《生物技術藥物》word版參考模板

9/9生物技術藥物總結第一講 總論生物技術藥物(BiotechdrugsorBiopharmaceuticals)：指采用生物技術生產的用于疾病的預防、治療和診斷的制品。生物技術：指以現代生命科學為基礎，結合其他基礎科學的科學原理，采用先進的科學技術手段，按照預先的設計改造生物體或加工生物原料，為人類生產出所需產品或達到某種目的。主要包括：基因工程、細胞工程、酶工程、發(fā)酵工程、蛋白質工程、抗體工程。生物技術藥物分類（按化學特性）：天然生物技術藥物；重組活性蛋白、多肽；基因藥物（核酸藥物）第二講 基因工程基本過程與方法（一）原核表達載體（大腸桿菌）功能元件：啟動子及調控序列、核糖體結合位點、松弛型復制子、轉錄終止區(qū)、多克隆位點、篩選標記哺乳動物細胞表達載體功能元件：原核DNA序列、啟動子、終止子和多聚腺苷化信號、拼接信號、篩選標記第三講 基因工程基本過程與方法（二）——基因文庫的構建、基因工程中的常用酶、DNA測序cDNA文庫：指通過克隆的方法保存在宿主中的一群混合分子，這些分子中的插入片段的總和可代表某種生物全部mRNA序列。cDNA基因文庫構建的步驟：①細胞總RNA的提取和mRNA的分離；②第一條cDNA合成：oligo(dT)引物引導的DNA合成法、隨機引物合成法、特定寡核苷酸引物合成法；③第二條cDNA合成：自身引物合成法、置換合成法、外加引物合成法④雙鏈cDNA克隆進質?；蚴删w載體并導入宿主中繁殖限制性核酸內切酶（同尾酶）：一類能識別雙鏈DNA分子中的特定核苷酸序列并能切割DNA雙鏈的核酸內切酶。識別序列特點：多數具有嚴格的識別序列；識別序列的長度:4~8個堿基對；序列特征：回文序列第四講 基因工程基本過程與方法（三）——細胞轉化與轉染連接子導入受體細胞：轉化：將質粒或DNA導入宿主細胞，引起細胞遺傳的改變。轉染：真核細胞的轉化轉導：通過噬菌體(或病毒)將宿主基因從一個細胞轉移到另一個不同基因型的細胞中?！Ｓ梅椒ǎ?原核細胞：CaCl2感受態(tài)法、噬菌體體外包裝法真核細胞：電穿孔法、DNA-磷酸鈣共沉淀法、脂質體介導法、顯微注射法CaCl2感受態(tài)法：適用于革蘭氏陰性細菌。原理：是鈣離子與細菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結構，后者經熱脈沖（HeatShock)發(fā)生收縮作用，使細胞膜出現空隙，使DNA分子能夠通過。優(yōu)點：操作方便缺點：轉化效率較低重組體克隆的篩選與鑒定：抗藥性標記篩選、※蘭-白斑篩選（α-互補）、DNA電泳檢測α-互補：將缺陷α-半乳糖苷酶N端部分序列的質粒載體轉入缺陷α-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主菌，并且在含有X-gal的培養(yǎng)基上選擇性培養(yǎng)，用乳糖類似物IPTG作為安慰性誘導劑進行誘導。質粒轉入宿主菌后，宿主與質粒產生的有缺陷的α-半乳糖苷酶之間可以形成互補，對X-gal進行降解可產生藍色菌落，這就是α-互補現象。定點突變： 1、盒式誘變：利用一段人工合成的具有突變序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相應序列。2、寡核苷酸引物誘變：指應用合成的寡核苷酸片段作為誘變劑，誘發(fā)基因或DNA片段中特定位點發(fā)生突變的技術。3、PCR誘變寡聚核苷酸介導的突變盒式突變PCR介導的突變優(yōu)點保真度高簡單易行突變效率高操作簡單突變成功率高缺點突變效率相對低操作復雜周期長受到酶切位點的限制后續(xù)工作復雜TaqDNA聚合酶保真性偏低第五講 原核表達系統(tǒng)啟動子（promotor）：是RNA聚合酶結合并啟動轉錄的特異DNA序列。核糖體結合位點（RBS）：遺傳信息翻譯成多肽鏈起始于mRNA上的核糖體結合位點（RBS）。它是起始密碼子AUG上游的一段非翻譯區(qū)序列。常用的啟動子轉錄調控系統(tǒng)Plac轉錄調控系統(tǒng)：弱,IPTG誘導lPL和lPR轉錄調控系統(tǒng):強，熱誘導Ptrp轉錄調控系統(tǒng):強，吲哚丙烯酸Ptac轉錄調控系統(tǒng)：強，IPTG誘導PT7轉錄調控系統(tǒng)：轉錄活性高，特異性強；IPTG誘導表達形式： 蛋白質結構：非融合型表達：天然完整蛋白融合型表達：如GST融合表達蛋白融合型表達：如GST融合表達蛋白優(yōu)點：1、轉錄和翻譯的起始由正常的大腸桿菌序列調控，表達效率較高2、融合蛋白較天然真核蛋白更穩(wěn)定3、可以利用識別原核肽段的配體進行親和層析純化4、融合蛋白分子量大，易于電泳鑒定表達部位：包涵體、周質表達包涵體：存在于細胞質中的一種不溶性蛋白質聚集折疊而成的晶體結構物。形成原因：目的基因的高表達，使蛋白無足夠時間進行肽鏈折疊，產生凝集；種種原因引起的蛋白不能正確折疊；蛋白的性質；溫度、pH值等環(huán)境條件的影響等。特點： 1.簡化外源基因表達產物的分離操作：2.能在一定程度上保持表達產物的結構穩(wěn)定周質分泌表達的特點分泌后的蛋白產物不含氨基端甲硫氨酸原核生物細胞質中的還原環(huán)境不利于蛋白二硫鍵的形成，而氧化性的周質間隙可以模擬真核細胞的內質網環(huán)境，便于新生肽鏈折疊成天然結構，從而獲得完全生物活性的重組蛋白一些可被細胞內蛋白酶所降解的蛋白在周質中穩(wěn)定性提高第六講真核表達系統(tǒng)※真核表達載體的主要構件：啟動子和增強子、終止信號和poly(A)信號、剪接信號；允許載體在細菌內擴增的序列：復制起始位點和抗藥性標記基因；多克隆位點：插入外源DNA片段用于篩選出外源基因已整合的選擇標記：抗生素抗性基因，如：neo基因：使細胞產生對新霉素衍生物G418的抗性。營養(yǎng)缺陷型基因，如：二氫葉酸還原酶基因、胸苷激酶基因等等顯性活動調控區(qū)(dominantcontrolregion,DCR)序列，克服因載體整合在宿主基因組不同位點而產生的表達水平降低。釀酒酵母作為表達宿主的優(yōu)缺點優(yōu)點： 1、安全無毒、不致病； 2、遺傳背景清楚，易進行遺傳操作；3、培養(yǎng)條件簡單； 4、易進行載體DNA的導入缺點： 1、發(fā)酵時產生乙醇，乙醇的積累會影響酵母本身生長，較難進行高密度發(fā)酵2、蛋白質的分泌能力較差 3、常發(fā)生過度糖基化畢赤酵母表達系統(tǒng)優(yōu)缺點優(yōu)點：(1)高表達：表達載體一般利用醇氧化酶基因（AOX1）的啟動子，功能很強。(2)高分泌：應用啤酒酵母因子的前導序列，有很好的分泌效果，有些蛋白分泌表達可10g/L；(3)高穩(wěn)定：一般用整合型載體YIP，整合于染色體上，構建的轉化子菌株十分穩(wěn)定；(4)糖基化功能較啤酒酵母更接近高等真核生物。缺點：(1)分子生物學研究基礎差，對其進行遺傳改造困難較大;(2)發(fā)酵雖能達高密度，但發(fā)酵周期較長;(3)不是一種食品微生物，發(fā)酵時又要添加甲醇，因為AOX1啟動子是被甲醇調控的，當畢赤酵母以葡萄糖、甘油、乙醇為碳源時，菌體可以生長，但AOX1啟動子是關閉的，當這些碳源耗盡，添加甲醇時，AOX1的mRNA可占總mRNA5%。昆蟲表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點優(yōu)點： 1、插入較大的外源基因，借助多元表達載體可以同時表達多個外源基因；2、表達載體一般使用多角體蛋白或p10等強啟動子，實現蛋白的超高表達，可以達到細胞總蛋白的25～50%；3、能有效地進行蛋白質翻譯的加工，如糖基化、脂酰化和磷酸化；4、桿狀病毒有嚴格的宿主細胞專一性，對脊椎動物和植物即不能感染也不能在非宿主細胞中繁殖或發(fā)生整合，因此十分安全。缺點：1、不能連續(xù)合成重組蛋白，因為昆蟲細胞感染病毒后4～5天后就死亡，無法繼續(xù)表達蛋白；2、多角體蛋白及p10啟動子控制的基因表達是在感染的晚期，所以表達產物的翻譯后加工可能是不完全的；3、費用昂貴，目前培養(yǎng)昆蟲細胞需加胎牛血清，特別是在大規(guī)模懸浮培養(yǎng)時更增加了生產成本。重組病毒獲得：了解大框架第七講 植物基因工程植物基因工程抗體：是利用基因工程技術在植物中表達生產的抗體，即將編碼全抗體或抗體片段的基因導入植物，在植物中表達出具有功能性識別抗原及結合特性的全抗體或部分抗體片段。農桿菌載體系統(tǒng)：農桿菌是一種天然的植物遺傳轉化系統(tǒng)。根癌農桿菌和發(fā)根農桿菌是土壤中的植物病原菌，能感染大多數雙子葉植物的受傷部位，分別誘導冠癭瘤和發(fā)狀根。冠癭瘤和發(fā)狀根分別由根癌農桿菌中的Ti質粒和發(fā)根農桿菌中的Ri質粒引起農桿菌轉化植物體的方法葉盤法：將葉圓片放入農桿菌菌液一段時間，然后轉移到培養(yǎng)基上，使轉化細胞再生植株；整株感染法：用農桿菌感染植株創(chuàng)傷部位，然后無菌培養(yǎng)癌瘤組織，從愈傷組織分化出轉基因植株；共培養(yǎng)法：將原生體（去細胞壁的植物細胞）與農桿菌一起培養(yǎng)，離心去菌，在選擇培養(yǎng)基上得到轉化細胞系，最后再生得到轉基因植株第八講 蛋白質分離純化蛋白質濃度測定：常用的主要有直接紫外吸收法、Bradford法和Lorry法三種凝膠過濾層析（分子篩層析）：凝膠是具有網孔結構的顆粒，當分子大小不同的蛋白質混合液流經凝膠裝成的層析柱時，比凝膠網孔小的蛋白質分子進入網孔內，比凝膠網孔大的蛋白質被排阻在外，當用溶劑洗脫時，大分子先被洗脫，小分子后被洗脫親和層析：是利用蛋白質分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親合力而得以分離純化的技術。原理①親和的一對分子中的一方以共價鍵形式與不溶性載體相連作為吸附劑。②當含有混合組分的樣品通過時，只有與該分子有特異親合力的物質才能被吸附結合，其它沒有親合力的無關組分隨緩沖液流出。③改變緩沖液組分，將結合的親和物洗脫下來離子交換層析：利用離子交換樹脂作為支持物，將帶有不同電荷的蛋白進行分離的方法。分類：陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂。原理：通過帶電的溶質分子與離子交換劑中可交換的離子進行交換而達到分離純化目的。第九講干擾素和白細胞介素干擾素：是由病毒和其他種類的誘導劑，刺激巨噬細胞、淋巴細胞以及體細胞所產生的一組復雜的蛋白質。這類蛋白具有多種生物活性，包括抗增殖、免疫調節(jié)、抗病毒和誘導分化作用。干擾素的生物學活性：抗病毒（I型）：誘導宿主細胞產生抗病毒蛋白，干擾病毒復制；增強NK細胞對病毒感染細胞殺傷；促進MHC-I類分子表達，增強CTL的殺傷能力抗腫瘤（I型和Ⅱ型）：Ⅰ型：抑制腫瘤病毒的繁殖；抑制細胞增生、誘導分化、促進凋亡；增強NK細胞對病毒感染細胞和腫瘤細胞殺傷；Ⅱ型：增強機體免疫機制、加強免疫監(jiān)督功能免疫調節(jié)作用（Ⅱ型）：活化巨噬細胞；促MHC-II類分子表達，提高APC抗原遞呈能力；促MHC-I類分子表達，增強NK和CTL殺傷活性；調節(jié)T細胞和B細胞功能；抑制Th2細胞分化及細胞因子合成白細胞介素（Interleukins，ILs）：是一類由免疫細胞(淋巴細胞、單核巨噬細胞等)和相關細胞(成纖維細胞、內皮細胞等)產生的高活性多功能的低分子量分泌蛋白。白細胞介素的生物活性：免疫調節(jié)活性：IL－2、4、5、7、9、10；炎癥介導活性：IL－1、6、8；刺激造血活性：IL－3、11白介素作用特點：多效性，協(xié)同性，重疊性，拮抗性，迅速性，高效性，非特異性第十講 促紅細胞生成素與集落刺激因子一、※促紅細胞生成素（EPO）產生部位：胎兒和新生兒——EPO主要由肝臟產生；成人——主要由腎臟產生，約占90％。分泌與調節(jié)：健康成人血漿中EPO水平為10-20U/L；EPO分泌受負反饋調節(jié)，當貧血或血氧濃度偏低時分泌增加。不良反應： ①高血壓：初次使用EPO高血壓的發(fā)生率約20%；；EPO糾正貧血后35-45%出現高血壓；35-45% 原來存在的高血壓加重②血管栓塞，腦梗死③高血壓腦?、馨d癇第十一講 治療性抗體工程藥物基因工程抗體（Geneticengineeringantibody,GEAb）：利用DNA重組技術，將編碼鼠和人抗體的基因或其片段進行切割、拼接或修飾，或直接合成基因序列，插入載體后進行表達。嵌合抗體（美羅華）：用人抗體的恒定區(qū)取代小鼠的恒定區(qū)，保留鼠單抗的可變區(qū)，形成人-鼠嵌合抗體。恒定區(qū)人源化人源化抗體（赫賽?。喊咽罂贵w可變區(qū)的CDR序列移植到人抗體的可變區(qū)內，所得到的抗體稱CDR移植抗體或改型抗體，也就是人源化抗體。關鍵：確定影響抗原結合部位的骨架區(qū)氨基酸殘基小分子抗體：Fab、ScFv、dsFv、雙鏈抗體、單域抗體、連接物單鏈可變區(qū)片段ScFv雙鏈抗體：一種雙價特異性抗體片段，含有2個不同的抗原識別模塊能同時識別2種不同抗原決定簇的小分子抗體。通常一種對應腫瘤相關抗原，另一種對應效應成分。完全人抗體：轉基因鼠；轉染色體鼠（鼠體液免疫系統(tǒng)的“人源化”）第十二講 轉基因動物轉基因動物概念：狹義：將外源重組基因轉染并整合到動物受體細胞基因組中，從而形成在體表達外源基因的動物，稱為轉基因動物（Tg）。廣義：通過對動物基因組的改造和修飾，獲得通?？煞N系傳代的遺傳性狀的動物，叫做轉基因動物?！D基因動物的主要技術流程：載體的構建→原核顯微注射/基因打靶→移至假孕鼠→檢測子代小鼠→轉基因小鼠品系建立乳腺生物反應器：指利用動物乳腺特異性啟動子調控元件指導外源基因在乳腺中特異性表達，從轉基因動物乳汁中獲取重組蛋白的一種生物反應器。制備：1、構建表達載體 2、獲取受精卵 3、顯微注射 4、移植到假孕母鼠體內5、轉基因小鼠鑒定 6、轉基因小鼠品系建立第十三講多肽藥物多肽藥物研究開發(fā)的幾個主要方向1、多肽疫苗 2、抗腫瘤 3、抗病毒 4、抗菌肽5、細胞因子模擬肽 6、多肽導向藥物 7、用于心血管疾病的多肽診斷用多肽多肽藥物的生產方法：①動植物組織提?。ㄌ烊换钚远嚯模?②蛋白降解（酸、堿降解或酶解）：大豆肽、海參肽等營養(yǎng)品③化學合成：固相合成法 ④基因重組表達，發(fā)酵生產。第十四章 核酸藥物反義藥物：利用反義技術研制的藥物稱為反義藥物，通常是指反義寡核苷酸。包括反義DNA、反義RNA、核酶等。其DNA或RNA單鏈片段，具有特定基因或其mRNA互補配對的堿基序列，可特異性阻斷基因的表達。反義藥物作用機制： ①AS-OND與靶標RNA雜合后激活RNA酶H，降解mRNA②影響前體mRNA剪切③阻斷蛋白質的翻譯（針對5`帽區(qū)）④作用于polyA位點，影響mRNA穩(wěn)定。⑤反基因作用⑥核酶：具有酶催化活性的RNA分子，可通過堿基配對特異性地與相應的RNA底物結合并將其裂解。錘頭型核酶RNA干擾（RNAi）：是指