1－2min，4、冰上冷卻1－2min。5、每管中加入0.8mlLB液體培養(yǎng)基，（輕輕混勻）。37℃溫浴45min，慢搖，1002022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作100【實驗步驟2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作101【實驗步驟】6、在預(yù)制的LB瓊脂板上，加40μl20mg/mlXgal和4μl200mg/mlIPTG溶液，并用滅菌玻璃推子（酒精燈上燒后冷卻），均勻涂布于瓊脂凝膠表面。7、將適當(dāng)體積（200μl）已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞均勻涂在上面的培養(yǎng)皿上，將平皿放置37℃溫箱30min，至液體被吸收。8、倒置平皿37℃培養(yǎng)12－16h,出現(xiàn)菌落。其中白色菌落為重組DNA質(zhì)粒。1012022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作101【實驗步驟2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作102【實驗結(jié)果】

經(jīng)12－1h培養(yǎng)后，培養(yǎng)皿上生長著很多白色菌落＆藍(lán)色菌落，白色菌落為DNA重組子。白色菌落為重組子藍(lán)色菌落為不含外源DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌的菌落1022022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作102【實驗結(jié)果2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作103【思考題】1.什么是DNA重組？它包括哪些因素？2.如何提高DNA的重組效率？

3.大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化中的影響因素有哪些？4.為什么轉(zhuǎn)化后的瓊脂板上有的沒有白色菌落？5.藍(lán)白斑篩選的原理是什么？【實驗安排】本實驗約需2天1032022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作103【思考題】2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作104實驗六植物基因組DNA的提取及瓊脂糖凝膠電泳檢測【實驗?zāi)康摹客ㄟ^本實驗學(xué)習(xí)從植物組織中提取DNA的方法【實驗原理】細(xì)胞提取液中含有的SDS可溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。EDTA抑制DNA酶的活性。再用氯仿－異戊醇抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作104實驗六植2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作105【儀器、材料與試劑】

(一)儀器1.低溫離心機(jī)2.恒溫水裕器3.臺式離心機(jī)4.瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)（二）材料1.水稻幼葉2.三羥甲基氨基甲烷（Tris）3.乙二胺四乙酸（EDTA）4.氯化鈉5.無水乙醇6.氯仿7.異戊醇8.瓊脂糖9.十二烷基硫酸鈉（SDS）2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作105【儀器、材2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作106【儀器、材料與試劑】10.1.5ml、2ml離心管11.陶瓷研缽12.吸管、移液管13.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物（三）試劑1.DNA抽提液

200mMTris-HCl,PH7.5250mMNaCl2.5mMEDTA0.5%SDS2.氯仿/異戊醇24:13.TE溶液10mMTris-HClpH=8.01mMEDTApH=8.02022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作106【儀器、材2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作107【實驗步驟】⒈取幼葉5cm(約3-5g)左右放于研缽中，加入少許石英砂，再加入400μl的SDS抽提液，磨成綠色漿狀。應(yīng)盡快研磨，以免抽提液揮發(fā)。⒉將研磨液倒入2ml的離心管，用約400μl的SDS抽提液洗滌研缽，將之也倒入離心管中。將兩次抽提液混勻。⒊將離心管置于56℃的水浴鍋中放置5min。⒋加入等體積（或稍多一點）的氯仿/異戊醇（24:1），充分混勻。⒌在振蕩器上搖動約45min，以充分混勻，顏色變?yōu)樯罹G色。⒍在離心機(jī)中以14000rpm離心5min。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作107【實驗步驟2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作108【實驗步驟】⒎取上清液于另一1.5ml的離心管中。小心吸取，不能弄混濁上清液，不能吸取到上清液下面的部分。若上清液混濁，則重復(fù)第4至第7步。⒏加入等體積的預(yù)冷的無水乙醇，輕輕混勻，靜置直到DNA析出（室溫下30min或4℃冰箱中過夜）。⒐在離心機(jī)中以12000rpm離心2-3min；去上清液(小心別弄丟DNA)。10.加入70%乙醇5ml漂洗一至兩次。2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作108【實驗步驟2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作109【實驗步驟】11.在離心機(jī)中以12000rpm離心1min，去上清液。12.倒置在干凈的吸水紙上或風(fēng)干（約30min）13.加入100-200μl的TE溶液，溶解后置于4℃冰箱中保存待用。14.取4μlDNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度與質(zhì)量2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作109【實驗步驟2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作110DNAisolationprotocol1.PlanttissuesatdifferentgrowthstagesfromyoungseedlingtomaturitycanbeusedforDNAisolation.Ahealthyleafblade(about2cmlong)iscollectedin1.5mltube.Thetubeiscappedandplacedonice.

2022/12/19三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作110DNAi2022/12/23三峽大學(xué)李曉玲編寫與制作1112.Cuttheleafinto0.5cmsegmentsinasmallmortarandadd400μlofDNAextractionbuffer.DNAextractionbuffer:Tris-HCl50mM,pH8.0,EDTA25mM,pH8.0,NaCl300mM,SDS1%2022/