高效液相色譜分析(同名72)課件

高效液相色譜分析LOGO高效液相色譜分析LOGO基本概念與特點

概念：高效液相色譜法(HPLC)是在20世紀60年代末，以經(jīng)典液相色譜為基礎，引入了氣相色譜的理論，在技術上采用了高效固定相、高壓輸液系統(tǒng)和高靈敏度的在線檢測器，從而發(fā)展起來的一種新型分離分析技術。隨著科學和技術的不斷改進與發(fā)展，目前已成為應用極為重要、廣泛的分離分析手段.特點：分離效率高、分析速度快、應用范圍廣、操作自動化。2基本概念與特點

概念：高效液相色譜法(HPLC)是在20世紀液相色譜流程與原理基本原理：混合組分的樣品在色譜柱中，各組分由于在流動相和固定相之間溶解、吸附、滲透或離子交換等作用力的不同，隨流動相在色譜柱中運行時，在兩相間進行反復多次分配過程，使得原來分配系數(shù)具有微小區(qū)別的各組分，產(chǎn)生了保留能力明顯差異的效果，進而各組分在柱中的移動速度不同，經(jīng)過一定長度的色譜柱，彼此分離開來，最后按一定順序流出。3液相色譜流程與原理基本原理：混合組分的樣品在色譜柱中，各組分色譜圖及相關名詞（一）色譜流出曲線—色譜圖

色譜圖是色譜柱流出物通過檢測器所產(chǎn)生的響應信號對時間或液體流出體積的曲線。

色譜流出曲線是色譜基本參數(shù)的源流，而色譜基本參數(shù)又是用來觀察色譜行為和研究色譜理論的重要指標。另外，還可以直接利用色譜圖峰位置點（特征保留值）進行定性，根據(jù)曲線上測得的峰高或峰面積進行定量。4色譜圖及相關名詞（一）色譜流出曲線—色譜圖4（二）柱效能

色譜柱在色譜分離中由動力學因素所決定的柱效能，通常用塔板高度或塔板數(shù)表示。塔板數(shù)：

塔板高度：5渦流擴散相分子擴散相流動相線速度傳質阻力相（二）柱效能5渦流擴散相分子擴散相流動相線速度傳質阻力相（三）分離度R6分離度的表達式：tR(2),tR(1):組分2和組分1的保留時間Wb(2),Wb(1):組分2和組分1的峰底寬度（三）分離度R6分離度的表達式：tR(2),tR(7R=1.5完全分離7R=1.5

高效液相色譜系統(tǒng)（一）高效液相色譜儀結構流程8高壓泵色譜柱廢液檢測器進樣器儲液瓶高壓輸液泵、高效分離柱、高靈敏度檢測器

高效液相色譜系統(tǒng)（一）高效液相色譜儀結構流程8高壓泵色譜（二）高壓輸液系統(tǒng)（高壓泵）

高壓輸液泵是核心部件，要求：密封性好，輸出流量恒定，壓力平穩(wěn)，可調范圍寬，便于迅速更換溶劑及耐腐蝕等。

高壓泵主要有恒流泵（往復泵）和恒壓泵（氣動泵）兩種。恒流泵特點輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無關。分為機械注射泵和機械往復泵(常用)兩種。恒壓泵特點能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時間的重視性差。

9（二）高壓輸液系統(tǒng)（高壓泵）

高壓輸液泵是核心部件，要10電動機偏心輪柱塞柱球形單向閥溶劑圖10-7柱塞往復泵示意圖10電動機偏心輪柱塞柱（三）色譜柱

色譜柱是高效液相色譜分離過程的核心。一支穩(wěn)定、高效的色譜柱對建立適用性強、重現(xiàn)性好的分析方法是必不可少的。

1.擔體

高效液相色譜的柱填料有離子交換樹脂、凝膠，較多的使用硅膠微粒作為擔體。以下為幾種常用的微粒類型：

(1)全多孔型擔體：屬于顆粒均勻的多孔球體，很好的兼顧了效能、樣品荷載量、耐久性等理想的性質，所以最為常用。

(2)表層多孔型擔體（薄殼型微珠擔體）：

它是直徑為

30～

40μm的實心核

(玻璃微珠

)，優(yōu)點是：孔穴淺（固定相僅為表面的一薄層），傳質速度快，易于填充均勻，柱效高。這種擔體目前應用較為普遍。11（三）色譜柱色譜柱是高效液相色譜分離過程的核心。一支穩(wěn)定2.色譜柱

柱體為直型不銹鋼管，標準內經(jīng)為4.6或3.9mm，柱長15～30cm，填料顆粒粒度5－10μm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度(3－5μm)和柱經(jīng)以提高柱效。12

為保護色譜柱，通常在柱前加一支填料與色譜柱相同的保護柱。

2.色譜柱123.固定相選擇固定相的一般標準還是以“相似相容”原理為基礎。如果溶質溶于烴類溶劑，表明是低極性化合物，這樣就可以選擇非極性或亞極性固定相。若樣品溶于極性溫和溶劑中，如醇類，則可選擇極性固定相，也可以選擇非極性固定相。133.固定相選擇固定相的一般標準還是以“相似相容”原理為基礎。4.流動相14

液相色譜的流動相又稱為淋洗液，洗脫劑。流動相組成、極性改變，可顯著改變組分分離狀況，改變流動相的組成和極性（組成比例）是提高分離度的有效手段。常用溶劑：環(huán)己烷、己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、甲醇、乙腈、水等。4.流動相14液相色譜的流動相又稱為淋洗液，洗脫15正相液相色譜（正相柱）固定相極性>流動相極性反相液相色譜（反相柱）固定相極性<流動相極性組分極性越大，保留時間越長；使用極性化合物的分離。組分極性越小，保留時間越長；適用非極性化合物的分離。15正相液相色譜固定相極性>流動相極性反相液相色譜固定相極性16

選擇流動相時應注意的問題1、盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。2、避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。16選擇流動相時應注意的問題1、盡量使用高純度173、試樣在流動相中應有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。4、流動相同時還應滿足檢測器的要求。當使用紫外檢測器時，流動相不應有紫外吸收。173、試樣在流動相中應有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中（四）檢測器（一）、紫外檢測器—應用最廣泛的檢測器18基本原理：試樣組分對特定波長的紫外光具有選擇性的吸收，吸光度與試樣組分濃度之間的定量關系符合郎伯-比耳定律。優(yōu)點：靈敏度高，線形范圍寬；死體積??；波長可選；對流速和溫度變化不敏感；可用于梯度洗脫。缺點：無紫外-可見吸收組分不響應；流動相選擇受一定限制。（四）檢測器（一）、紫外檢測器—應用最廣泛的檢測器18基本原19(a)可變波長紫外檢測器(b)二極管陣列檢測器19(a)可變波長紫外檢測器(b)二極管陣列檢測器（二）、示差折光檢測器—通用型檢測器20每種物質具有不同的折光指數(shù)。基本原理：連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光系數(shù)差值，該值與試樣池流動相中的組分濃度成正比。

生命科學中各類糖類化合物，沒有紫外吸收，一般要用示差折光檢測器。

（二）、示差折光檢測器—通用型檢測器20每種物質具有不同的折21

缺點：靈敏度低；對溫度敏感；不能用于梯度洗脫。21缺點：（三）、熒光檢測器—專用型檢測器22基本原理：在一定的條件下，熒光強度與流動相中的組分的濃度成之比。

對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應。（三）、熒光檢測器—專用型檢測器22基本原理：在一定的條件下23

特點：

高靈敏度；高選擇性；可用于梯度洗脫。23特點：定性與定量（一）樣品預處理1.固體樣品

固體樣品首先要進行均質化，然后再采用如蒸餾、超臨界萃取或超聲波萃取等技術進行樣品制備。2.液體樣品

（二）定性與定量

參閱氣相色譜的定性與定量方法。24液-液萃取固相萃取凝膠過濾色譜定性與定量（一）樣品預處理24液-液萃取固相萃取凝膠過濾色譜氣相色譜與高效液相色譜的比較

25氣相色譜高效液相色譜1.只能分析揮發(fā)性物質，只能分析20%的化合物

2.不能用于熱不穩(wěn)定物質的分析

3.用毛細管色譜可得到很高的柱效

4.有很靈敏的檢測器如ECD和較靈敏的通用檢測器（FID和TCD）

5.流動相為氣體，無毒，易于處理

6.運行和操作容易

7.儀器制造難度較小1.幾乎可以分析各種物質

2.用于熱不穩(wěn)定物質的分析3.色譜柱較短，柱效較低4.沒有較高靈敏通用檢測器

5.流動相有毒，費用較高

6.運行和操作比GC難一些7.儀器制造難度大氣相色譜與高效液相色譜的比較

25氣相色譜高效液

謝謝作者：應姍姍

高效液相色譜分析LOGO高效液相色譜分析LOGO基本概念與特點

概念：高效液相色譜法(HPLC)是在20世紀60年代末，以經(jīng)典液相色譜為基礎，引入了氣相色譜的理論，在技術上采用了高效固定相、高壓輸液系統(tǒng)和高靈敏度的在線檢測器，從而發(fā)展起來的一種新型分離分析技術。隨著科學和技術的不斷改進與發(fā)展，目前已成為應用極為重要、廣泛的分離分析手段.特點：分離效率高、分析速度快、應用范圍廣、操作自動化。28基本概念與特點

概念：高效液相色譜法(HPLC)是在20世紀液相色譜流程與原理基本原理：混合組分的樣品在色譜柱中，各組分由于在流動相和固定相之間溶解、吸附、滲透或離子交換等作用力的不同，隨流動相在色譜柱中運行時，在兩相間進行反復多次分配過程，使得原來分配系數(shù)具有微小區(qū)別的各組分，產(chǎn)生了保留能力明顯差異的效果，進而各組分在柱中的移動速度不同，經(jīng)過一定長度的色譜柱，彼此分離開來，最后按一定順序流出。29液相色譜流程與原理基本原理：混合組分的樣品在色譜柱中，各組分色譜圖及相關名詞（一）色譜流出曲線—色譜圖

色譜圖是色譜柱流出物通過檢測器所產(chǎn)生的響應信號對時間或液體流出體積的曲線。

色譜流出曲線是色譜基本參數(shù)的源流，而色譜基本參數(shù)又是用來觀察色譜行為和研究色譜理論的重要指標。另外，還可以直接利用色譜圖峰位置點（特征保留值）進行定性，根據(jù)曲線上測得的峰高或峰面積進行定量。30色譜圖及相關名詞（一）色譜流出曲線—色譜圖4（二）柱效能

色譜柱在色譜分離中由動力學因素所決定的柱效能，通常用塔板高度或塔板數(shù)表示。塔板數(shù)：

塔板高度：31渦流擴散相分子擴散相流動相線速度傳質阻力相（二）柱效能5渦流擴散相分子擴散相流動相線速度傳質阻力相（三）分離度R32分離度的表達式：tR(2),tR(1):組分2和組分1的保留時間Wb(2),Wb(1):組分2和組分1的峰底寬度（三）分離度R6分離度的表達式：tR(2),tR(33R=1.5完全分離7R=1.5

高效液相色譜系統(tǒng)（一）高效液相色譜儀結構流程34高壓泵色譜柱廢液檢測器進樣器儲液瓶高壓輸液泵、高效分離柱、高靈敏度檢測器

高效液相色譜系統(tǒng)（一）高效液相色譜儀結構流程8高壓泵色譜（二）高壓輸液系統(tǒng)（高壓泵）

高壓輸液泵是核心部件，要求：密封性好，輸出流量恒定，壓力平穩(wěn)，可調范圍寬，便于迅速更換溶劑及耐腐蝕等。

高壓泵主要有恒流泵（往復泵）和恒壓泵（氣動泵）兩種。恒流泵特點輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無關。分為機械注射泵和機械往復泵(常用)兩種。恒壓泵特點能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時間的重視性差。

35（二）高壓輸液系統(tǒng)（高壓泵）

高壓輸液泵是核心部件，要36電動機偏心輪柱塞柱球形單向閥溶劑圖10-7柱塞往復泵示意圖10電動機偏心輪柱塞柱（三）色譜柱

色譜柱是高效液相色譜分離過程的核心。一支穩(wěn)定、高效的色譜柱對建立適用性強、重現(xiàn)性好的分析方法是必不可少的。

1.擔體

高效液相色譜的柱填料有離子交換樹脂、凝膠，較多的使用硅膠微粒作為擔體。以下為幾種常用的微粒類型：

(1)全多孔型擔體：屬于顆粒均勻的多孔球體，很好的兼顧了效能、樣品荷載量、耐久性等理想的性質，所以最為常用。

(2)表層多孔型擔體（薄殼型微珠擔體）：

它是直徑為

30～

40μm的實心核

(玻璃微珠

)，優(yōu)點是：孔穴淺（固定相僅為表面的一薄層），傳質速度快，易于填充均勻，柱效高。這種擔體目前應用較為普遍。37（三）色譜柱色譜柱是高效液相色譜分離過程的核心。一支穩(wěn)定2.色譜柱

柱體為直型不銹鋼管，標準內經(jīng)為4.6或3.9mm，柱長15～30cm，填料顆粒粒度5－10μm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度(3－5μm)和柱經(jīng)以提高柱效。38

為保護色譜柱，通常在柱前加一支填料與色譜柱相同的保護柱。

2.色譜柱123.固定相選擇固定相的一般標準還是以“相似相容”原理為基礎。如果溶質溶于烴類溶劑，表明是低極性化合物，這樣就可以選擇非極性或亞極性固定相。若樣品溶于極性溫和溶劑中，如醇類，則可選擇極性固定相，也可以選擇非極性固定相。393.固定相選擇固定相的一般標準還是以“相似相容”原理為基礎。4.流動相40

液相色譜的流動相又稱為淋洗液，洗脫劑。流動相組成、極性改變，可顯著改變組分分離狀況，改變流動相的組成和極性（組成比例）是提高分離度的有效手段。常用溶劑：環(huán)己烷、己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、甲醇、乙腈、水等。4.流動相14液相色譜的流動相又稱為淋洗液，洗脫41正相液相色譜（正相柱）固定相極性>流動相極性反相液相色譜（反相柱）固定相極性<流動相極性組分極性越大，保留時間越長；使用極性化合物的分離。組分極性越小，保留時間越長；適用非極性化合物的分離。15正相液相色譜固定相極性>流動相極性反相液相色譜固定相極性42

選擇流動相時應注意的問題1、盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。2、避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。16選擇流動相時應注意的問題1、盡量使用高純度433、試樣在流動相中應有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。4、流動相同時還應滿足檢測器的要求。當使用紫外檢測器時，流動相不應有紫外吸收。173、試樣在流動相中應有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中（四）檢測器（一）、紫外檢測器—應用最廣泛的檢測器44基本原理：試樣組分對特定波長的紫外光具有選擇性的吸收，吸光度與試樣組分濃度之間的定量關系符合郎伯-比耳定律。優(yōu)點：靈敏度高，線形范圍寬；死體積??；波長可選；對流速和溫度變化不敏感；可用于梯度洗脫。缺點：無紫外-可見吸收組分不響應；流動相選擇受一定限制。（四）檢測器（一）、紫外檢測器—應用最廣泛的檢測器18基本原45(a)可變波長紫外檢測器(b)二極管陣列檢測器19(a)可變波長紫外檢測器(b)二極管陣列檢測器（二）、示差折光檢測器—通用型檢測器46每種物質具有不同的折光指數(shù)?；驹恚哼B續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光系數(shù)差值，該值與試樣池流動相中的組分濃度成正比。

生命科學中各類糖類化合物，沒有紫外吸收，一般要用示差折光檢測器。

（二）、示差折光檢測器—通用型檢測器20每種物質具有不同的折47

缺點：靈敏度低；對溫度敏感；不能用于梯度洗脫。21