多肽知識課件

多肽的基本知識多肽定義：多肽是α－氨基酸以肽鍵連接在一起而形成的化合物，它也是蛋白質(zhì)水解的中間產(chǎn)物。由兩個氨基酸分子脫水縮合而成的化合物叫做二肽，同理類推還有三肽、四肽、五肽等。通常由三個或三個以上氨基酸分子脫水縮合而成的化合物都可以成為叫多肽。多肽合成：固相合成法，液相合成法樹脂的選擇及氨基酸的固定將固相合成與其他技術(shù)分開來的最主要的特征是固相載體，能用于多肽合成的固相載體必須滿足如下要求：必須包含反應(yīng)位點（或反應(yīng)基團(tuán)），以使肽鏈連在這些位點上，并在以后除去；必須對合成過程中的物理和化學(xué)條件穩(wěn)定；載體必須允許在不斷增長的肽鏈和試劑之間快速的、不受阻礙的接觸；另外，載體必須允許提供足夠的連接點，以使每單位體積的載體給出有用產(chǎn)量的肽，并且必須盡量減少被載體束縛的肽鏈之間的相互作用。用于固相法合成多肽的高分子載體主要有三類：聚苯乙烯-苯二乙烯交聯(lián)樹脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯-乙二醇類樹脂及衍生物，這些樹脂只有導(dǎo)入反應(yīng)基團(tuán)，才能直接連上（第一個）氨基酸。根據(jù)所導(dǎo)入反應(yīng)基團(tuán)的不同，又把這些樹脂及樹脂衍生物分為氯甲基樹脂、羧基樹脂、氨基樹脂或酰肼型樹脂。氨基、羧基、側(cè)鏈的保護(hù)及脫除

要成功合成具有特定的氨基酸順序的多肽，需要對暫不參與形成酰胺鍵的氨基和羧基加以保護(hù)，同時對氨基酸側(cè)鏈上的活性基因也要保護(hù)，反應(yīng)完成后再將保護(hù)基因除去。同液相合成一樣，固相合成中多采用烷氧羰基類型作為α氨基的保護(hù)基，因為這樣不易發(fā)生消旋。最早是用芐氧羰基，由于它需要較強的酸解條件才能脫除，所以后來改為叔丁氧羰基（BOC）保護(hù)，用TFA（三氟乙酸）脫保護(hù)，但不適用含有色氨酸等對酸不穩(wěn)定的肽類的合成。changMeienlofer和Atherton等人采用Carpino報道的Fmoc(9-芴甲氧羰基)作為α氨基保護(hù)基，F(xiàn)moc基對酸很穩(wěn)定，但能用哌啶-CH2CL2或哌啶-DMF脫去，近年來，F(xiàn)moc合成法得到了廣泛的應(yīng)用。羧基通常用形成酯基的方法進(jìn)行保護(hù)。甲酯和乙酯是逐步合成中保護(hù)羧基的常用方法，可通過皂化除去或轉(zhuǎn)變?yōu)殡乱员阌糜谄瑪嘟M合；叔丁酯在酸性條件下除去；芐酯常用催化氫化除去。對于合成含有半胱氨酸、組氨酸、精氨酸等帶側(cè)鏈功能基的氨基酸的肽來說，為了避免由于側(cè)鏈功能團(tuán)所帶來的副反應(yīng)，一般也需要用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基將側(cè)鏈基團(tuán)暫時保護(hù)起來。保護(hù)基的選擇既要保證側(cè)鏈基團(tuán)不參與形成酰胺的反應(yīng)，又要保證在肽合成過程中不受破壞，同時又要保證在最后肽鏈裂解時能被除去。如用三苯甲基保護(hù)半胱氨酸的S-，用酸或銀鹽、汞鹽除去；組氨酸的咪唑環(huán)用2,2,2-三氟-1-芐氧羰基和2,2,2-三氟-1-叔丁氧羰基乙基保護(hù)，可通過催化氫化或冷的三氟乙酸脫去。精氨酸用金剛烷氧羰基（Adoc）保護(hù)，用冷的三氟乙酸脫去。

固相中的接肽反應(yīng)原理與液相中的基本一致，將兩個相應(yīng)的氨基被保護(hù)的及羧基被保護(hù)的氨基酸放在溶液內(nèi)并不形成肽鍵，要形成酰胺鍵，經(jīng)常用的手段是將羧基活化，變成混合酸酐、活潑酯、酰氯或用強的失去劑（如碳二亞氨）形成對稱酸酐等方法來形成酰胺鍵。其中選用DCC、HOBT或HOBT/DCC的對稱酸酐法、活化酯法接肽應(yīng)用最廣。裂解及合成肽鏈的純化BOC法用TFA+HF裂解和脫側(cè)鏈保護(hù)基，F(xiàn)MOC法直接用TFA，有時根據(jù)條件不同，其它堿、光解、氟離子和氫解等脫保護(hù)方法也被采用。合成肽鏈進(jìn)一步的精制、分離與純化通常采用高效液相色譜、親和層析、毛細(xì)管電泳等。側(cè)鏈的保護(hù)Asp和Glu

Asp和Glu側(cè)鏈羧基常用t-Bu保護(hù).可用TFA、TMSBr等脫除.但是用t-Bu保護(hù)仍有側(cè)鏈環(huán)化形成酰亞胺的副反應(yīng)發(fā)生.近年來，發(fā)展了一些新的保護(hù)基如環(huán)烷醇酯、金剛烷醇酯等可減輕這一副反應(yīng)，這些保護(hù)基可用TMSOTf(三氟甲磺酸三甲硅烷酯)除去。Asn和GlnAsn和Gln側(cè)鏈的酰胺鍵在肽合成中一般不加以保護(hù).但合成大肽時，Asn和Gln的α-羧基活化時可能會發(fā)生分子內(nèi)脫氫反應(yīng)生成氰基化合物.堿性時Gln的側(cè)鏈可以環(huán)化生成酰胺.而且不保護(hù)的Fmoc-Gln和Fmoc-Asn在DCM中溶解度很差.為了避免這些問題，可以用9-咕噸基，2，4，6-三甲氧芐基，4，4′―二甲氧二苯甲基或三苯甲基等保護(hù)，這四種基因均可用TFA脫除。

Cys

Cys的－SH具有強親核性，易被酰化成硫醚，也易被氧化為二硫鍵，必須加以保護(hù).常用保護(hù)基有三類：一類用TFA可脫除，如對甲芐基、對甲氧芐基和三苯甲基等；第二類可用(CF3CO)3T1／TFA脫除，對TFA穩(wěn)定.如t-Bu、Bom和乙酰胺甲基等.第三類對弱酸穩(wěn)定，如芐基和叔丁硫基(stBu)等，Cys(StBu)可用巰基試劑和磷試劑還原，Cys(Bzl)可用Na/NH3(1)脫保護(hù)；Lys

Lys的ε-NH2必須加以保護(hù).但與α－NH2的保護(hù)方式應(yīng)不同，該保護(hù)基要到肽鏈合成后除去.ε－NH2的保護(hù)無消旋問題，可以采用?；Ｗo(hù)基，其它常用的保護(hù)基有芐氧碳基和Boc。裂解及側(cè)鏈保護(hù)基脫除

Fmoc法裂解和脫側(cè)鏈保護(hù)基時可采用弱酸.TFA為應(yīng)用最廣泛的弱酸試劑，它可以脫除t-Bu、Boc、Adoc、Mtr等；條件溫和、副反應(yīng)較少.不足之處：Arg側(cè)鏈的Mtr很難脫除，TFA用量較大；無法除掉Cys的t-Bu等基因.也有采用強酸脫保護(hù)的方法：如用HF來脫除一些對弱酸穩(wěn)定的保護(hù)基，如Asp、Glu、Ser、Thr的Bzl(芐基)保護(hù)基等，但是當(dāng)脫除Asp的吸電子保護(hù)基時，會引起環(huán)化副反應(yīng).而TMSBr和TMSOTf在有苯甲硫醚存在時，脫保護(hù)速度很快.此外，根據(jù)條件不同，堿、光解、氟離子和氫解等脫保護(hù)方法也有應(yīng)用。

2.如果帶電氨基酸平均分布于全部序列中，那么含有>25%帶電氨基酸（E，D，K，R，H）的親水肽和含有<25%疏水氨基酸的肽一般都能溶于水溶液。多肽的純化系統(tǒng)一般為0.1%TFA/水和0.1%TFA/ACN。因此，如果肽溶解在沒有緩沖能力或者緩沖能力很弱的緩沖液中，結(jié)果可能導(dǎo)致肽溶液呈酸性。在使用別的方法溶解肽時務(wù)必使溶劑的pH值近乎中性。酸性肽（E+D殘基數(shù)多于K+R+H殘基數(shù)）和堿性肽（K+R+H殘基數(shù)多于E+D殘基數(shù)）在中性pH值條件下比在酸性pH值下更易于溶解。

3.對于疏水氨基酸含量為50%～75%的肽，即使序列中含有>25%帶電氨基酸也有可能不溶于水或者部分溶解。最好先把肽溶于最少量的強有機溶劑如DMF、ACN、異丙醇、乙醇、乙酸、4-8MGdnHCl、尿素，或者DMSO（序列中沒有C，W，M時），及其它類似的有機溶劑中。最好將溶解肽的有機溶劑緩慢地逐滴加入水溶液中，如果溶液變渾濁，可能是達(dá)到了溶解極限，繼續(xù)溶解就沒什么用了。需要注意的是，最開始選擇的溶劑應(yīng)該與實驗系統(tǒng)兼容。

4.疏水氨基酸含量>75%的強疏水肽一般也不溶于水溶液。此類肽也應(yīng)該先用強有機溶劑（如TFA，甲酸）溶解，如果將其加入到水溶液中也可能產(chǎn)生沉淀。最后的肽溶液可能需要高濃度的有機溶劑使之變性，而有機溶劑一般不用于活細(xì)胞的生物功能研究。

5.S，T，E，D，K，R，H，N，Q，Y含量高（>75%）的多肽序列容易形成多余的分子間氫鍵網(wǎng)絡(luò)，在濃的水溶液中容易形成凝膠。此類肽可以用步驟3所述方法溶解。肽的溶解方法根據(jù)不同的氨基酸序列，可以參考以下方法來溶解合成肽。最好是先將少量肽用水溶液溶解，不要一次將全部樣品都溶解掉。

1.將酸性氨基酸Asp(D)，Glu(E)和C端-COOH的值定為-1。

2.將堿性氨基酸Arg(R)，Lys(K)，His(H)的值定為+1。

3.計算肽中全部電荷量。

4.如果肽的全部電荷為正值，則肽呈堿性，可以先用水溶解。如果肽不溶于水，可以用10%乙酸或者更高濃度的乙酸溶解。如果肽一點都不溶，加入TFA(<50ml)助溶，并用去離子水稀釋至1ml。

5.如果肽的全部電荷為負(fù)值，則肽呈酸性，可以先用水溶解。如果肽不溶于水，加入NH4OH(<50ml)助溶，并用去離子水稀釋至1ml。

6.如果肽的全部電荷為0，則肽呈中性。中性肽需要用乙腈、甲醇、異丙醇等有機溶劑來溶解，也可以加入變性劑（如尿素、鹽酸胍等）。實例：KRLMKSIEVIMPL:(+4)+(-2)=+2。此條肽呈堿性。見以上步驟4。LVKMKSIEDPDCE:(+3)+(-5)=-2。此條肽呈酸性。見以上步驟5。MVSRKDLVEHRDM:(+4)+(-4)=0。此條肽呈中性。見以上步驟6。多肽的不穩(wěn)定

多肽的不穩(wěn)定性是其制劑研究中存在的主要問題之一，其原因較多。但對某一個多肽來說引起不穩(wěn)定的主要原因并不多。詳細(xì)研究外界條件（如PH、溫度、光照、氧濃度等）對多肽穩(wěn)定性的影響有助于設(shè)計合理的制劑配方。盡管添加劑穩(wěn)定多肽的機制還不十分清楚，使用添加劑仍是目前提高多肽制劑穩(wěn)定性的主要手段之一。應(yīng)用CD、DSC等分析手段可幫助快速篩選道合適的添加劑。引起多肽不穩(wěn)定的原因

1.脫酰胺反應(yīng)在脫酰反應(yīng)中，Asn/Gln殘基水解形成Asp/Glu。非酶催化的脫酰胺反應(yīng)的進(jìn)行。在Asn-Gly-結(jié)構(gòu)中的酰胺基團(tuán)更易水解，位于分子表面的酰胺基團(tuán)也比分子內(nèi)部的酰胺基團(tuán)易水解。2.氧化多肽溶液易氧化的主要原因有兩種，一是溶液中有過氧化物的污染，二是多肽的自發(fā)氧化。在所有的氨基酸殘基中，Met、Cys和His、Trp、Tyr等最易氧化。氧分壓、溫度和緩沖溶液對氧化也都有影響。提高穩(wěn)定性的途徑1.定點突變通過基因工程手段替換引起多肽不穩(wěn)定的殘基或引入能增加多肽穩(wěn)定性的殘基，可提高多肽的穩(wěn)定性。2.化學(xué)修飾多肽的化學(xué)修飾方法很多，研究最多的是PEG修飾。PEG是一種水溶性高分子化合物，在體內(nèi)可降解，無毒。PEG與多肽結(jié)合后能提高熱穩(wěn)定性，抵抗蛋白酶的降解，降低抗原性，延長體內(nèi)半衰期。選擇合適的修飾方法和控制修飾程度可體質(zhì)或提高原生物活性。3.添加劑通過加入添加劑，如糖類、多元醇、明膠、氨基酸和某些鹽類，可以提高多肽的穩(wěn)定性。糖和多元醇在低濃度下迫使更多的水分子圍繞在蛋白質(zhì)周圍，因而提高了多肽的穩(wěn)定性。在凍干過程中，上述物質(zhì)還可以取代水而與多肽形成氫鍵來穩(wěn)定多肽的天然構(gòu)象，而且還可以提高凍干制品的玻璃化溫度。此外表面活性劑如SDS、Tween、Pluronic,能防止多肽表面吸附、聚集和沉淀