素材：單克隆抗體制備的三次篩選-高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

單克隆抗體制備的三次篩選科學(xué)家們是如何做到運(yùn)用特定的培養(yǎng)基將肉眼無法觀察的細(xì)胞篩選出來的呢？在動物細(xì)胞工程的教學(xué)中，設(shè)計到非常重要的應(yīng)用——單克隆抗體的制備過程，這個過程技術(shù)很成熟了，但這個技術(shù)背后的原理教材上只是做了非常簡單的描述，這個過程真的有點(diǎn)復(fù)雜，主要是化學(xué)物質(zhì)的名稱有點(diǎn)拗口，很多同學(xué)甚至老師都不明白。DNA合成的兩條途徑：核酸的合成有兩條途徑：一條是全合成途徑，即從一些小分子物質(zhì)先合成為嘌呤、嘧啶，最后合成代謝必需的核酸，氨基蝶呤（aminopterin，A）能夠阻止DNA全合成途徑。另一條是應(yīng)急途徑，可直接利用外源核苷酸合成DNA。次黃嘌呤—鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）和胸苷激酶（TK）是應(yīng)急途徑中的兩種重要酶。HGPRT的作用是將次黃嘌呤、鳥嘌呤轉(zhuǎn)變成次黃嘌呤核苷酸、鳥嘌呤核苷酸參與DNA合成。TK的作用是將胸腺嘧啶核苷轉(zhuǎn)化為脫氧胸腺嘧啶核苷一磷酸（dTMP），再進(jìn)一步合成DNA。HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞是將融合的細(xì)胞放入HAT選擇培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基有三種關(guān)鍵成分：次黃嘌呤（hy-poxanthine，H）、氨基蝶呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）。氨基蝶呤可阻斷骨髓瘤細(xì)胞利用全合成途徑合成DNA，使骨髓瘤細(xì)胞致死。在這樣的培養(yǎng)基上，細(xì)胞就只剩下一條應(yīng)激途徑可以合成DNA了。B細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞都只剩下這一條路徑了，B細(xì)胞無法增殖——死亡，骨髓瘤細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合的細(xì)胞怎么區(qū)分呢？第一次篩選——誘導(dǎo)應(yīng)激路徑有缺陷的骨髓瘤細(xì)胞通過突變誘導(dǎo)次黃嘌呤—鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷型（HGPRT-）或胸苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤細(xì)胞，并經(jīng)過毒性培養(yǎng)基篩選出的

HGPRT-或TK-骨髓瘤細(xì)胞。具體方法是將誘導(dǎo)突變的骨髓瘤細(xì)胞放入含氮鳥嘌呤或6-硫代鳥嘌呤的鳥嘌呤類似物培養(yǎng)基上，含HGPRT-的骨髓瘤細(xì)胞會將氮鳥嘌呤或6-硫代鳥嘌呤轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的核苷酸形式參與DNA合成而發(fā)生毒性作用，使細(xì)胞致死。而HGPRT-骨髓瘤細(xì)胞由于HGPRT活性喪失，不能使用氮鳥嘌呤或6-硫代鳥嘌呤，能生活在高濃度的含氮鳥嘌呤或6-硫代鳥嘌呤的鳥嘌呤類似物培養(yǎng)基上。同理，在培養(yǎng)基中加入5-溴尿嘧啶脫氧核苷（BudR），其中的5-溴尿嘧啶是嘧啶類似物，可篩選出TK-骨髓瘤細(xì)胞。所以在進(jìn)行單克隆抗體制備時，選取的骨髓瘤細(xì)胞是已經(jīng)應(yīng)激路徑有缺陷的細(xì)胞，只有全合成路徑正常哦！——這才是真正的第一次篩選。第二次篩選經(jīng)融合后細(xì)胞將以多種形式出現(xiàn)，如融合的淋巴B細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞、融合的淋巴B細(xì)胞和淋巴B細(xì)胞、融合的骨髓瘤細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞、未融合的淋巴B細(xì)胞、未融合的骨髓瘤細(xì)胞以及細(xì)胞的多聚體形式等。正常的淋巴B細(xì)胞在培養(yǎng)基中存活僅5d-7d，無需特別篩選，細(xì)胞的多聚體形式也容易死去，而未融合的骨髓瘤細(xì)胞則需要進(jìn)行特別的篩選加以去除。由于氨基蝶呤可阻斷骨髓瘤細(xì)胞利用全合成途徑合成DNA，使骨髓瘤細(xì)胞致死。因而，只有融合細(xì)胞具有親代雙方的遺傳特性，利用淋巴B細(xì)胞中存在的應(yīng)急途徑合成DNA，才能在HAT培養(yǎng)基中生存。經(jīng)HAT選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)1d-2d，將有大量的骨髓瘤細(xì)胞死去，3d-4d后骨髓瘤細(xì)胞消失，再培養(yǎng)7d-10d后改用HT培養(yǎng)液培養(yǎng)2周，然后改用一般培養(yǎng)液培養(yǎng)，即可獲得所需的雜交骨髓瘤細(xì)胞。第三次篩選第三次篩選的目的是獲得產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。在實際免疫過程中，由于采用連續(xù)注射抗原的方法，且一種抗原決定簇刺激機(jī)體形成相應(yīng)的一種效應(yīng)B淋巴細(xì)胞，因此，從小鼠脾臟中取出的效應(yīng)B淋巴細(xì)胞的特異性是不同的，經(jīng)HAT培養(yǎng)液篩選出的雜交瘤細(xì)胞特異性也存在差異，所以必須從雜交瘤細(xì)胞群中篩選出能產(chǎn)生針對某一預(yù)定抗原決定簇的特異性雜交瘤細(xì)胞，才能制備單一性抗體。篩選的方法很多：（1）抗原與抗體發(fā)生的免疫學(xué)反應(yīng)，通常采用有限稀釋克隆細(xì)胞的方法，將雜交瘤細(xì)胞多倍稀釋后接種在多孔的細(xì)胞培養(yǎng)板上，使每一孔含一個雜交瘤細(xì)胞，再由這些單細(xì)胞克隆生長，當(dāng)細(xì)胞形成集落時，進(jìn)行專一性抗體陽性檢測。（2）免疫熒光技術(shù)，是一種將免疫反應(yīng)的特異性與熒光分子的可見性結(jié)合起來的方法。在一定條件下，用化學(xué)方法將熒光物質(zhì)（熒光素）與抗體結(jié)合，但不影響抗體與抗原的結(jié)合活性，與相應(yīng)抗原結(jié)合后，在熒光顯微鏡下觀察。（3）放射免疫測定，是一種以放射性同位素作為標(biāo)記物，將同位素分析的靈敏性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來的測定技術(shù)。應(yīng)用競爭性結(jié)合的原理，用放射性同位素標(biāo)記抗原（或抗體）與相應(yīng)抗體（或抗原）結(jié)合，通過測定抗原抗體結(jié)合物的放射活性來判斷，可進(jìn)行超微量分析，敏感性高，用于測定抗原、抗體、抗原抗體復(fù)合物。（4）酶聯(lián)免疫吸附測定，是一種以抗原—抗體反應(yīng)的特異性與酶對底物高