高效液相制備色譜的設(shè)備進(jìn)展及應(yīng)用課件

高效液相制備色譜的設(shè)備進(jìn)展及應(yīng)用2022/12/242022/12/24高效液相制備色譜的設(shè)備進(jìn)展及應(yīng)用2022/12/212022目錄1液體制備色譜4展望2高效液相制備色譜柱設(shè)備應(yīng)用32022/12/24目錄1液體制備色譜4展望2高效液相制備色譜柱設(shè)備應(yīng)用32021液相色譜是將分離填料填裝在色譜柱內(nèi)，以液體流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，利用藥物不同活性成分與填料相互作用力的差異進(jìn)行分離。輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)高壓輸液泵在線脫氣裝置概念基本裝置液體制備色譜2022/12/241液相色譜是將分離填料填裝在色譜柱高壓輸液泵在線脫氣裝置概念分類兩種模式，一種是在柱上方加壓，另一種是在柱下方減壓。在低壓制備色譜中使用的是顆粒較大的填料，因此其分辨率是有限的。利用恒流泵抽送流動(dòng)相，帶著樣品流經(jīng)色譜柱，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的分離。其色譜柱一般是由耐壓的強(qiáng)化玻璃制成，填料顆粒大小比低壓制備色譜所用填料小，分離效率更高。高壓液相色譜低壓制備色譜中壓制備色譜利用更細(xì)的高效填料進(jìn)行分離的，具有高柱效、高流速、分離時(shí)間短的特點(diǎn)。與經(jīng)典液相色譜相比高效液相色譜有很大不同。2022/12/24分類兩種模式，一種是在柱上方加壓，另一種是在柱HPLC與經(jīng)典液相色譜的不同2022/12/24HPLC與經(jīng)典液相色譜的不同2022/12/212制備型液相色譜制備型液相色譜1.制備型HPLC與分析型HPLC的區(qū)別2.PHPLC的裝置輸液泵進(jìn)樣系統(tǒng)色譜柱系統(tǒng)檢測(cè)器餾分收集器數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng)柱結(jié)構(gòu)柱尺寸柱型對(duì)填裝的要求2022/12/242制備型液相色譜制備型液相色譜1.制備型HPLC與分目的不同流速不同進(jìn)樣模式不同上樣量不同色譜柱不同理論基礎(chǔ)不同檢測(cè)池不同1.與分析型HPLC的區(qū)別2022/12/24目的不同1.與分析型HPLC的區(qū)別2022/12/212.PHPLC裝置輸液泵進(jìn)樣系統(tǒng)色譜柱系統(tǒng)檢測(cè)器餾分收集器數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng)色譜柱是核心部件，色譜填料的填裝是其操作的關(guān)鍵技術(shù)。制備型HPLC由于采用細(xì)的填料、高壓操作，所以色譜柱多用不銹鋼制作。2022/12/242.PHPLC裝置色譜柱是核心部件，色譜填料的填裝是其操作制備HPLC的色譜柱系統(tǒng)在此處主要提出色譜柱系統(tǒng)，因?yàn)橄鄬?duì)于分析型色譜,制備色譜的核心就是色譜柱。為提供既穩(wěn)定又高效的色譜柱,并用小尺寸顆粒進(jìn)行填充,最常用也是最易實(shí)現(xiàn)的效果較為理想的是動(dòng)態(tài)軸向壓縮柱(DACTM)技術(shù)。DAC技術(shù)為使用者提供了用任一種填料自己裝填色譜柱、方便快速地調(diào)整柱長(zhǎng)度的可能性。在制備型HPLC中,色譜柱的內(nèi)徑可在100～500mm之間。一般增大色譜柱的直徑意味著可以承載更多的樣品,從而增加產(chǎn)量。增加色譜柱的長(zhǎng)度則意味著可加入的樣品量和分辨率的增大,但同時(shí)也增加了柱壓。研究表明對(duì)于難分離物系,可以采用直徑較小的色譜填料,以提高分離效率,但在分離度可以滿足分離要求的前提下,使用較大直徑的色譜填料將更為有利。色譜填料的填裝是其操作的關(guān)鍵技術(shù)。制備型HPLC由于采用細(xì)的填料、高壓操作，所以色譜柱多用不銹鋼制作。2022/12/24制備HPLC的色譜柱系統(tǒng)在此處主要提出色譜柱系統(tǒng)，因制備HPLC的色譜柱系統(tǒng)柱尺寸：柱短、內(nèi)徑大、呈圓餅狀在制備型HPLC分離過(guò)程中,在滿足分離度要求的前提下,可以采用增加制備柱內(nèi)徑的方法提高制備量。柱型：錐型柱與圓柱型柱錐型柱優(yōu)于圓柱型柱,錐型柱的樣品容量約為圓柱型柱的2倍,柱效比圓柱型柱高36%,色譜流出曲線峰值高于圓柱型柱12%。柱結(jié)構(gòu)：空管柱、軸向壓縮柱和徑向壓縮柱對(duì)填裝的要求：填料的種類、裝填技術(shù)2022/12/24制備HPLC的色譜柱系統(tǒng)柱尺寸：柱短、內(nèi)徑大、呈圓餅狀在制備柱結(jié)構(gòu)1.空管柱與分析柱相同，常用柱內(nèi)徑為10～100mm，采用勻漿填充技術(shù)填裝色譜填料。2.軸向壓縮柱是采用活塞壓縮床層，以使色譜柱內(nèi)填料均勻、密實(shí)，得到更高的柱效。其原理是通過(guò)活塞的上下移動(dòng)來(lái)裝柱、維持柱壓和卸柱，活塞周邊配置了特殊設(shè)計(jì)的密封圈，能容許活塞上下自由移動(dòng)，同時(shí)又能保持高的密封性。在柱內(nèi)的兩端均配有多孔不銹鋼濾板和能使樣品及洗脫液在柱截面上均勻分布的分散器。液流分散器保證了大量樣品盡可能地瞬時(shí)分散在柱截面上，進(jìn)而快速均勻進(jìn)入柱床，克服了柱中心樣品局部過(guò)濃的現(xiàn)象，保證了色譜柱的高效。根據(jù)在分離制備過(guò)程中提供給活塞的壓力是否持續(xù)，可將軸向壓縮柱分為靜態(tài)和動(dòng)態(tài)兩種，靜態(tài)軸向壓縮柱的效果比動(dòng)態(tài)的差，但是設(shè)備比動(dòng)態(tài)便宜。采用動(dòng)態(tài)軸向壓縮柱工藝裝填的色譜柱現(xiàn)已基本上主宰了整個(gè)制備型色譜柱市場(chǎng)，國(guó)內(nèi)已有動(dòng)態(tài)軸向壓縮柱制備色譜系統(tǒng)產(chǎn)品。2022/12/24柱結(jié)構(gòu)1.空管柱與分析柱相同，常用柱內(nèi)徑為10～聊城萬(wàn)合工業(yè)制造有限公司自主研發(fā)了高效液相軸向加壓（自振）制備層析柱系統(tǒng)，配套高壓輸液泵和檢測(cè)器，通過(guò)計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制，成功開(kāi)發(fā)了高效液相層析中藥提取裝備。圖1為高效液相軸向加壓（自振）制備色譜柱（HPLC-C200型）系統(tǒng)的示意圖。2022/12/24聊城萬(wàn)合工業(yè)制造有限公司自主研發(fā)了高效液相軸向加壓（自振）制徑向壓縮柱使用雙管的色譜柱，填料裝在管壁可壓縮的高聚物柱管內(nèi)制成柱芯，再將裝有填料的柱芯放入不銹鋼外套中，利用氣體或液體施壓于柱芯外壁和不銹鋼外套之間，壓緊柱芯內(nèi)的填料，使色譜柱得到徑向壓縮。該技術(shù)目的是消除顆粒間及顆粒與管壁間的空隙。徑向色譜柱的結(jié)構(gòu)如圖4所示，圖中表明進(jìn)入到徑向色譜柱的樣品和流動(dòng)相并非如傳統(tǒng)的軸向色譜柱從柱的一端流向另一端，而是沿徑向流動(dòng)，即樣品和流動(dòng)相是從色譜柱的周圍流向柱圓心。2022/12/24徑向壓縮柱使用雙管的色譜柱，填料裝在管壁可壓縮的高聚物柱管內(nèi)徑向壓縮柱的主要缺點(diǎn)是柱芯長(zhǎng)度固定，不如軸向壓縮柱可以任意調(diào)節(jié)。此外直徑較大的色譜柱中徑向經(jīng)常出現(xiàn)粒度梯度，造成流動(dòng)相徑向流速分布不均勻。由于徑向擴(kuò)散太慢，不能抵消柱截面積流速差異所產(chǎn)生的濃度梯度，所以徑向流速是峰展寬的一個(gè)重要來(lái)源。徑向壓縮柱主要是由Waters公司生產(chǎn)，并已有預(yù)制柱出售。2022/12/24徑向壓縮柱的主要缺點(diǎn)是柱芯長(zhǎng)度固定，不如軸向壓縮柱可以任意調(diào)柱尺寸現(xiàn)代高效制備液相色譜柱具有柱短、內(nèi)徑大、呈圓餅狀(pancake)的特征。目前高效制備柱的柱長(zhǎng)與常規(guī)分析柱相仿，一般為20~50cm遠(yuǎn)短于傳統(tǒng)柱1m甚至1m以上的制備柱，在制備型HPLC分離過(guò)程中，在滿足分離度要求的前提下，可以采用增加制備柱內(nèi)徑的方注提高制備量。柱型制備高效色譜柱按柱型可分為錐型柱與圓柱型柱兩大類。錐型柱優(yōu)于圓柱型柱，錐型柱的樣品容量約為圓柱型柱的2倍，柱效比圓柱型柱高36%，色譜流出曲線峰值高于圓林型林12%。2022/12/24柱尺寸現(xiàn)代高效制備液相色譜柱具有柱短、內(nèi)徑大、呈圓餅狀(制備色譜中對(duì)填料的要求一般來(lái)說(shuō)，分析型色譜柱填料也可以用于制備型色譜柱中，但是制備色譜中使用的量大，而且需要反復(fù)裝柱，因此對(duì)于制備色譜填料有一些特殊的要求：（1）機(jī)械強(qiáng)度高；（2）負(fù)載量高，單位重量的填料負(fù)載量高可以處理更多的樣品；（3）可大量供應(yīng)，批間的重現(xiàn)性好；（4）粒徑大小合適，布范圍窄，在制備分離過(guò)程中，對(duì)于難分離物系，可以采用較小粒徑的色譜填料，以提高分離效率。但在滿足分離要求的前提下，使用較大粒徑的色譜填料，可以獲得較大的生產(chǎn)能力；（5）化學(xué)穩(wěn)定性好，選擇性好，無(wú)毒，易于填充，價(jià)格合理等；（6）通常制備型HPLC每米的塔板數(shù)在20000以上，所用填料粒徑一般為5、7、10μm。2022/12/24制備色譜中對(duì)填料的要求一般來(lái)說(shuō)，分析型色譜柱填料也可以用于制對(duì)填料的要求

填料的種類

制備柱的裝填技術(shù)干裝法勻漿法壓縮法使用最多的就是硅膠及其衍生物的鍵合固定相填料近年來(lái)又發(fā)展了整體柱色譜。動(dòng)態(tài)軸向壓縮法(DAC)填裝的色譜柱柱床均勻、性能穩(wěn)定、柱效高。目前，DAC柱己基本上主宰了整個(gè)制備型色譜柱市場(chǎng)，柱徑己從25mm發(fā)展到1.6m。2022/12/24對(duì)填料的要求填料的種類制備柱的裝填技術(shù)干裝法使用最多的1.制備型HPLC的樣品預(yù)處理在高壓液相色譜進(jìn)樣之前,需對(duì)樣品進(jìn)行過(guò)濾。使用能套在注射器上的濾片可以除去樣品中混有的顆粒狀雜質(zhì),既方便又廉價(jià)。在選用過(guò)濾膜時(shí)應(yīng)注意使其適合于所用的溶劑,這一點(diǎn)在使用含四氫呋喃的溶劑時(shí)尤其重要。在色譜柱與進(jìn)樣器之間安裝前置柱可除去顆粒狀雜質(zhì)和吸附性強(qiáng)的樣品組分。前置柱通常裝有少量與色譜柱相同的填料,如填充得當(dāng),對(duì)系統(tǒng)分離效果不會(huì)造成很大影響。硅膠預(yù)處理柱可防止含有緩沖鹽或堿的流動(dòng)相所引起的麻煩,上訴物質(zhì)可破壞鍵合相填充料的硅膠骨架,常會(huì)在柱的上部形成空隙。預(yù)處理柱安裝在泵與進(jìn)樣器之間,這樣盡管流動(dòng)相被硅膠所飽和,但在進(jìn)樣途中不會(huì)有空隙或氣泡。3應(yīng)用與實(shí)例應(yīng)用與實(shí)例2022/12/241.制備型HPLC的樣品預(yù)處理3應(yīng)用與實(shí)例應(yīng)用與實(shí)例20222制備規(guī)模按照分離一次進(jìn)樣量的多少,制備型HPLC有3種規(guī)模,即半制備級(jí)HPLC、克級(jí)HPLC和工業(yè)級(jí)HPLC,如下表所示制備型HPLC以生產(chǎn)純物質(zhì)為目的,在經(jīng)濟(jì)合理的前提下,規(guī)模越大越好2022/12/242制備規(guī)模2022/12/213柱超載方式分析型HPLC與制備型HPLC的根本區(qū)別在于分離目的不同。在制備型HPLC中,為了節(jié)省投資和操作費(fèi)用,必須以最少的時(shí)間生產(chǎn)最大量的產(chǎn)品。為了提高制備量,柱必須超載。柱的超載方式有兩種,一種是所謂的“質(zhì)量超載”,即維持較小的進(jìn)樣體積,但提高進(jìn)樣濃度;另一種是所謂的“體積超載”,即保持較小的進(jìn)樣濃度,但增加進(jìn)樣體積。在制備型HPLC中,一般認(rèn)為采用質(zhì)量超載的方式較好。王志祥等人建立的混合池模型可以較好的描述制備型HPLC分離過(guò)程,發(fā)現(xiàn)在制備型HPLC分離過(guò)程中,分離度和柱效均隨質(zhì)量超載程度的增加而下降。但是,在分離度可以滿足分離要求的前提下,采用質(zhì)量超載的方式操作,可以提高制備量。2022/12/243柱超載方式2022/12/214流動(dòng)相進(jìn)行制備型液相色譜分離時(shí),所用溶劑的純度很重要。即使含純化合物的流動(dòng)相溶劑中含有微量的不揮發(fā)性雜質(zhì)當(dāng)大量溶劑經(jīng)蒸發(fā)后,其雜質(zhì)濃度就會(huì)增高。制備型液相色譜往往需消耗大量溶劑,因此應(yīng)在溶劑純度與所用數(shù)量之間進(jìn)行權(quán)衡。流動(dòng)相中的非揮發(fā)性添加劑會(huì)在產(chǎn)物回收時(shí)引起麻煩,這是可采用揮發(fā)性緩沖物來(lái)改進(jìn)分離效果,又易于將其除去。5洗脫制備型HPLC所采用的洗脫方式主要有兩種。一種是維持流動(dòng)相的熱力學(xué)參數(shù)不變的等度洗脫法;一種是改變流動(dòng)相的一種或幾種熱力學(xué)參數(shù)的梯度洗脫法。2022/12/244流動(dòng)相2022/12/216被分離物質(zhì)的收集在制備型分離工作中,需使用大量的洗脫溶劑,因此要采用適當(dāng)?shù)氖占?。如有可?應(yīng)對(duì)溶劑回收再用,因而也應(yīng)盡量不使用混合溶劑。在使用反相或聚合物吸附劑進(jìn)行分離時(shí),有時(shí)從水液中回收樣品較困難。一種解決辦法是蒸除其中的有機(jī)溶劑,然后用甲苯或氯仿提取殘留水液。如以甲醇-水為洗脫液,可將收集的流分用水稀釋5倍,用泵加回到色譜柱上,然后用甲醇將化合物洗脫下來(lái)。如從環(huán)肽中脫鹽時(shí),先用水洗脫重新加到柱上的流分,然后用純甲醇洗脫所需成分另一種方法是將收集的樣品加到SephadexLH-20柱上,如Seto等在從植物薔薇中分離黃酮苷時(shí),采用此法以水洗除HPLC洗脫液中含有的磷酸,而后用甲醇將純化合物洗下。2022/12/246被分離物質(zhì)的收集2022/12/217.實(shí)例標(biāo)準(zhǔn)品的制備實(shí)例：茶氨酸、苯乙醇苷類、羅漢果甜苷Ⅴ等樣品的分離純化實(shí)例：綠原酸、大豆異黃酮等藥物雜質(zhì)研究制備型HPLC是制備純化雜質(zhì)的一種很有效的手段。2022/12/247.實(shí)例標(biāo)準(zhǔn)品的制備樣品的分離純化藥物雜質(zhì)研究2022/1實(shí)例：標(biāo)準(zhǔn)品的制備茶氨酸是影響茶葉品質(zhì)的重要組成部分,約占茶葉中游離氨基酸的40%以上，占茶葉干重的1～2%。藥理學(xué)研究表明茶氨酸能拮抗咖啡堿引起的神經(jīng)系統(tǒng)興奮,同時(shí)具有降壓作用。目前,僅日本有少量的茶氨酸對(duì)照品,且價(jià)格較貴,限制了對(duì)其進(jìn)一步的研究與應(yīng)用。肖偉濤等采用制備高效液相色譜技術(shù)分離純化茶氨酸對(duì)照品,純度達(dá)到98%以上,制備收率大于60%。方法簡(jiǎn)便,生產(chǎn)周期短、費(fèi)用低。茶氨酸產(chǎn)品可用作分析方法的對(duì)照品。苯乙醇苷類化合物為傳統(tǒng)補(bǔ)益中藥肉從蓉的有效成分,該類化合物有明顯提高記憶功能、抗衰老、助陽(yáng)等作用。松果菊苷是肉從蓉中含量較高的一種苯乙醇苷類化合物,在以管花肉從蓉為原料制成的國(guó)家級(jí)二類新藥--苯乙醇總苷中其質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)48%。但目前國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)有松果菊苷標(biāo)準(zhǔn)品出售。雷厲等利用反相制備高效液相色譜法從管花肉從蓉的乙醇提取物中純化制備了松果菊苷的標(biāo)準(zhǔn)品,純度達(dá)到98%以上該方法操作簡(jiǎn)便,重現(xiàn)性好,可用于松果菊苷及其它苯乙醇苷類化合物的大量制備。2022/12/24實(shí)例：標(biāo)準(zhǔn)品的制備茶氨酸是影響茶葉品質(zhì)的重要組成部分,約占茶實(shí)例：標(biāo)準(zhǔn)品的制備羅漢果甜苷Ⅴ(mogrosideV)我國(guó)傳統(tǒng)出口商品羅漢果中的主要甜味成分,具有甜度高、熱量低、水溶性好等優(yōu)點(diǎn)。藥理研究表明,羅漢果甜苷Ⅴ具有鎮(zhèn)咳、祛痰以及增強(qiáng)免疫等功效。但目前市場(chǎng)上還沒(méi)有羅漢果甜苷Ｖ的標(biāo)準(zhǔn)品出售。余麗娟等利用半制備高效液相色譜法得到羅漢果甜苷Ｖ標(biāo)準(zhǔn)品,純度達(dá)98.5%。方法具有操作簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好、產(chǎn)品純度高等優(yōu)點(diǎn)。為研究mogrosideV單體的活性及體內(nèi)藥物學(xué)過(guò)程提供了方便,也為制備其他羅漢果三萜苷類標(biāo)準(zhǔn)品提供了有益的參考。以甜苷Ｖ作為羅漢果中的含量測(cè)定的指標(biāo),對(duì)于確定羅漢果品質(zhì)的好壞、指導(dǎo)羅漢果的收購(gòu)和羅漢果甜苷產(chǎn)品的生產(chǎn)具有重要意義。2022/12/24實(shí)例：標(biāo)準(zhǔn)品的制備羅漢果甜苷Ⅴ(mogrosideV)我實(shí)例：樣品的分離純化

綠原酸具有抗菌、抗病毒、利膽、增高白血球及興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等功效。國(guó)外多以咖啡豆和金銀花為原料提取綠原酸。有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,杜仲葉片中綠原酸的含量與金銀花的相當(dāng),而且資源豐富,價(jià)格低廉。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)杜仲中綠原酸高純單體的分離多采用硅膠或大孔吸附樹脂反復(fù)柱層析或多級(jí)萃取,再采用重結(jié)晶法得到少量純品。彭密軍等采用制備高效液相色譜技術(shù),從杜仲葉提取物中分離純化得到高純活性成分綠原酸,綠原酸的純度98.61%。同時(shí),彭密軍等人認(rèn)為流速及洗脫方式對(duì)綠原酸的分離情況有較大影響,提出并應(yīng)用了流動(dòng)相速度梯度洗脫方法,該方法可以縮短分離時(shí)間,保持較高的分辨率,同時(shí)還能降低試劑的用量。此外,彭密軍等還利用制備高效液相-臺(tái)階梯度法分離純化了杜仲中三種環(huán)烯醚萜化合物。結(jié)果表明,產(chǎn)品純度均可達(dá)到95%以上,其中京尼平苷酸的產(chǎn)率可高達(dá)100.89ｍｇ/ｈ。2022/12/24實(shí)例：樣品的分離純化綠原酸具有抗菌、抗病毒、利膽、增高白血

大豆異黃酮(Soybeanisoflavones)是大豆生長(zhǎng)過(guò)程形成的次級(jí)代謝產(chǎn)物，被稱為“植物雌激素”，經(jīng)大孔吸附樹脂純化大豆異黃酮粗提物后，以PHPLC分離得到高純度的大豆異黃酮單體。以SHIM—packPRC—ODS(20mmx250mm，5μm)制備柱，考察了流動(dòng)相組成及流速、進(jìn)樣量對(duì)分離度的影響，確定了最佳色譜條件為乙腈一水流動(dòng)相梯度洗脫，進(jìn)樣量800μL，流速10mL／min，在120min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了6種異黃酮單體的基線分離及制備。經(jīng)超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC—MS／MS)鑒定，6種異黃酮單體依次為大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆素、黃豆黃素、染料木素。6種產(chǎn)品的純度分別為95．54％、90．14％、100％、100％、96．27％、100％。方法具有簡(jiǎn)便易行、穩(wěn)定性好、產(chǎn)品純度高等特點(diǎn)，適用于大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品的制備。實(shí)例：樣品的分離純化2022/12/24大豆異黃酮(Soybeanisoflavones)是大實(shí)例：用于藥物雜質(zhì)研究

所用儀器多為ShimadzuLC-8A、Waters2525、Waters600系列。制備型HPLC是制備純化雜質(zhì)的一種很有效的手段。2022/12/24實(shí)例：用于藥物雜質(zhì)研究所用儀器多為Shimadzu目前，制備色譜在實(shí)際制備生產(chǎn)中得到了廣泛的應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)：是制備純化天然產(chǎn)物、純化雜質(zhì)的一種很有效的手段,具有產(chǎn)品純度高、產(chǎn)率高、分離速度快等優(yōu)點(diǎn)。展望4waters高效制備液相色譜儀2022/12/24目前，制備色譜在實(shí)際制備生產(chǎn)中得到了廣泛的應(yīng)用展望4缺點(diǎn)：由分析型色譜到制備型色譜過(guò)渡的理論方面還不完善現(xiàn),應(yīng)加大其理論研究,尤其是對(duì)優(yōu)化操作條件的系統(tǒng)研究,以進(jìn)一步完善這項(xiàng)技術(shù)。還存在設(shè)備上一些問(wèn)題，比如色譜法的定性能力較差、填料的用量大且價(jià)格貴，使得生產(chǎn)成本高，制約了其發(fā)展。如何把分離和分析聯(lián)合成為一個(gè)整體，應(yīng)用于工業(yè)制備中，實(shí)行一體化的監(jiān)控，也有待于深入研究。與國(guó)外相比，我國(guó)的制備色譜發(fā)展還有很大差距，著眼于上述存在問(wèn)題的深入研究，制備色譜具有廣闊的發(fā)展前景。2022/12/24缺點(diǎn)：由分析型色譜到制備型色譜過(guò)渡的理論方面還不完善現(xiàn),應(yīng)加謝謝觀看2022/12/24謝謝觀看2022/12/219、春去春又回，新桃換舊符。在那桃花盛開(kāi)的地方，在這醉人芬芳的季節(jié)，愿你生活像春天一樣陽(yáng)光，心情像桃花一樣美麗，日子像桃子一樣甜蜜。12月-2212月-22Saturday,December24,202210、人的志向通常和他們的能力成正比例。07:16:5807:16:5807:1612/24/20227:16:58AM11、夫?qū)W須志也，才須學(xué)也，非學(xué)無(wú)以廣才，非志無(wú)以成學(xué)。12月-2207:16:5807:16Dec-2224-Dec-2212、越是無(wú)能的人，越喜歡挑剔別人的錯(cuò)兒。07:16:5807:16:5807:16Saturday,December24,202213、志不立，天下無(wú)可成之事。12月-2212月-2207:16:5807:16:58December24,202214、ThankyouverymuchfortakingmewithyouonthatsplendidoutingtoLondon.ItwasthefirsttimethatIhadseentheToweroranyoftheotherfamoussights.IfI'dgonealone,Icouldn'thaveseennearlyasmuch,becauseIwouldn'thaveknownmywayabout.。24十二月20227:16:58上午07:16:5812月-2215、會(huì)當(dāng)凌絕頂，一覽眾山小。十二月227:16上午12月-2207:16December24,202216、如果一個(gè)人不知道他要駛向哪頭，那么任何風(fēng)都不是順風(fēng)。2022/12/247:16:5807:16:5824December202217、一個(gè)人如果不到最高峰，他就沒(méi)有片刻的安寧，他也就不會(huì)感到生命的恬靜和光榮。7:16:58上午7:16上午07:16:5812月-22謝謝觀看THEEND9、春去春又回，新桃換舊符。在那桃花盛開(kāi)的地方，在這醉人芬芳高效液相制備色譜的設(shè)備進(jìn)展及應(yīng)用2022/12/242022/12/24高效液相制備色譜的設(shè)備進(jìn)展及應(yīng)用2022/12/212022目錄1液體制備色譜4展望2高效液相制備色譜柱設(shè)備應(yīng)用32022/12/24目錄1液體制備色譜4展望2高效液相制備色譜柱設(shè)備應(yīng)用32021液相色譜是將分離填料填裝在色譜柱內(nèi)，以液體流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，利用藥物不同活性成分與填料相互作用力的差異進(jìn)行分離。輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)高壓輸液泵在線脫氣裝置概念基本裝置液體制備色譜2022/12/241液相色譜是將分離填料填裝在色譜柱高壓輸液泵在線脫氣裝置概念分類兩種模式，一種是在柱上方加壓，另一種是在柱下方減壓。在低壓制備色譜中使用的是顆粒較大的填料，因此其分辨率是有限的。利用恒流泵抽送流動(dòng)相，帶著樣品流經(jīng)色譜柱，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的分離。其色譜柱一般是由耐壓的強(qiáng)化玻璃制成，填料顆粒大小比低壓制備色譜所用填料小，分離效率更高。高壓液相色譜低壓制備色譜中壓制備色譜利用更細(xì)的高效填料進(jìn)行分離的，具有高柱效、高流速、分離時(shí)間短的特點(diǎn)。與經(jīng)典液相色譜相比高效液相色譜有很大不同。2022/12/24分類兩種模式，一種是在柱上方加壓，另一種是在柱HPLC與經(jīng)典液相色譜的不同2022/12/24HPLC與經(jīng)典液相色譜的不同2022/12/212制備型液相色譜制備型液相色譜1.制備型HPLC與分析型HPLC的區(qū)別2.PHPLC的裝置輸液泵進(jìn)樣系統(tǒng)色譜柱系統(tǒng)檢測(cè)器餾分收集器數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng)柱結(jié)構(gòu)柱尺寸柱型對(duì)填裝的要求2022/12/242制備型液相色譜制備型液相色譜1.制備型HPLC與分目的不同流速不同進(jìn)樣模式不同上樣量不同色譜柱不同理論基礎(chǔ)不同檢測(cè)池不同1.與分析型HPLC的區(qū)別2022/12/24目的不同1.與分析型HPLC的區(qū)別2022/12/212.PHPLC裝置輸液泵進(jìn)樣系統(tǒng)色譜柱系統(tǒng)檢測(cè)器餾分收集器數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng)色譜柱是核心部件，色譜填料的填裝是其操作的關(guān)鍵技術(shù)。制備型HPLC由于采用細(xì)的填料、高壓操作，所以色譜柱多用不銹鋼制作。2022/12/242.PHPLC裝置色譜柱是核心部件，色譜填料的填裝是其操作制備HPLC的色譜柱系統(tǒng)在此處主要提出色譜柱系統(tǒng)，因?yàn)橄鄬?duì)于分析型色譜,制備色譜的核心就是色譜柱。為提供既穩(wěn)定又高效的色譜柱,并用小尺寸顆粒進(jìn)行填充,最常用也是最易實(shí)現(xiàn)的效果較為理想的是動(dòng)態(tài)軸向壓縮柱(DACTM)技術(shù)。DAC技術(shù)為使用者提供了用任一種填料自己裝填色譜柱、方便快速地調(diào)整柱長(zhǎng)度的可能性。在制備型HPLC中,色譜柱的內(nèi)徑可在100～500mm之間。一般增大色譜柱的直徑意味著可以承載更多的樣品,從而增加產(chǎn)量。增加色譜柱的長(zhǎng)度則意味著可加入的樣品量和分辨率的增大,但同時(shí)也增加了柱壓。研究表明對(duì)于難分離物系,可以采用直徑較小的色譜填料,以提高分離效率,但在分離度可以滿足分離要求的前提下,使用較大直徑的色譜填料將更為有利。色譜填料的填裝是其操作的關(guān)鍵技術(shù)。制備型HPLC由于采用細(xì)的填料、高壓操作，所以色譜柱多用不銹鋼制作。2022/12/24制備HPLC的色譜柱系統(tǒng)在此處主要提出色譜柱系統(tǒng)，因制備HPLC的色譜柱系統(tǒng)柱尺寸：柱短、內(nèi)徑大、呈圓餅狀在制備型HPLC分離過(guò)程中,在滿足分離度要求的前提下,可以采用增加制備柱內(nèi)徑的方法提高制備量。柱型：錐型柱與圓柱型柱錐型柱優(yōu)于圓柱型柱,錐型柱的樣品容量約為圓柱型柱的2倍,柱效比圓柱型柱高36%,色譜流出曲線峰值高于圓柱型柱12%。柱結(jié)構(gòu)：空管柱、軸向壓縮柱和徑向壓縮柱對(duì)填裝的要求：填料的種類、裝填技術(shù)2022/12/24制備HPLC的色譜柱系統(tǒng)柱尺寸：柱短、內(nèi)徑大、呈圓餅狀在制備柱結(jié)構(gòu)1.空管柱與分析柱相同，常用柱內(nèi)徑為10～100mm，采用勻漿填充技術(shù)填裝色譜填料。2.軸向壓縮柱是采用活塞壓縮床層，以使色譜柱內(nèi)填料均勻、密實(shí)，得到更高的柱效。其原理是通過(guò)活塞的上下移動(dòng)來(lái)裝柱、維持柱壓和卸柱，活塞周邊配置了特殊設(shè)計(jì)的密封圈，能容許活塞上下自由移動(dòng)，同時(shí)又能保持高的密封性。在柱內(nèi)的兩端均配有多孔不銹鋼濾板和能使樣品及洗脫液在柱截面上均勻分布的分散器。液流分散器保證了大量樣品盡可能地瞬時(shí)分散在柱截面上，進(jìn)而快速均勻進(jìn)入柱床，克服了柱中心樣品局部過(guò)濃的現(xiàn)象，保證了色譜柱的高效。根據(jù)在分離制備過(guò)程中提供給活塞的壓力是否持續(xù)，可將軸向壓縮柱分為靜態(tài)和動(dòng)態(tài)兩種，靜態(tài)軸向壓縮柱的效果比動(dòng)態(tài)的差，但是設(shè)備比動(dòng)態(tài)便宜。采用動(dòng)態(tài)軸向壓縮柱工藝裝填的色譜柱現(xiàn)已基本上主宰了整個(gè)制備型色譜柱市場(chǎng)，國(guó)內(nèi)已有動(dòng)態(tài)軸向壓縮柱制備色譜系統(tǒng)產(chǎn)品。2022/12/24柱結(jié)構(gòu)1.空管柱與分析柱相同，常用柱內(nèi)徑為10～聊城萬(wàn)合工業(yè)制造有限公司自主研發(fā)了高效液相軸向加壓（自振）制備層析柱系統(tǒng)，配套高壓輸液泵和檢測(cè)器，通過(guò)計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制，成功開(kāi)發(fā)了高效液相層析中藥提取裝備。圖1為高效液相軸向加壓（自振）制備色譜柱（HPLC-C200型）系統(tǒng)的示意圖。2022/12/24聊城萬(wàn)合工業(yè)制造有限公司自主研發(fā)了高效液相軸向加壓（自振）制徑向壓縮柱使用雙管的色譜柱，填料裝在管壁可壓縮的高聚物柱管內(nèi)制成柱芯，再將裝有填料的柱芯放入不銹鋼外套中，利用氣體或液體施壓于柱芯外壁和不銹鋼外套之間，壓緊柱芯內(nèi)的填料，使色譜柱得到徑向壓縮。該技術(shù)目的是消除顆粒間及顆粒與管壁間的空隙。徑向色譜柱的結(jié)構(gòu)如圖4所示，圖中表明進(jìn)入到徑向色譜柱的樣品和流動(dòng)相并非如傳統(tǒng)的軸向色譜柱從柱的一端流向另一端，而是沿徑向流動(dòng)，即樣品和流動(dòng)相是從色譜柱的周圍流向柱圓心。2022/12/24徑向壓縮柱使用雙管的色譜柱，填料裝在管壁可壓縮的高聚物柱管內(nèi)徑向壓縮柱的主要缺點(diǎn)是柱芯長(zhǎng)度固定，不如軸向壓縮柱可以任意調(diào)節(jié)。此外直徑較大的色譜柱中徑向經(jīng)常出現(xiàn)粒度梯度，造成流動(dòng)相徑向流速分布不均勻。由于徑向擴(kuò)散太慢，不能抵消柱截面積流速差異所產(chǎn)生的濃度梯度，所以徑向流速是峰展寬的一個(gè)重要來(lái)源。徑向壓縮柱主要是由Waters公司生產(chǎn)，并已有預(yù)制柱出售。2022/12/24徑向壓縮柱的主要缺點(diǎn)是柱芯長(zhǎng)度固定，不如軸向壓縮柱可以任意調(diào)柱尺寸現(xiàn)代高效制備液相色譜柱具有柱短、內(nèi)徑大、呈圓餅狀(pancake)的特征。目前高效制備柱的柱長(zhǎng)與常規(guī)分析柱相仿，一般為20~50cm遠(yuǎn)短于傳統(tǒng)柱1m甚至1m以上的制備柱，在制備型HPLC分離過(guò)程中，在滿足分離度要求的前提下，可以采用增加制備柱內(nèi)徑的方注提高制備量。柱型制備高效色譜柱按柱型可分為錐型柱與圓柱型柱兩大類。錐型柱優(yōu)于圓柱型柱，錐型柱的樣品容量約為圓柱型柱的2倍，柱效比圓柱型柱高36%，色譜流出曲線峰值高于圓林型林12%。2022/12/24柱尺寸現(xiàn)代高效制備液相色譜柱具有柱短、內(nèi)徑大、呈圓餅狀(制備色譜中對(duì)填料的要求一般來(lái)說(shuō)，分析型色譜柱填料也可以用于制備型色譜柱中，但是制備色譜中使用的量大，而且需要反復(fù)裝柱，因此對(duì)于制備色譜填料有一些特殊的要求：（1）機(jī)械強(qiáng)度高；（2）負(fù)載量高，單位重量的填料負(fù)載量高可以處理更多的樣品；（3）可大量供應(yīng)，批間的重現(xiàn)性好；（4）粒徑大小合適，布范圍窄，在制備分離過(guò)程中，對(duì)于難分離物系，可以采用較小粒徑的色譜填料，以提高分離效率。但在滿足分離要求的前提下，使用較大粒徑的色譜填料，可以獲得較大的生產(chǎn)能力；（5）化學(xué)穩(wěn)定性好，選擇性好，無(wú)毒，易于填充，價(jià)格合理等；（6）通常制備型HPLC每米的塔板數(shù)在20000以上，所用填料粒徑一般為5、7、10μm。2022/12/24制備色譜中對(duì)填料的要求一般來(lái)說(shuō)，分析型色譜柱填料也可以用于制對(duì)填料的要求

填料的種類

制備柱的裝填技術(shù)干裝法勻漿法壓縮法使用最多的就是硅膠及其衍生物的鍵合固定相填料近年來(lái)又發(fā)展了整體柱色譜。動(dòng)態(tài)軸向壓縮法(DAC)填裝的色譜柱柱床均勻、性能穩(wěn)定、柱效高。目前，DAC柱己基本上主宰了整個(gè)制備型色譜柱市場(chǎng)，柱徑己從25mm發(fā)展到1.6m。2022/12/24對(duì)填料的要求填料的種類制備柱的裝填技術(shù)干裝法使用最多的1.制備型HPLC的樣品預(yù)處理在高壓液相色譜進(jìn)樣之前,需對(duì)樣品進(jìn)行過(guò)濾。使用能套在注射器上的濾片可以除去樣品中混有的顆粒狀雜質(zhì),既方便又廉價(jià)。在選用過(guò)濾膜時(shí)應(yīng)注意使其適合于所用的溶劑,這一點(diǎn)在使用含四氫呋喃的溶劑時(shí)尤其重要。在色譜柱與進(jìn)樣器之間安裝前置柱可除去顆粒狀雜質(zhì)和吸附性強(qiáng)的樣品組分。前置柱通常裝有少量與色譜柱相同的填料,如填充得當(dāng),對(duì)系統(tǒng)分離效果不會(huì)造成很大影響。硅膠預(yù)處理柱可防止含有緩沖鹽或堿的流動(dòng)相所引起的麻煩,上訴物質(zhì)可破壞鍵合相填充料的硅膠骨架,常會(huì)在柱的上部形成空隙。預(yù)處理柱安裝在泵與進(jìn)樣器之間,這樣盡管流動(dòng)相被硅膠所飽和,但在進(jìn)樣途中不會(huì)有空隙或氣泡。3應(yīng)用與實(shí)例應(yīng)用與實(shí)例2022/12/241.制備型HPLC的樣品預(yù)處理3應(yīng)用與實(shí)例應(yīng)用與實(shí)例20222制備規(guī)模按照分離一次進(jìn)樣量的多少,制備型HPLC有3種規(guī)模,即半制備級(jí)HPLC、克級(jí)HPLC和工業(yè)級(jí)HPLC,如下表所示制備型HPLC以生產(chǎn)純物質(zhì)為目的,在經(jīng)濟(jì)合理的前提下,規(guī)模越大越好2022/12/242制備規(guī)模2022/12/213柱超載方式分析型HPLC與制備型HPLC的根本區(qū)別在于分離目的不同。在制備型HPLC中,為了節(jié)省投資和操作費(fèi)用,必須以最少的時(shí)間生產(chǎn)最大量的產(chǎn)品。為了提高制備量,柱必須超載。柱的超載方式有兩種,一種是所謂的“質(zhì)量超載”,即維持較小的進(jìn)樣體積,但提高進(jìn)樣濃度;另一種是所謂的“體積超載”,即保持較小的進(jìn)樣濃度,但增加進(jìn)樣體積。在制備型HPLC中,一般認(rèn)為采用質(zhì)量超載的方式較好。王志祥等人建立的混合池模型可以較好的描述制備型HPLC分離過(guò)程,發(fā)現(xiàn)在制備型HPLC分離過(guò)程中,分離度和柱效均隨質(zhì)量超載程度的增加而下降。但是,在分離度可以滿足分離要求的前提下,采用質(zhì)量超載的方式操作,可以提高制備量。2022/12/243柱超載方式2022/12/214流動(dòng)相進(jìn)行制備型液相色譜分離時(shí),所用溶劑的純度很重要。即使含純化合物的流動(dòng)相溶劑中含有微量的不揮發(fā)性雜質(zhì)當(dāng)大量溶劑經(jīng)蒸發(fā)后,其雜質(zhì)濃度就會(huì)增高。制備型液相色譜往往需消耗大量溶劑,因此應(yīng)在溶劑純度與所用數(shù)量之間進(jìn)行權(quán)衡。流動(dòng)相中的非揮發(fā)性添加劑會(huì)在產(chǎn)物回收時(shí)引起麻煩,這是可采用揮發(fā)性緩沖物來(lái)改進(jìn)分離效果,又易于將其除去。5洗脫制備型HPLC所采用的洗脫方式主要有兩種。一種是維持流動(dòng)相的熱力學(xué)參數(shù)不變的等度洗脫法;一種是改變流動(dòng)相的一種或幾種熱力學(xué)參數(shù)的梯度洗脫法。2022/12/244流動(dòng)相2022/12/216被分離物質(zhì)的收集在制備型分離工作中,需使用大量的洗脫溶劑,因此要采用適當(dāng)?shù)氖占?。如有可?應(yīng)對(duì)溶劑回收再用,因而也應(yīng)盡量不使用混合溶劑。在使用反相或聚合物吸附劑進(jìn)行分離時(shí),有時(shí)從水液中回收樣品較困難。一種解決辦法是蒸除其中的有機(jī)溶劑,然后用甲苯或氯仿提取殘留水液。如以甲醇-水為洗脫液,可將收集的流分用水稀釋5倍,用泵加回到色譜柱上,然后用甲醇將化合物洗脫下來(lái)。如從環(huán)肽中脫鹽時(shí),先用水洗脫重新加到柱上的流分,然后用純甲醇洗脫所需成分另一種方法是將收集的樣品加到SephadexLH-20柱上,如Seto等在從植物薔薇中分離黃酮苷時(shí),采用此法以水洗除HPLC洗脫液中含有的磷酸,而后用甲醇將純化合物洗下。2022/12/246被分離物質(zhì)的收集2022/12/217.實(shí)例標(biāo)準(zhǔn)品的制備實(shí)例：茶氨酸、苯乙醇苷類、羅漢果甜苷Ⅴ等樣品的分離純化實(shí)例：綠原酸、大豆異黃酮等藥物雜質(zhì)研究制備型HPLC是制備純化雜質(zhì)的一種很有效的手段。2022/12/247.實(shí)例標(biāo)準(zhǔn)品的制備樣品的分離純化藥物雜質(zhì)研究2022/1實(shí)例：標(biāo)準(zhǔn)品的制備茶氨酸是影響茶葉品質(zhì)的重要組成部分,約占茶葉中游離氨基酸的40%以上，占茶葉干重的1～2%。藥理學(xué)研究表明茶氨酸能拮抗咖啡堿引起的神經(jīng)系統(tǒng)興奮,同時(shí)具有降壓作用。目前,僅日本有少量的茶氨酸對(duì)照品,且價(jià)格較貴,限制了對(duì)其進(jìn)一步的研究與應(yīng)用。肖偉濤等采用制備高效液相色譜技術(shù)分離純化茶氨酸對(duì)照品,純度達(dá)到98%以上,制備收率大于60%。方法簡(jiǎn)便,生產(chǎn)周期短、費(fèi)用低。茶氨酸產(chǎn)品可用作分析方法的對(duì)照品。苯乙醇苷類化合物為傳統(tǒng)補(bǔ)益中藥肉從蓉的有效成分,該類化合物有明顯提高記憶功能、抗衰老、助陽(yáng)等作用。松果菊苷是肉從蓉中含量較高的一種苯乙醇苷類化合物,在以管花肉從蓉為原料制成的國(guó)家級(jí)二類新藥--苯乙醇總苷中其質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)48%。但目前國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)有松果菊苷標(biāo)準(zhǔn)品出售。雷厲等利用反相制備高效液相色譜法從管花肉從蓉的乙醇提取物中純化制備了松果菊苷的標(biāo)準(zhǔn)品,純度達(dá)到98%以上該方法操作簡(jiǎn)便,重現(xiàn)性好,可用于松果菊苷及其它苯乙醇苷類化合物的大量制備。2022/12/24實(shí)例：標(biāo)準(zhǔn)品的制備茶氨酸是影響茶葉品質(zhì)的重要組成部分,約占茶實(shí)例：標(biāo)準(zhǔn)品的制備羅漢果甜苷Ⅴ(mogrosideV)我國(guó)傳統(tǒng)出口商品羅漢果中的主要甜味成分,具有甜度高、熱量低、水溶性好等優(yōu)點(diǎn)。藥理研究表明,羅漢果甜苷Ⅴ具有鎮(zhèn)咳、祛痰以及增強(qiáng)免疫等功效。但目前市場(chǎng)上還沒(méi)有羅漢果甜苷Ｖ的標(biāo)準(zhǔn)品出售。余麗娟等利用半制備高效液相色譜法得到羅漢果甜苷Ｖ標(biāo)準(zhǔn)品,純度達(dá)98.5%。方法具有操作簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好、產(chǎn)品純度高等優(yōu)點(diǎn)。為研究mogrosideV單體的活性及體內(nèi)藥物學(xué)過(guò)程提供了方便,也為制備其他羅漢果三萜苷類標(biāo)準(zhǔn)品提供了有益的參考。以甜苷Ｖ作為羅漢果中的含量測(cè)定的指標(biāo),對(duì)于確定羅漢果品質(zhì)的好壞、指導(dǎo)羅漢果的收購(gòu)和羅漢果甜苷產(chǎn)品的生產(chǎn)具有重要意義。2022/12/24實(shí)例：標(biāo)準(zhǔn)品的制備羅漢果甜苷Ⅴ(mogrosideV)我實(shí)例：樣品的分離純化

綠原酸具有抗菌、抗病毒、利膽、增高白血球及興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等功效。國(guó)外多以咖啡豆和金銀花為原料提取綠原酸。有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,杜仲葉片中綠原酸的含量與金銀花的相當(dāng),而且資源豐富,價(jià)格低廉。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)杜仲中綠原酸高純單體的分離多采用硅膠或大孔吸附樹脂反復(fù)柱層析或多級(jí)萃取,再采用重結(jié)晶法得到少量純品。彭密軍等采用制備高效液相色譜技術(shù),從杜仲葉提取物中分離純化得到高純活性成分綠原酸,綠原酸的純度98.61%。同時(shí),彭密軍等人認(rèn)為流速及洗脫方式對(duì)綠原酸的分離情況有較大影響,提出并應(yīng)用了流動(dòng)相速度梯度洗脫方法,該方法可以縮短分離時(shí)間,保持較高的分辨率,同時(shí)還能降低試劑的用量。此外,彭密軍等還利用制備高效液相-臺(tái)階梯度法分離純化了杜仲中三種環(huán)烯醚萜化合物。結(jié)果表明,產(chǎn)品純度均可達(dá)到95%以上,其中京尼平苷酸的產(chǎn)率可高達(dá)100.89ｍｇ/ｈ。2022/12/24實(shí)例：樣品的分離純化綠原酸具有抗菌、抗病毒、利膽、增高白血

大豆異黃酮(Soybeanisoflavones)是大豆生長(zhǎng)過(guò)程形成的次級(jí)代謝產(chǎn)物，被稱為“植物雌激素”，經(jīng)大孔吸附樹脂純化大豆異黃酮粗提物后，以PHPLC分離得到高純度的大豆異黃酮單體。以SHIM—packPRC—ODS(20mmx250mm，5μm)制備柱，考察了流動(dòng)相組成及流速、進(jìn)樣量對(duì)分離度的影響，確定了最佳色譜條件為乙腈一水流動(dòng)相梯度洗脫，進(jìn)樣量800μL，流速10mL／min，在120min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了6種異黃酮單體的基線分離及制備。經(jīng)超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC—MS／MS)鑒定，6種異黃酮單體依次為大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆素、黃豆黃素、染料木