煙草中三種農(nóng)藥的測(cè)定方法(修改稿)

權(quán)利要求書1、一種煙草及煙草制品中三種酰胺類除草劑的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的測(cè)定方法，即甲草胺、異丙甲草胺和敵草胺三種除草劑，其特征在于：該方法是通過(guò)基質(zhì)分散固相萃取法萃取除草劑農(nóng)藥殘留，以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜直接測(cè)定煙草及煙草制品中的農(nóng)藥殘留量，具體方法如下：a、樣品的提取：準(zhǔn)確稱取2g樣品（精確至0.01g）于50mL具蓋離心管中，加入10mL水，振蕩直至樣品被水充分浸潤(rùn)；靜置10min后移取10mL乙腈和50L內(nèi)標(biāo)（氯唑磷，20g/mL）至離心管中，然后將離心管置于渦漩混合振蕩儀上，以2000rpm速率振蕩1min。將離心管置于0℃b、樣品凈化：移取上清液1.0mL于1.5mL離心管中，加入AgilentQuEChERS2mL分散固相萃取試劑盒，于漩渦混合振蕩儀上以2000rpm速率振蕩2min，以6000rpm速率離心2min；吸取上清液經(jīng)0.22m有機(jī)相濾膜過(guò)濾，移取200L，用乙腈稀釋至1.0mL，用LC-MS/MS檢測(cè)；c、內(nèi)標(biāo)溶液的配制：用氯唑磷做內(nèi)標(biāo)，配制氯唑磷濃度約為20g/mL的甲醇溶液；d、基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液制備：配制具有濃度梯度的且含有內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；e、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定:吸取以上配制好的不同濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀；f、農(nóng)藥殘留量測(cè)定結(jié)果的計(jì)算以內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行殘留量的定量分析，即以農(nóng)藥和內(nèi)標(biāo)的定量離子對(duì)峰面積比對(duì)其相應(yīng)濃度進(jìn)行回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)大于等于0.999,對(duì)提取后的樣品進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得檢出農(nóng)藥和內(nèi)標(biāo)的定量離子對(duì)峰面積比，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得樣品中的各種農(nóng)藥的殘留量。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于：標(biāo)準(zhǔn)工作溶液制備具體如下：分別稱取10mg三種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成每種農(nóng)藥的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；移取一定量各農(nóng)藥的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度配得混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；分別移取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液25L,50L,100L,250L,500L及1000L到6個(gè)10mL容量瓶中，并加入50L內(nèi)標(biāo)（氯唑磷，20g/mL）用乙腈定容，制得標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；然后分別移取上述標(biāo)準(zhǔn)工作溶液200L與200L的空白樣品提取溶液混合，并用乙腈稀釋至1.0mL，配制成基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于：標(biāo)準(zhǔn)工作溶液制備具體如下：采用的液相色譜條件為：色譜柱：AtiantisdC18(150mm×2.1mm，3m,美國(guó)Waters公司)；流動(dòng)相：乙腈-水（0.1%甲酸)，梯度洗脫；流速：0.2mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10L；采用的質(zhì)譜條件：掃描方式：正離子掃描;電噴霧離子源(ESI);霧化氣流量為60psi;氣簾氣流量18psi;輔助加熱氣流量為60psi;離子化溫度500℃;碰撞氣流量為10psi;4種氣體均為氮?dú)?停留時(shí)間為100msec;電離電壓5500V,PAGEPAGE8說(shuō)明書摘要本發(fā)明涉及一種煙草及煙草制品中三種酰胺類除草劑的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的測(cè)定方法，即甲草胺、異丙甲草胺和敵草胺三種除草劑，屬于煙草及煙草制品中農(nóng)藥殘留的理化檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，其特征在于：該方法是通過(guò)基質(zhì)分散固相萃取法萃取農(nóng)藥殘留，以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜直接測(cè)定煙草及煙草制品中農(nóng)藥殘留量的方法。本發(fā)明的方法克服了現(xiàn)有技術(shù)樣品處理方法的不足，針對(duì)煙草樣品優(yōu)化了樣品前處理方法和儀器檢測(cè)條件，與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明方法具有如下優(yōu)良效果：本發(fā)明方法樣品前處理過(guò)程簡(jiǎn)單、快速，可減少煙草中色素等雜質(zhì)的干擾,并具有操作準(zhǔn)確、靈敏度高及重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。說(shuō)明書煙草及煙草制品中三種酰胺類除草劑的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的測(cè)定方法技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明屬于煙草及煙草制品中農(nóng)藥殘留的理化檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及煙草及煙草制品中酰胺類除草劑殘留量的測(cè)定技術(shù)，具體說(shuō)是用乙腈對(duì)樣品進(jìn)行浸提，再加入無(wú)水硫酸鎂與氯化鈉等振蕩促使其分層，隨后進(jìn)行分散固相萃取，以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜直接測(cè)定煙草及煙草制品中三種酰胺類除草劑殘留量的方法。背景技術(shù)酰胺類除草劑是20世紀(jì)60年代開發(fā)的一類高效、高選擇性的觸殺型除草劑。它對(duì)多種禾本科雙子葉植物具有強(qiáng)烈的殺毒作用,主要用于防除一年生禾本科雜草幼芽。大鼠體內(nèi)試驗(yàn)表明,酰胺類除草劑可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成有致癌作用的二烷基醌亞胺,因此其殘留情況受到廣泛關(guān)注。文獻(xiàn)報(bào)道有關(guān)此類除草劑殘留檢測(cè)分析較多,主要有氣相色譜-氮磷檢測(cè)器(GC-NPD)法、氣相色譜-電子捕獲檢測(cè)器(GC-ECD)法、氣相色譜-質(zhì)譜法、高效液相色譜法等。YC/T179-2004【中華人民共和國(guó)煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T179-2004煙草及煙草制品酰胺類除草劑農(nóng)藥殘留量的測(cè)定】使用GC-NPD檢測(cè),目前NPD是檢測(cè)氮磷化合物靈敏度較高的檢測(cè)器,而NPD對(duì)含氮化合物的響應(yīng)與其分子結(jié)構(gòu)有關(guān),對(duì)胺類特別是酰胺類響應(yīng)小。煙葉含氮物質(zhì)極多,很難完全凈化干凈,容易造成假陽(yáng)性。而且NPD存在隨使用時(shí)間增長(zhǎng)性能變差的缺點(diǎn),影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性。師君麗等【分析實(shí)驗(yàn)室，煙草中酰胺類除草劑殘留的GC-MS檢測(cè)，29增刊：2010，5】將煙草樣品用乙腈提取，弗羅里硅土固相萃取柱凈化，然后利用GC-MS檢測(cè)了煙草中的異丙甲草胺、草乃敵和敵草胺三種除草劑。但是該方法需要消耗大量溶劑，而且該方法操作繁瑣，費(fèi)時(shí)。LC-MS/MS具有較高的靈敏度和較強(qiáng)的專屬性，不需要使分析物之間實(shí)現(xiàn)完全的色譜分離，使得樣品預(yù)處理過(guò)程簡(jiǎn)化，同時(shí)分析測(cè)試時(shí)間大為縮短?？梢詫?shí)現(xiàn)對(duì)多類型多殘留的同時(shí)分析。發(fā)明內(nèi)容：本發(fā)明的目的旨在克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種采用基質(zhì)分散固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定煙草及煙草制品中酰胺類除草劑殘留量的測(cè)定方法，該方法能快速、準(zhǔn)確檢測(cè)煙草及煙草制品中酰胺類除草劑殘留量，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、測(cè)定干擾少。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：煙草及煙草制品中三種酰胺類（即甲草胺、異丙甲草胺和敵草胺）除草劑的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的測(cè)定方法，是通過(guò)基質(zhì)分散固相萃取法萃取除草劑農(nóng)藥殘留，以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜直接測(cè)定煙草及煙草制品中的農(nóng)藥殘留量，具體方法如下：a、樣品的提?。簻?zhǔn)確稱取2g樣品（精確至0.01g）于50mL具蓋離心管中，加入10mL水，振蕩直至樣品被水充分浸潤(rùn)。靜置10min后移取10mL乙腈和50L內(nèi)標(biāo)（氯唑磷，20g/mL）至離心管中，然后將離心管置于渦漩混合振蕩儀上，以2000rpm速率振蕩1min。將離心管置于0℃b、樣品凈化：移取上清液1.0mL于1.5mL離心管中，加入AgilentQuEChERS2mL分散固相萃取試劑盒（Agilent5982-5321），于漩渦混合振蕩儀上以2000rpm速率振蕩2min，以6000rpm速率離心2min。吸取上清液經(jīng)0.22m有機(jī)相濾膜過(guò)濾，移取200L，用乙腈稀釋至1.0mL，用LC-MS/MS檢測(cè)；c、內(nèi)標(biāo)溶液的配制：由于氯唑磷已不在煙草中使用了,所以用氯唑磷做內(nèi)標(biāo)。配制氯唑磷濃度約為20g/mL的甲醇溶液；d、基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液制備：配制具有濃度梯度的且含有內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；e、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定:吸取以上配制好的不同濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀；f、農(nóng)藥殘留量測(cè)定結(jié)果的計(jì)算以內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行殘留量的定量分析，即以農(nóng)藥和內(nèi)標(biāo)的定量離子對(duì)峰面積比對(duì)其相應(yīng)濃度進(jìn)行回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)大于等于0.999,對(duì)提取后的樣品進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得檢出農(nóng)藥和內(nèi)標(biāo)的定量離子對(duì)峰面積比，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得樣品中的各種農(nóng)藥的殘留量。本發(fā)明基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制方式如下：分別稱取10mg三種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成每種農(nóng)藥的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；移取一定量各農(nóng)藥的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度配得混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；分別移取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液25L,50L,100L,250L,500L及1000L到6個(gè)10mL容量瓶中，并加入50L內(nèi)標(biāo)（氯唑磷，20g/mL）用乙腈定容，制得標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；然后分別移取上述標(biāo)準(zhǔn)工作溶液200L與200L的空白樣品提取溶液混合，并用乙腈稀釋至1.0mL，配制成基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。在液質(zhì)聯(lián)用測(cè)定時(shí)，采用的液相色譜條件為：色譜柱：AtiantisdC18(150mm×2.1mm，3m,美國(guó)Waters公司)；流動(dòng)相：乙腈-水（0.1%甲酸)，梯度洗脫程序表見(jiàn)表1；流速：0.2mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10L；采用的質(zhì)譜條件：掃描方式：正離子掃描;電噴霧離子源(ESI);霧化氣流量為60psi;氣簾氣流量18psi;輔助加熱氣流量為60psi;離子化溫度500℃;碰撞氣流量為10psi;4種氣體均為氮?dú)?停留時(shí)間為100msec;電離電壓5500V,MRM模式采集，表1流動(dòng)相梯度洗脫條件時(shí)間/min流速/(L/min)水(0.1%甲酸)/%乙腈/%0.0020050502.00200208010.00200208011.00200505020.002005050表2三種除草劑及內(nèi)標(biāo)物質(zhì)監(jiān)測(cè)離子對(duì)、去簇電壓及碰撞能量序號(hào)中文名稱英文名稱定量離子定性離子去簇電壓(V)碰撞能量(V)甲草胺Alachlor270.3/238.1270.3/162.470；7015；25異丙甲草胺metolachlor283.3/252.3283.3/176.470;7020;35敵草胺napropamide272.1/129.1272.1/199.275;7522;20內(nèi)標(biāo)氯唑磷Isazophos314.0/120.0314.0/162.137;3722.5;22本發(fā)明的方法克服了現(xiàn)有技術(shù)樣品處理方法的不足，針對(duì)煙草樣品優(yōu)化了樣品前處理方法和儀器檢測(cè)條件。與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明方法具有如下優(yōu)良效果：⑴本發(fā)明方法樣品前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，大大縮短了每個(gè)煙草樣品的萃取前處理時(shí)間。本發(fā)明方法將煙末用乙腈進(jìn)行浸提，再加無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉等促使其分層，最后取萃取液進(jìn)行分散固相萃取。該方法提高萃取效率，又能對(duì)煙草中的色素及煙草植物組織的其他共萃物（脂肪酸、葉綠素等）起到較好的吸附凈化作用，避免了樣品濃縮、凈化、衍生等過(guò)程造成的待測(cè)農(nóng)藥組分損失，又使實(shí)驗(yàn)操作更加簡(jiǎn)單、快捷。（2）本發(fā)明方法具有操作準(zhǔn)確、靈敏度高及重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明方法的檢測(cè)限：將不同濃度的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液注入LC-MS/MS，以3倍信噪比（S/N=3）計(jì)算檢測(cè)限（LOD），檢測(cè)限在0.002g/g-0.005g/g之間。本發(fā)明方法的重復(fù)性和加標(biāo)回收率：在煙草樣品中加入混合農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后進(jìn)行前處理和LC－MS/MS分析，并按照加標(biāo)量和測(cè)定值計(jì)算其回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可以看出，各種除草劑的回收率均大于95%，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于6.0%，說(shuō)明本發(fā)明方法的回收率高，重復(fù)性好。表3三種除草劑的回收率和重復(fù)性（n=5）序號(hào)中文名稱英文名稱保留時(shí)間（min）相關(guān)系數(shù)LOD(μg/g)回收率(%)RSD(%)甲草胺Alachlor7.010.99980.00299.61.3異丙甲草胺metolachlor12.450.99510.00498.52.9敵草胺napropamide15.210.99960.005101.35.2附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明的測(cè)定方法流程圖（該圖作為摘要附圖）。具體實(shí)施方式本發(fā)明以下結(jié)合實(shí)例做進(jìn)一步描述，但并不是限制本發(fā)明。實(shí)例1：1．儀器與試劑：三種農(nóng)藥均為標(biāo)準(zhǔn)品；乙腈、甲酸均為農(nóng)殘級(jí)。API4000四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀；渦旋振蕩儀(美國(guó)Labnet公司)；Sigma3-30K離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；AE163電子天平（感量：0.0001g）和AE166電子天平（感量：0.01g）（瑞士Mettler公司）。2．樣品處理：準(zhǔn)確稱取2g樣品（精確至0.01g）于50mL具蓋離心管中，加入10mL水，振蕩直至樣品被水充分浸潤(rùn)。靜置10min后加入10mL乙腈和50L內(nèi)標(biāo)（氯唑磷，20g/mL）至離心管中，然后將離心管置于渦漩混合振蕩儀上，以2000rpm速率振蕩1min。將離心管置于0℃移取上清液1.0mL于1.5mL離心管中，加入AgilentQuEChERS2mL分散固相萃取試劑盒（Agilent5982-5321），于漩渦混合振蕩儀上以2000rpm速率振蕩2min，以6000rpm速率離心2min。吸取上清液經(jīng)0.22m有機(jī)相濾膜過(guò)濾，移取200L，用乙腈稀釋至1.0mL，用LC-MS/MS檢測(cè)。3.準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別稱取10mg三種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成每種農(nóng)藥的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；移取一定量各農(nóng)藥的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度配得混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；分別移取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液25L,50L,100L,250L,500L及1000L到6個(gè)10mL容量瓶中，并加入50L內(nèi)標(biāo)（氯唑磷，20g/mL）用乙腈定容，制得標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；然后分別移取上述標(biāo)準(zhǔn)工作溶液200L與200L的空白樣品提取溶液混合，并用乙腈稀釋至1.0mL，配制成基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。4.測(cè)定方法:將配制好的不同濃度的農(nóng)藥基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液注入LC-MS/MS，以內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行殘留量的定量分析，即以農(nóng)