重組蛋白包涵體表達(dá)的復(fù)性和純化課件

重組蛋白包涵體表達(dá)的復(fù)性和純化重組蛋白包涵體表達(dá)的復(fù)性和純化12發(fā)酵液細(xì)胞分離胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物細(xì)胞破碎固液分離包涵體細(xì)胞碎片分離變性復(fù)性濃縮初步分離高度純化制劑

產(chǎn)品

基因工程制品分離純化的一般流程2發(fā)酵液細(xì)胞分離胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物細(xì)胞破碎固液分離包涵體細(xì)胞碎2

包含體的形成和性質(zhì)在大腸桿菌中表達(dá)的基因工程蛋白常常以包涵體的形式沉積于細(xì)胞內(nèi)，表現(xiàn)為無活性的不溶性聚集物包涵體：外源目的基因在宿主系統(tǒng)中高水平表達(dá)時(shí)，因各種原因?qū)е禄虮磉_(dá)產(chǎn)物的一級(jí)結(jié)構(gòu)（即氨基酸序列）雖然正確，而其高級(jí)結(jié)構(gòu)是錯(cuò)誤的，即：沒有生物活性的包涵體。包涵體直徑約0.5-1μm，具有很高的密度（約1.3mg/ml），相差顯微鏡下有折光性，呈非水溶性，只溶于高濃度變性劑如尿素、鹽酸胍等。包含體的形成和性質(zhì)在大3包涵體形成的幾種可能性研究發(fā)現(xiàn)：低表達(dá)時(shí)很少形成包涵體，表達(dá)量越高越易形成包涵體。1）少量蛋白產(chǎn)生時(shí)是可溶的，表達(dá)量過高，積聚量超過其在細(xì)胞內(nèi)溶解度時(shí)沉淀；2）合成速度太快，以至于沒有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確配對(duì)；3）重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。4）重組蛋白的氨基酸組成，一般說來含硫氨基酸越多、Pro含量越高越容易形成包涵體。5）重組蛋白所處的環(huán)境：發(fā)酵溫度高時(shí)容易形成包涵體。包涵體形成的幾種可能性研究發(fā)現(xiàn)：低表達(dá)時(shí)很少形成包涵體，表達(dá)4包涵體形成：Advantages1、細(xì)菌的生長快速利于大規(guī)模生產(chǎn)。包涵體形式表達(dá)的蛋白質(zhì)濃度比較高，有時(shí)甚至可以達(dá)到細(xì)胞總蛋白含量的40%2、重組蛋白質(zhì)以包涵體形式存在→包埋了酶攻擊的位點(diǎn)，可以最大限度地抵抗蛋白質(zhì)酶的攻擊3、分離比可溶蛋白質(zhì)的分離方法簡便，造價(jià)低，使用簡單的離心或者過濾的手段就能使包涵體與宿主細(xì)胞的其他蛋白質(zhì)成分進(jìn)行有效的分離4、有些表達(dá)的外源蛋白質(zhì)對(duì)細(xì)胞有毒性或者致死，大量表達(dá)時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，最終的細(xì)胞數(shù)量和產(chǎn)物相當(dāng)?shù)?；而包涵體形式的蛋白質(zhì)因喪失了生物活性→高效地表達(dá)包涵體形成：Advantages1、細(xì)菌的生長快速利于大規(guī)模5包涵體加工流程離心去除細(xì)胞碎片（膜蛋白和脂類等）機(jī)械破碎法包涵體提取如何對(duì)包涵體蛋白進(jìn)行高效體外復(fù)性以獲得活性產(chǎn)品是生物工程產(chǎn)業(yè)化的一個(gè)難題包涵體加工流程離心去除細(xì)胞碎片機(jī)械破碎法包涵體提取6細(xì)胞破碎就是采用物理、化學(xué)、酶或機(jī)械的方法，在一定程度上破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，設(shè)法使胞內(nèi)產(chǎn)物最大程度地釋放到液相中。細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎就是采用物理、化學(xué)、酶或機(jī)械的方法，在一定程度上破壞7分類作用機(jī)理適應(yīng)性物理破碎高壓勻漿法液體剪切作用可達(dá)較高破碎率，可大規(guī)模操作，不適合絲狀菌和革蘭氏陽性菌珠磨法固體剪切作用可達(dá)較高破碎率，可較大規(guī)模操作，大分子目的產(chǎn)物易失活，漿液分離困難超聲破碎法液體剪切作用對(duì)酵母菌效果較差，破碎過程升溫劇烈，不適合大規(guī)模操作滲透壓法滲透壓劇烈改變破碎率較低，常與其他方法結(jié)合使用反復(fù)凍融法反復(fù)凍結(jié)-融化破碎率較低，不適合對(duì)冷凍敏感目的產(chǎn)物干燥法改變細(xì)胞膜的滲透性條件變化劇烈，易引起大分子物質(zhì)失活X-press法固體剪切作用破碎率高，活性保留率高，對(duì)冷凍敏感目的產(chǎn)物不適合化學(xué)破碎酶溶法酶分解作用具有高度專一性，條件溫和，漿液易分離，溶酶價(jià)格高，通用性差化學(xué)滲透法改變細(xì)胞膜滲透性具一定選擇性，漿液易分離，但釋放率較低，通用性差常用破碎方法（按細(xì)胞所受作用）分類作用機(jī)理適應(yīng)性高壓勻漿法液體剪切作用可達(dá)較8包涵體的洗滌細(xì)胞破碎后，包含體呈顆粒狀，致密。洗滌的重要性：收集的沉淀中，除包涵體外，還包括許多雜質(zhì)，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，復(fù)性時(shí)會(huì)與目標(biāo)蛋白一起復(fù)性形成雜交分子而聚集，給后步純化帶來困難。洗滌劑：溫和的表面活性劑（TritonX-100）、低濃度的弱變性劑（如尿素）或脫氧膽酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂質(zhì)類雜質(zhì)。洗滌劑濃度以溶解雜質(zhì)，不溶解包涵體中表達(dá)產(chǎn)物為原則。包涵體的洗滌9包涵體的溶解二硫鍵目的次級(jí)鍵變性劑去污劑還原劑鹽酸胍、尿素SDS、Triton100巰基乙醇、DTT包涵體的溶解二硫鍵目次級(jí)鍵變性劑去污劑還原劑鹽酸胍、尿素SD10蛋白質(zhì)的復(fù)性：包含體蛋白質(zhì)溶解于變性劑溶液中，呈變性狀態(tài)，所有的氫鍵、疏水鍵全部被破壞，疏水側(cè)鏈完全暴露，但一級(jí)結(jié)構(gòu)和共價(jià)鍵不被破壞，當(dāng)除去變性劑后，一部分蛋白質(zhì)可以自動(dòng)折疊成具有活性的正確構(gòu)型，這一折疊過程稱為蛋白質(zhì)復(fù)性。如何使包涵體的構(gòu)型復(fù)原成正確狀態(tài)？蛋白質(zhì)的復(fù)性：包含體蛋白質(zhì)溶解于變性劑溶液中，呈變性狀態(tài)，所11復(fù)性常用方法稀釋\透析\超濾復(fù)性法折疊促進(jìn)劑協(xié)助復(fù)性法：表面活性劑、PEG、分子伴侶等反相膠團(tuán)復(fù)性法、雙水相體系復(fù)性法層析折疊復(fù)性（固相復(fù)性）：凝膠過濾層析（GF）、親和層析（AFC）、離子交換層析（IEC）、疏水層析（HIC）等復(fù)性常用方法稀釋\透析\超濾復(fù)性法12復(fù)性復(fù)性的成功秘訣在于促進(jìn)主要途徑抑制導(dǎo)致聚集體形成的競(jìng)爭(zhēng)性途徑，通常需要仔細(xì)優(yōu)化大量參數(shù)：蛋白濃度、溫度、時(shí)間、pH、緩沖添加劑等等復(fù)性13色譜過程及其分類色譜法是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過固定相，稱為流動(dòng)相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動(dòng)而達(dá)到分離的目的。色譜過程及其分類色譜法是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異14層析填料的選擇層析填料的選擇15凝膠過濾色譜凝膠過濾色譜(GelFiltrationChromatographyGFC)又稱為分子排阻色譜(SizeExclusionChromatographySEC），凝膠色譜主要用于脫鹽、分級(jí)分離及分子量的測(cè)定。凝膠過濾色譜凝膠過濾色譜(GelFiltrationCh16

生物體內(nèi)許多大分子化合物具有與其結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)的專一分子可逆結(jié)合的特性(親和力)。把與目的產(chǎn)物具有特異親和力的生物分子固定化后作為固定相，則當(dāng)含有目的產(chǎn)物的混合物(流動(dòng)相)流經(jīng)此固定相時(shí)，即可把目的產(chǎn)物從混合物中分離出來。

親和色譜(AffinityChromatography，AFC)

生物體內(nèi)許多大分子化合物具有與其結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)的專一17

親和色譜(AffinityChromatography，AFC)

親和色譜(AffinityChromatography，18離子交換色譜是基于離子交換樹脂上可電離的離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交換，由于混合物中不同溶質(zhì)對(duì)交換劑具有不同的結(jié)合力而將其分離。該法適合于離子和在溶劑中發(fā)生電離物質(zhì)的分離。離子交換色譜廣泛用于生物大分子分離純化，特別是在蛋白質(zhì)、多肽、核酸等生物物質(zhì)的分離純化。

離子交換色譜(IonExchangeChromatography，IEC)

離子交換色譜是基于離子交換樹脂上可電離的離19

離子交換色譜(IonExchangeChromatography，IEC)

離子交換色譜(IonExchangeChromatog20疏水色譜（HIC）疏水相互作用色譜（HydrophobicInteractionChromatographyHIC）原理是在高濃度的鹽溶液中，蛋白質(zhì)會(huì)被吸附到疏水色譜填料的疏水基團(tuán)上，當(dāng)逐漸降低鹽濃度時(shí)，它們會(huì)按疏水性的強(qiáng)弱先后被洗脫。疏水色譜（HIC）疏水相互作用色譜（Hydrophobic21疏水色譜（HIC）疏水色譜（HIC）22推薦書籍、資料1.InsolubleProteinsMethodsandProtocols2.GE重組蛋白純化手冊(cè)推薦書籍、資料1.InsolubleProteinsMe23ThankYou!ThankYou!24重組蛋白包涵體表達(dá)的復(fù)性和純化重組蛋白包涵體表達(dá)的復(fù)性和純化252發(fā)酵液細(xì)胞分離胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物細(xì)胞破碎固液分離包涵體細(xì)胞碎片分離變性復(fù)性濃縮初步分離高度純化制劑

產(chǎn)品

基因工程制品分離純化的一般流程2發(fā)酵液細(xì)胞分離胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物細(xì)胞破碎固液分離包涵體細(xì)胞碎26

包含體的形成和性質(zhì)在大腸桿菌中表達(dá)的基因工程蛋白常常以包涵體的形式沉積于細(xì)胞內(nèi)，表現(xiàn)為無活性的不溶性聚集物包涵體：外源目的基因在宿主系統(tǒng)中高水平表達(dá)時(shí)，因各種原因?qū)е禄虮磉_(dá)產(chǎn)物的一級(jí)結(jié)構(gòu)（即氨基酸序列）雖然正確，而其高級(jí)結(jié)構(gòu)是錯(cuò)誤的，即：沒有生物活性的包涵體。包涵體直徑約0.5-1μm，具有很高的密度（約1.3mg/ml），相差顯微鏡下有折光性，呈非水溶性，只溶于高濃度變性劑如尿素、鹽酸胍等。包含體的形成和性質(zhì)在大27包涵體形成的幾種可能性研究發(fā)現(xiàn)：低表達(dá)時(shí)很少形成包涵體，表達(dá)量越高越易形成包涵體。1）少量蛋白產(chǎn)生時(shí)是可溶的，表達(dá)量過高，積聚量超過其在細(xì)胞內(nèi)溶解度時(shí)沉淀；2）合成速度太快，以至于沒有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確配對(duì)；3）重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。4）重組蛋白的氨基酸組成，一般說來含硫氨基酸越多、Pro含量越高越容易形成包涵體。5）重組蛋白所處的環(huán)境：發(fā)酵溫度高時(shí)容易形成包涵體。包涵體形成的幾種可能性研究發(fā)現(xiàn)：低表達(dá)時(shí)很少形成包涵體，表達(dá)28包涵體形成：Advantages1、細(xì)菌的生長快速利于大規(guī)模生產(chǎn)。包涵體形式表達(dá)的蛋白質(zhì)濃度比較高，有時(shí)甚至可以達(dá)到細(xì)胞總蛋白含量的40%2、重組蛋白質(zhì)以包涵體形式存在→包埋了酶攻擊的位點(diǎn)，可以最大限度地抵抗蛋白質(zhì)酶的攻擊3、分離比可溶蛋白質(zhì)的分離方法簡便，造價(jià)低，使用簡單的離心或者過濾的手段就能使包涵體與宿主細(xì)胞的其他蛋白質(zhì)成分進(jìn)行有效的分離4、有些表達(dá)的外源蛋白質(zhì)對(duì)細(xì)胞有毒性或者致死，大量表達(dá)時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，最終的細(xì)胞數(shù)量和產(chǎn)物相當(dāng)?shù)?；而包涵體形式的蛋白質(zhì)因喪失了生物活性→高效地表達(dá)包涵體形成：Advantages1、細(xì)菌的生長快速利于大規(guī)模29包涵體加工流程離心去除細(xì)胞碎片（膜蛋白和脂類等）機(jī)械破碎法包涵體提取如何對(duì)包涵體蛋白進(jìn)行高效體外復(fù)性以獲得活性產(chǎn)品是生物工程產(chǎn)業(yè)化的一個(gè)難題包涵體加工流程離心去除細(xì)胞碎片機(jī)械破碎法包涵體提取30細(xì)胞破碎就是采用物理、化學(xué)、酶或機(jī)械的方法，在一定程度上破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，設(shè)法使胞內(nèi)產(chǎn)物最大程度地釋放到液相中。細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎就是采用物理、化學(xué)、酶或機(jī)械的方法，在一定程度上破壞31分類作用機(jī)理適應(yīng)性物理破碎高壓勻漿法液體剪切作用可達(dá)較高破碎率，可大規(guī)模操作，不適合絲狀菌和革蘭氏陽性菌珠磨法固體剪切作用可達(dá)較高破碎率，可較大規(guī)模操作，大分子目的產(chǎn)物易失活，漿液分離困難超聲破碎法液體剪切作用對(duì)酵母菌效果較差，破碎過程升溫劇烈，不適合大規(guī)模操作滲透壓法滲透壓劇烈改變破碎率較低，常與其他方法結(jié)合使用反復(fù)凍融法反復(fù)凍結(jié)-融化破碎率較低，不適合對(duì)冷凍敏感目的產(chǎn)物干燥法改變細(xì)胞膜的滲透性條件變化劇烈，易引起大分子物質(zhì)失活X-press法固體剪切作用破碎率高，活性保留率高，對(duì)冷凍敏感目的產(chǎn)物不適合化學(xué)破碎酶溶法酶分解作用具有高度專一性，條件溫和，漿液易分離，溶酶價(jià)格高，通用性差化學(xué)滲透法改變細(xì)胞膜滲透性具一定選擇性，漿液易分離，但釋放率較低，通用性差常用破碎方法（按細(xì)胞所受作用）分類作用機(jī)理適應(yīng)性高壓勻漿法液體剪切作用可達(dá)較32包涵體的洗滌細(xì)胞破碎后，包含體呈顆粒狀，致密。洗滌的重要性：收集的沉淀中，除包涵體外，還包括許多雜質(zhì)，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，復(fù)性時(shí)會(huì)與目標(biāo)蛋白一起復(fù)性形成雜交分子而聚集，給后步純化帶來困難。洗滌劑：溫和的表面活性劑（TritonX-100）、低濃度的弱變性劑（如尿素）或脫氧膽酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂質(zhì)類雜質(zhì)。洗滌劑濃度以溶解雜質(zhì)，不溶解包涵體中表達(dá)產(chǎn)物為原則。包涵體的洗滌33包涵體的溶解二硫鍵目的次級(jí)鍵變性劑去污劑還原劑鹽酸胍、尿素SDS、Triton100巰基乙醇、DTT包涵體的溶解二硫鍵目次級(jí)鍵變性劑去污劑還原劑鹽酸胍、尿素SD34蛋白質(zhì)的復(fù)性：包含體蛋白質(zhì)溶解于變性劑溶液中，呈變性狀態(tài)，所有的氫鍵、疏水鍵全部被破壞，疏水側(cè)鏈完全暴露，但一級(jí)結(jié)構(gòu)和共價(jià)鍵不被破壞，當(dāng)除去變性劑后，一部分蛋白質(zhì)可以自動(dòng)折疊成具有活性的正確構(gòu)型，這一折疊過程稱為蛋白質(zhì)復(fù)性。如何使包涵體的構(gòu)型復(fù)原成正確狀態(tài)？蛋白質(zhì)的復(fù)性：包含體蛋白質(zhì)溶解于變性劑溶液中，呈變性狀態(tài)，所35復(fù)性常用方法稀釋\透析\超濾復(fù)性法折疊促進(jìn)劑協(xié)助復(fù)性法：表面活性劑、PEG、分子伴侶等反相膠團(tuán)復(fù)性法、雙水相體系復(fù)性法層析折疊復(fù)性（固相復(fù)性）：凝膠過濾層析（GF）、親和層析（AFC）、離子交換層析（IEC）、疏水層析（HIC）等復(fù)性常用方法稀釋\透析\超濾復(fù)性法36復(fù)性復(fù)性的成功秘訣在于促進(jìn)主要途徑抑制導(dǎo)致聚集體形成的競(jìng)爭(zhēng)性途徑，通常需要仔細(xì)優(yōu)化大量參數(shù)：蛋白濃度、溫度、時(shí)間、pH、緩沖添加劑等等復(fù)性37色譜過程及其分類色譜法是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過固定相，稱為流動(dòng)相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動(dòng)而達(dá)到分離的目的。色譜過程及其分類色譜法是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異38層析填料的選擇層析填料的選擇39凝膠過濾色譜凝膠過濾色譜(GelFiltrationChromatographyGFC)又稱為分子排阻色譜(SizeExclusionChromatographySEC），凝膠色譜主要用于脫鹽、分級(jí)分離及分子量的測(cè)定。凝膠過濾色譜凝膠過濾色譜(GelFiltrationCh40

生物體內(nèi)許多大分子化合物具有與其結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)的專一分子可逆結(jié)合的特性(親和力)。把與目的產(chǎn)物具有特異親和力的生物分子固定化后作為固定相，則當(dāng)含有目的產(chǎn)物的混合物(流動(dòng)相)流經(jīng)此固定相時(shí)，即可把目的產(chǎn)物從混合物中分離出來。

親和色譜(AffinityChr