四大類微生物菌落形態(tài)的比較和識別

四大類微生物菌落形態(tài)的比較和識別

一、實驗?zāi)康暮蛢?nèi)容

目的：1熟悉四大類微生物菌落的主要特征

2掌握識別四大類微生物菌落形態(tài)的依據(jù)和要點，并應(yīng)用于識別未知菌落

內(nèi)容：1觀察已知的四大類微生物菌落特征

2辨認未知的四大類微生物菌落特征

實驗原理

掌握識別四大類微生物菌落形態(tài)的要點對于從事菌種的篩選、雜菌的識別和菌種鑒定等項工作都有重要意義。

菌落是由某一微生物的少數(shù)細胞或孢子在固體培養(yǎng)基表面繁殖后所形成的子細胞群體，因此，菌落形態(tài)在一定程度上是個體細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)在宏觀上的反映。由于每一大類微生物都有其獨特的細胞形態(tài)，因而其菌落形態(tài)特征也各異。在四大類微生物的菌落中，細菌和酵母菌的形態(tài)較接近，放線菌和霉菌形態(tài)較相似。菌和酵母菌的異同細菌和多數(shù)酵母菌都是單細胞微生物。菌落中各細胞間都充滿毛細管水、養(yǎng)料和某些代謝產(chǎn)物，因此，細菌和酵母菌的菌落形態(tài)具有尖似的特征，如濕潤、較光滑、較透明、易挑起、菌落正反面及邊緣、中央部位的顏色一致，且菌落質(zhì)地較均勻等。它們之間的區(qū)別如下：

細菌：由于細胞小，故形成的菌落也較小，較薄、較透明且有“細膩”感。不同的細菌會產(chǎn)生不同的色素，因此常會出現(xiàn)五顏六色的菌落。此外，有些細菌具有特殊的細胞結(jié)構(gòu)，因此，在菌落形態(tài)上也有所反映，如無鞭毛不能運動的細菌其菌落外形較圓而凸起；有鞭毛能運動的細菌其菌落往往大而扁平，周緣不整齊，而運動能力特強的細菌則出現(xiàn)更大、更扁平的菌落，其邊緣從不規(guī)則、缺刻狀直至出現(xiàn)遷居性的菌落，例如變形桿菌屬和菌種。具有莢膜的細菌其菌落更粘稠、光滑、透明。莢膜較厚的細菌其菌落甚至呈透明的水珠狀。有芽孢的細菌常因其折光率和其他原因而使菌落呈粗糙、不透明、多皺褶等特征。細菌還常因分解含氮有機物而產(chǎn)生臭味，這也有助于菌落的識別。

酵母菌：由于細胞較大（直徑約比細菌大10倍）且不能運動，故其菌落一般比細菌大、厚而且透明度較差。酵母菌產(chǎn)生色素較為單一，通常呈礦蠟色，少數(shù)為橙紅色，個別是黑色。但也有例外，如假絲酵母因形成籍節(jié)狀的假菌絲，故細胞易向外圈蔓延，造成菌落大而扁平和邊緣不整齊等特有形態(tài)。酵母菌因普遍能發(fā)酵含碳有機物而產(chǎn)生醇類，故其菌落常伴有酒香味。

2．放線菌和霉菌的異同

放線菌和霉菌的細胞都是絲狀的，當(dāng)生長于固體培養(yǎng)基上時有營養(yǎng)菌絲（或基內(nèi)菌絲）和氣生菌絲的分化。氣生菌絲向空間生長，菌絲之間無毛細管水，因此菌落外觀呈干燥、不透明的絲狀、絨毛狀或皮革狀等特征。由于營養(yǎng)菌絲伸入培養(yǎng)基中使菌落和培養(yǎng)基連接緊密，故菌絲不易被挑起。由于氣生菌絲、孢子和營養(yǎng)菌絲顏色不同，常使菌落正反面呈不同顏色。絲狀菌是以菌絲頂端延長的方式進行生長的，越近菌落中心的氣生菌絲其生理年齡越大，也越早分化出子實器官或分生孢子，從而反映在菌落顏色上的變化，一般情況下，菌落中心的顏色常比邊緣深。有些菌的氣生菌絲還會分泌出水溶性色素并擴散到培養(yǎng)基中而使培養(yǎng)基變色。有些菌的氣生菌絲在生長后期還會分泌滴，因此，在菌落上出現(xiàn)“水珠”。

放線菌：放線菌屬原核生物，其菌絲纖細，生長較慢，氣生菌絲生長后期逐漸分化出孢子絲，形成大量的孢子，因此菌落較小，表面呈緊密的絨狀或粉狀等特征。由于菌絲伸入培養(yǎng)基中常使菌落邊緣的培養(yǎng)基呈凹狀。不少放線菌還產(chǎn)生特殊的土腥味或冰片味。

霉菌：霉菌屬真核生物，它們的菌絲一般較放線菌粗（幾倍）且長（幾倍至幾十倍），其生長速度比放線菌快，故菌落大而疏松或大而緊密。由于氣生菌絲會形成一定形狀、構(gòu)造和色澤的子實器官，所以菌落表面往往有肉眼可見的構(gòu)造和顏色。

根據(jù)上述特征可將四大類微生物菌落的識別要點歸納如下：

三、實驗材料和用具

已知菌落：細菌類（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌）

酵母（釀酒酵母）

放線菌類（細黃鏈霉菌）

霉菌類（產(chǎn)黃青霉、黑曲霉、黑根霉）

未知菌落

試劑：培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基和高氏1號培養(yǎng)基）

四、操作步驟

1制備已知菌的單菌落

通過平板劃線法獲得細菌、酵母菌和放線菌的單菌落。用三點接種法獲得霉菌的單菌落。細菌平板放37恒溫培養(yǎng)24~48小時。酵母菌平板置28培養(yǎng)2~3天。霉菌和放線菌置28培養(yǎng)5~7天。待長成菌落后，觀察并記錄四大類微生物菌落的形態(tài)特征。

2制備未知菌的菌落特征

從環(huán)境檢測所獲得的平板，挑取若干個菌落，逐個編號，作為識別四大類用的未知菌落。

3辨別未知菌落

區(qū)分“干”或“濕”：根據(jù)菌落是“干”或“濕”及菌落正反面顏色、中央與邊緣顏色是否一致，首先判斷某未知菌落是屬于細菌、酵母菌類，還是屬于放線菌、霉菌類。

細分菌落：根據(jù)上述要點進一步區(qū)分未知菌落是屬于四大類中的哪一類菌，并將判斷結(jié)果填入下表中。結(jié)果記錄（一）菌落形態(tài)特征的描述

1．細菌菌落的描述

菌落表面形態(tài)：有光滑、皺褶、放射狀、根狀等

菌落邊緣形態(tài)：有整齊、波狀、絲狀、鋸齒狀、裂葉狀等形態(tài)

菌落隆起形態(tài)：有扁平、隆起、草帽狀、膠狀等

透明度：可分為秀明、半透明、不透明等

2．酵母菌菌落形態(tài)的描述：可參照細菌

3．放線菌和霉菌菌落的描述：

菌落表面的形態(tài)：粗糙、同心圓、輻射狀溝紋、粉狀、絨毛狀或皮革狀等。

菌落顏色：菌落正面顏色（包括氣生菌絲或孢子顏色）；菌落反面顏色（指營養(yǎng)菌絲顏色）；有否水溶性色素？（色素會滲入培養(yǎng)基中，使菌落周圍的培養(yǎng)基改變顏色）。

（二）將已知菌落形態(tài)的觀察和描述記錄于表1中

（三）將對未知菌落的辨別結(jié)果記錄在表2中

六、注意事項

1每張實驗臺上各有一套已知菌落和未知菌落，觀察時請勿隨意搬動，以免搞混菌號。

2觀察和判斷菌落大小時，要注意單菌落在平板上分布疏密的情況，一般菌落密集處勤菌落小，分布稀少的部位菌落大。

表1

已知菌落形態(tài)的觀察記錄

大

類

菌

名辨別要點

菌

落

描

述

濕

干表面邊緣隆起形狀

顏

色透明度厚薄大小松密大小正面反面水溶性色素細菌大腸桿菌

金黃色葡萄球

菌

枯草

桿菌

酵母菌酵酒

酵母

粘紅

酵母

熱帶

假絲

酵

母

放線菌細黃鏈

霉

菌

霉菌青

霉

曲

霉

根

霉

表2

未知菌落的觀察記錄

菌落號

濕

干

菌

落

描

述

判斷結(jié)果厚或薄大或小松或密大或小表面邊緣隆起形狀

顏

色透明度正面反面水溶性色素

┊

┊

┊

┊

┊

分離的基本方法

微生物分離的方法很多，主要有連續(xù)稀釋分離法，平板劃線分離法和單細胞分離法等方法。其中，單細胞分離法需要貴重精密儀器，中學(xué)無法開展，而連續(xù)稀釋分離法和平板劃線分離法卻簡便易行，中學(xué)完全具備開展條件。現(xiàn)將這兩種方法說明如下。

1.連續(xù)稀釋分離法

①取1克土樣，在火焰旁放入裝有99毫克無菌水的錐形瓶內(nèi)，充分搖勻，將菌分散。

②用移液管吸取上述菌懸液1毫升，放入盛有9毫升無菌水的試管中，并進一步稀釋成1000倍，即10-3的菌懸液。按10倍稀釋法連續(xù)稀釋到10-8（每1次稀釋，都須更換移液管）。

③取3支1毫升移液管分別從10-8、10-7、10-6菌懸液中吸取1毫升菌懸液，分別注入編號10-8、10-7和10-6的培養(yǎng)皿內(nèi)，同一稀釋液重復(fù)做3個培養(yǎng)皿。

④將溫度為45～50℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（其成分和配制方法見本章第三節(jié)）倒入上述各培養(yǎng)皿內(nèi)，輕輕旋轉(zhuǎn)使菌懸液充分混合均勻，凝固后，將培養(yǎng)皿倒扣放置在溫暖處（28℃左右），每天觀察培養(yǎng)基表面有無微生物菌落。

⑤經(jīng)過一定時間培養(yǎng)后，培養(yǎng)基上長出菌落，根據(jù)菌落特征，初步判斷屬于何種類型的微生物，并在顯微鏡下檢查，若菌體形態(tài)一致，則可認為是初步分離到純菌種。

⑥將分離培養(yǎng)所得的純菌種，從平板培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到試管斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

2.平板劃線分離法

①取1克土樣，在火焰旁加進裝有99毫升無菌水的錐形瓶中，堵塞棉塞，制成菌懸液待用。

②取一培養(yǎng)皿置于實驗臺上，左手將培養(yǎng)皿打開稍許，向培養(yǎng)皿內(nèi)注入熔化的營養(yǎng)固體培養(yǎng)基10～12毫升，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使其中的培養(yǎng)基分布均勻，平放桌上，使其凝成平板。然后在皿底用蠟筆劃分A、B、C、D幾個區(qū)。應(yīng)連續(xù)制作幾份平板培養(yǎng)基。

③將培養(yǎng)皿底部用姆指和無名指固定成傾斜狀態(tài)，在火焰旁將培養(yǎng)皿稍微打開。在此同時，用環(huán)狀接種針在火焰旁取少許菌懸液，迅速送入培養(yǎng)皿內(nèi)，在平板培養(yǎng)基的一邊，作第1次平行劃線6～7條，轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿約70°角，用燒過冷卻的接種針，通過第1次劃線部分作第2次平行劃線，然后再用同樣方法，作第3次平行劃線。劃線時，應(yīng)使平板培養(yǎng)基表面向下，以免空氣中雜菌落入。接種針應(yīng)與平板表面成30°角左右。不要使接種針碰到培養(yǎng)皿邊緣，也不要將培養(yǎng)基劃破。

④將劃線后的培養(yǎng)皿倒放在28℃左右的溫暖處進行培養(yǎng)，待長出菌落后，鑒定微生物類群，并根據(jù)鏡檢結(jié)果，判斷是否已分離到了純菌種。如果菌種很純，則可轉(zhuǎn)移到斜面培養(yǎng)基上進一步培養(yǎng)。

連續(xù)稀釋分離法和平板劃線法，均須在無菌室或接種箱內(nèi)進行。

二、各類微生物的分離

1.從土壤中分離好氣性及兼性厭氣細菌

其分離方法見本節(jié)“分離的基本方法”

2.從土壤中分離放線菌

①制作高氏一號培養(yǎng)基，趁熱注入培養(yǎng)皿中，凝成平板，待用。

②稱取土壤10克，放入裝有100毫升無菌水的錐形瓶中，并加入10%酚10滴，以抑制細菌生長。振蕩10分鐘，制成10-1菌懸液。按照連續(xù)稀釋分離法，進一步制成10-3菌懸液。

③用移液管吸取0.1毫升10-3菌懸液，注入平板培養(yǎng)基上，用無菌玻璃刮刀將菌懸液均勻涂抹在整個培養(yǎng)基上。然后將培養(yǎng)皿倒置于25～30℃溫箱中，培養(yǎng)7～10天，培養(yǎng)基上會出現(xiàn)微生物菌落。如果菌落的硬度較大，干燥致密，且與基質(zhì)緊密結(jié)合，不易被針挑起，這就是放線菌菌落。

④挑取放線菌菌落，接種于斜面培養(yǎng)基上。

3.從土壤中分離霉菌

①制作豆芽汗葡萄糖培養(yǎng)基，并添加80%乳酸數(shù)滴，以抑制細菌生長。將培養(yǎng)皿中，凝成平板，待用。

②稱取10克土壤，按上述分離放線菌的方法制成10-4或10-5的菌懸液。

③取0.1毫升菌懸液注入培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)基上，用玻璃刮刀涂抹均勻。然后將培養(yǎng)皿倒置于25～30℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)3～4天。培養(yǎng)基上會出現(xiàn)微生物菌落。霉菌菌落常長成絨狀、棉絮狀或蜘蛛網(wǎng)狀，可根據(jù)這一特征尋找霉菌菌落。

④挑取培養(yǎng)皿內(nèi)的霉菌菌落接種于斜面培養(yǎng)基上。

4.從飲水中分離大腸桿菌

①制作伊紅美藍培養(yǎng)基，趁熱注入培養(yǎng)皿中，凝成平板，待用。

②用滅過菌的錐形瓶盛取河水或溝水，按1：10稀釋。

③取0.1毫升稀釋液接種于伊紅美藍培養(yǎng)基上。用平板劃線分離法進行分離。

④將劃線后的培養(yǎng)皿倒置37℃溫箱中培養(yǎng)18～24小時。培養(yǎng)基中會出現(xiàn)大腸桿菌菌落，菌落中心呈暗藍黑色，發(fā)金屬光澤。

⑤將菌落接種于斜面培養(yǎng)基上（由營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基制成）。一、平板劃線分離法

由接種環(huán)以菌操作沾取少許待分離的材料，在無菌平板表面進行平行劃線、扇形劃線或其他形式的連續(xù)劃線，微生物細胞數(shù)量將隨著劃線次數(shù)的增加而減少，并逐步分散開來，如果劃線適宜的話，微生物能一一分散，經(jīng)培養(yǎng)后，可在平板表面得到單菌落。

二、稀釋倒平板法

先將待分離的材料用無菌水作一系列的稀釋（如1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000…），然后分別取不同稀釋液少許，與已溶化并冷卻至45℃左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，搖勻后，傾入滅過菌的培養(yǎng)皿中，待瓊脂凝固后，制成可能含菌的瓊脂平板，保溫培養(yǎng)一定時間即可出出菌落。如果稀釋得當(dāng)，在平板表面或瓊脂培養(yǎng)基中就可出現(xiàn)分散的單個菌落，這個菌落可能就是由一個細菌細胞繁殖形成的。隨后挑取該單個菌落，或重復(fù)以上操作數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)。

稀釋涂布法：

優(yōu)點：可以計數(shù)，可以觀察菌落特征。

缺點：吸收量較少，較麻煩，平板不干燥效果不好，容易蔓延。

一般用于平板培養(yǎng)基的回收率計數(shù)！！

稀釋混合平板法：

優(yōu)點：可以計數(shù)，吸收量為1ml，較方便。

優(yōu)點：不能觀察菌落特征。

一般用于菌落總數(shù)的計數(shù)?。?/p>

平板劃線法：

優(yōu)點：可以觀察菌落特征，對混合菌進行分離！！

缺點：不能計數(shù)

一般用于從菌種的分純！

涂布法使用較多，但有時不均勻稀釋倒平板法操作相對麻煩，不適合好氧和對熱敏感的細菌培養(yǎng)應(yīng)用范圍：涂布法適用于

好氧菌

稀釋倒平板法適用于厭氧，兼性厭氧菌種的分離取lmL鹵汁以10倍遞增稀釋方法（一份酸奶，九份無菌水，再取一份第一只管中溶液，加九份無菌水，依次類推），將其稀釋至1/10～10的-10次冪（我打不上去），然后從不同濃度稀

釋液中分別取lmL傾注在平皿中，再倒入培養(yǎng)基相混合，待培養(yǎng)基凝固后倒置于30~C恒溫下

培養(yǎng)48h。挑取長勢良好的單個茵落劃線分純，直至純化(茵落單個大小一致，革蘭氏染色鏡

檢，茵體一致)。結(jié)果分離得到3株不同菌株，分別編號為菌株1、菌株2、菌株3。再分別轉(zhuǎn)移

到試管斜面上進行保存。

分離用培養(yǎng)基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，蒸餾水1000mL，瓊脂20g，pH7．0—7．2

；保存用斜面培養(yǎng)基：酵母膏1％，碳酸鈣2％，葡萄糖1％，瓊脂2％，pH7．0。

培養(yǎng)條件

將分離出的菌株1、菌株2、菌株3分別接種在上述4種不同的培養(yǎng)基上，

在30?！?恒溫條件下培養(yǎng)48h后觀察并測定其培養(yǎng)結(jié)果。

測定方法菌落總數(shù)采用逐級稀釋法來計數(shù)；pH值用pHS一2C酸度計測定；乳酸定性

及含量測定依據(jù)食品檢驗技術(shù)

1I．2．1乳酸菌的分離與篩選的試驗程序自然發(fā)酵酸奶---稀釋---培養(yǎng)---挑起單菌落染色、鏡檢一挑

選革蘭氏陽性球菌單菌落一Ⅲ號培養(yǎng)基一挑選溶鈣圈大的球菌反復(fù)在Ⅲ號培養(yǎng)基上幾次純化篩選一單菌落優(yōu)

良菌株一試管穿刺低溫保存。

1．21．2乳酸菌的鑒定用光學(xué)顯微鏡、放大鏡進行乳酸菌的形態(tài)特征鑒定。生理生化特征鑒定：產(chǎn)乳

酸定性試驗——乳酸紙層析法0-、過氧化氫酶(接觸酶)反應(yīng)?、明膠水解反應(yīng)、硫化氫反應(yīng)、乳酸菌

發(fā)酵營養(yǎng)型試驗0、耐鹽、酸、溫度試驗。

1．2．I．3乳酸菌的保存?采用定期移植低溫保藏法。培養(yǎng)基配方：葡萄糖1％、蛋白胨02％、

l(}l2PQ|0．2％、瓊脂20％、pH值70，分裝試管，121。c滅菌30min。將使用對數(shù)生長期后期的細胞進行穿刺

培養(yǎng)，然后密封存于冰箱玲藏室內(nèi)(5qc左右)，2個月移植1次。

1．2．2分離乳酸菌的生理特點試驗

122．1最適生長溫度的測定OD值以同溫下不接種培養(yǎng)基作對照，定期取出接種培養(yǎng)基在721分光光度

計上，用最大吸收光波長=6001RIifl測定。

1．2．2．2生長周期的測定oD值(方法同上)；pH值：PHB一4pH計；可滴定酸(以乳酸計)：吸取ImL菌液

加入9Ⅱ1L蒸餾水，加入1～2滴酚酞，用0．1NNaOH滴定。

1．22．3最適pH值的測試、最適鹽濃度的測試。

供試樣品及培養(yǎng)基

分離用樣品：酸奶、酸奶及西紅柿均為市售

分離用培養(yǎng)基：①BCP培養(yǎng)基：酵母膏25g，蛋白胨5g，葡萄糖5g，溴甲酚紫004g，瓊脂15g，

蒸槽水lO00ml，pH70；②MRS培養(yǎng)基見文獻。

菌種保藏用培養(yǎng)基：脫脂乳培養(yǎng)基：新鮮牛乳離心去掉上層乳脂，下層奶液分裝試管，105℃

滅菌20mln。

菌利鑒定用培養(yǎng)基見文獻6。

12方法

121乳酸菌的分離純化取泡菜汁、酸奶、西紅柿表面洗液進行梯度稀釋，分別用傾注法、涂布

法和劃線法在BCP和MRS培養(yǎng)基平板上進行菌種分離。挑取在BCP平板上有透明目的菌落，在

MRS平扳上有溶鈣圈的菌落，反復(fù)純化至純種，挑菌至脫脂牛奶試管中保存

1．22乳酸菌復(fù)篩對初篩菌株進行革蘭氏染色，保留革蘭氏陽性菌株．并對其所產(chǎn)乳酸能力進

行定性、定量分析，篩選出產(chǎn)酸高的菌株保存，再把產(chǎn)酸高的菌株經(jīng)蘿l、汁發(fā)酵】，進一步選擇產(chǎn)

酸高、_l】味純正的菌株保存鑒定

123乳酸定性測定果用紙層析法。溶劑系統(tǒng)為乙醇：濃氨水：水=80：5：15，顯色劑為004％

的溴甲酚紫酒精溶液。層析時將乳酸、檸檬酸配成1％的標(biāo)準(zhǔn)溶液，兩種標(biāo)準(zhǔn)溶液及乳酸發(fā)酵液

均點樣3．上行層析，顯色與標(biāo)準(zhǔn)樣比較

1．24乳酸的定量測定采用氣相色譜法，利用芐酯化法制備乳酸衍生物，將待測乳酸菌株在產(chǎn)

酸培養(yǎng)基內(nèi)37"C培養(yǎng)3d，離心。取上清液剃備衍生物，氣相色譜分析含量。氣相色譜工作條件為：

EGS色譜柱，柱溫160'C，氣化溫度180'17．，檢測器溫度l70"C，載氣為N，。

1．25菌種鑒定根據(jù)《簡明第八版伯杰細菌鑒定手冊》和《一般細菌常用鑒定手冊》[6對復(fù)篩

出的菌株的形態(tài)、生理生化、碳源利用等方面進行系統(tǒng)鑒定，并提取乳酸菌株DNA，采用熔鏈溫度.、固體培養(yǎng)基分離

1、稀釋倒平板

特點：菌落分離較為均勻，進行微生物計數(shù)結(jié)果相對準(zhǔn)確。但操作相對麻煩，熱敏感菌有時易被燙死，而嚴格好氧菌也可能因被固定在培養(yǎng)基中生長受到影響。

2、涂布平板法

特點：操作相對簡單，是較常使用的常規(guī)方法。但有時會因涂布不均勻使某些部位的菌落不能分開，進行微生物計數(shù)時需對稀釋和涂布過程的操作特別注意，否則不易得到準(zhǔn)確的結(jié)果。

3、平板劃線法

特點：操作簡單，多用于對已有純培養(yǎng)的確認和再次分離。

應(yīng)用：這三種方法可用于所有能在固體培養(yǎng)基表面形成菌落的微生物的純培養(yǎng)分離。并且，通過選用適當(dāng)?shù)倪x擇平板及培養(yǎng)條件，可直接分離各種具有特定生理特征的微生物。和厭氧罐或厭氧手套箱技術(shù)結(jié)合，這3種方法也可用于獲得各種厭氧菌的純培養(yǎng)。

4、稀釋搖管法

特點：稀釋倒平板法的一種變通形式，但由于菌落形成在瓊脂柱的中間，觀察和挑取都相對困難。

應(yīng)用：在缺乏專業(yè)的厭氧操作設(shè)備的情況下對嚴格厭氧菌進行分離和觀察。

二、液體培養(yǎng)基分離

1、稀釋法

特點：工作量大，是否獲得純培養(yǎng)需依靠統(tǒng)計學(xué)的推測。

應(yīng)用：不能或不易在固體培養(yǎng)基上生長的微生物進行純培養(yǎng)分離或數(shù)量統(tǒng)計。

2、富集培養(yǎng)

特點：一般不能直接獲得微生物的純培養(yǎng)，在通過富集培養(yǎng)使原本在自然環(huán)境中占少數(shù)的微生物的數(shù)量大大提高后，需再通過平板法進行相應(yīng)微生物純培養(yǎng)的分離和檢測。

應(yīng)用：

（1）根據(jù)某種微生物的特殊生長要求，按照意愿從自然界中對這種微生物進行有針對性的有效分離；

（2）分離培養(yǎng)出由科學(xué)家設(shè)計的特定環(huán)境中能生長的微生物，盡管我們并不知道什么微生物能在這種特定的環(huán)境中生長。

三、顯微操作

單細胞（孢子）挑取

特點：分離過程直觀，可靠，但對儀器和操作技術(shù)要求較高，多限于高度專業(yè)化的科學(xué)研究。而挑取的微生物單細胞或孢子需經(jīng)固體或液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后才能獲得其純培養(yǎng)物。

應(yīng)用：從樣品中直接分離所需的微生物細胞或孢子，獲得其純培養(yǎng)。分離純化米曲霉米曲霉菌種里感染了黃曲霉,怎么將米曲霉分離純化出來?具體方法是什么?怎么檢測純化完全了?

如果你愿意將你的答案告訴我,請你詳細點,謝謝！實在不行只有從頭開始了。從劃線培養(yǎng)開始吧。

單菌落的挑取在10倍系列稀釋的平板中進行，選取菌落數(shù)在30～300之間的平板，劃線純化方法如下：

對低于30個左右菌落的平板，每個菌落均挑取，劃線純化。

對50個左右菌落的平板，挑取1/2菌落劃線純化。

對100個左右菌落的平板，挑取特殊的菌落純化。

反復(fù)劃線純化，至菌落形態(tài)和菌株形態(tài)分別完全一致，可認為是純菌株。

優(yōu)勢菌的挑取在浸海2h～14d掛片系列稀釋培養(yǎng)平板中進行，挑取1～2株優(yōu)勢菌落形態(tài)的菌株于2216E平板上劃線純化。

在純化的菌株中加入適量甘油，保存于-80℃\o"超低溫冰箱"超低溫冰箱中和-23℃冰箱中。

菌株鑒定

細菌鑒定按照《一般細菌常用鑒定方法》進行，將挑取純化的菌株鑒定至屬。鑒定試驗包括形態(tài)觀察、革蘭氏染色、鞭毛染色、氧化酶反應(yīng)、過氧化氫酶反應(yīng)、運動性試驗、葡萄糖氧化發(fā)酵試驗、硫化氫試驗、0/129試驗、吲哚產(chǎn)生試驗、色素產(chǎn)生試驗及發(fā)光現(xiàn)象觀察等項目，參照J.D.Oliver海洋細菌鑒定表，將附著細菌分類至屬。采用硫酸銨沉降法分離純化米曲霉M3所產(chǎn)中性蛋白酶,并對其酶學(xué)性質(zhì)進行了研究.結(jié)果表明:用硫酸銨沉降法所得粗酶粉的酶活力高達159781.1u/g;該酶的最適反應(yīng)溫度為50℃,最適作用pH值為7.5;該酶在30～40℃時具有良好的熱穩(wěn)定性,在pH值6.5～7.5的條件下酶是穩(wěn)定的;NH14,K1對該蛋白酶有明顯的激活作用,Fe3則對其表現(xiàn)出強烈的抑制作用.菌種的分離取lmL鹵汁以10倍遞增稀釋方法（一份酸奶，九份無菌水，再取一份第一只管中溶液，加九份無菌水，依次類推），將其稀釋至1/10～10的-10次冪（我打不上去），然后從不同濃度稀

釋液中分別取lmL傾注在平皿中，再倒入培養(yǎng)基相混合，待培養(yǎng)基凝固后倒置于30~C恒溫下

培養(yǎng)48h。挑取長勢良好的單個茵落劃線分純，直至純化(茵落單個大小一致，革蘭氏染色鏡

檢，茵體一致)。結(jié)果分離得到3株不同菌株，分別編號為菌株1、菌株2、菌株3。再分別轉(zhuǎn)移

到試管斜面上進行保存。

分離用培養(yǎng)基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，蒸餾水1000mL，瓊脂20g，pH7．0—7．2

；保存用斜面培養(yǎng)基：酵母膏1％，碳酸鈣2％，葡萄糖1％，瓊脂2％，pH7．0。

培養(yǎng)條件

將分離出的菌株1、菌株2、菌株3分別接種在上述4種不同的培養(yǎng)基上，

在30?！?恒溫條件下培養(yǎng)48h后觀察并測定其培養(yǎng)結(jié)果。

測定方法菌落總數(shù)采用逐級稀釋法來計數(shù)；pH值用pHS一2C酸度計測定；乳酸定性

及含量測定依據(jù)食品檢驗技術(shù)

1I．2．1乳酸菌的分離與篩選的試驗程序自然發(fā)酵酸奶---稀釋---培養(yǎng)---挑起單菌落染色、鏡檢一挑

選革蘭氏陽性球菌單菌落一Ⅲ號培養(yǎng)基一挑選溶鈣圈大的球菌反復(fù)在Ⅲ號培養(yǎng)基上幾次純化篩選一單菌落優(yōu)

良菌株一試管穿刺低溫保存。

1．21．2乳酸菌的鑒定用光學(xué)顯微鏡、放大鏡進行乳酸菌的形態(tài)特征鑒定。生理生化特征鑒定：產(chǎn)乳

酸定性試驗——乳酸紙層析法0-、過氧化氫酶(接觸酶)反應(yīng)?、明膠水解反應(yīng)、硫化氫反應(yīng)、乳酸菌

發(fā)酵營養(yǎng)型試驗0、耐鹽、酸、溫度試驗。

1．2．I．3乳酸菌的保存?采用定期移植低溫保藏法。培養(yǎng)基配方：葡萄糖1％、蛋白胨02％、

l(}l2PQ|0．2％、瓊脂20％、pH值70，分裝試管，121。c滅菌30min。將使用對數(shù)生長期后期的細胞進行穿刺

培養(yǎng)，然后密封存于冰箱玲藏室內(nèi)(5qc左右)，2個月移植1次。

1．2．2分離乳酸菌的生理特點試驗

122．1最適生長溫度的測定OD值以同溫下不接種培養(yǎng)基作對照，定期取出接種培養(yǎng)基在721分光光度

計上，用最大吸收光波長=6001RIifl測定。

1．2．2．2生長周期的測定oD值(方法同上)；pH值：PHB一4pH計；可滴定酸(以乳酸計)：吸取ImL菌液

加入9Ⅱ1L蒸餾水，加入1～2滴酚酞，用0．1NNaOH滴定。

1．22．3最適pH值的測試、最適鹽濃度的測試。

供試樣品及培養(yǎng)基

分離用樣品：酸奶、酸奶及西紅柿均為市售

分離用培養(yǎng)基：①BCP培養(yǎng)基：酵母膏25g，蛋白胨5g，葡萄糖5g，溴甲酚紫004g，瓊脂15g，

蒸槽水lO00ml，pH70；②MRS培養(yǎng)基見文獻。

菌種保藏用培養(yǎng)基：脫脂乳培養(yǎng)基：新鮮牛乳離心去掉上層HYPERLINK"/z/Se