高效液相色譜法(11)教學(xué)課件

高效液相色譜法(11)幻燈片PPT本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請(qǐng)自行刪除，謝謝！本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請(qǐng)自行刪除，謝謝！本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請(qǐng)自行刪除，謝謝！本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請(qǐng)自行刪除，謝謝！高效液相色譜法(11)幻燈片PPT本課件PPT僅供大主要內(nèi)容11-1概述11-2基本理論11-3高效液相色譜分離方法11-4高效液相色譜儀11-5高效液相色譜應(yīng)用主要內(nèi)容11-1概述§11-1概述高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法經(jīng)典液相柱色譜裝置高效液相色譜儀經(jīng)典液相色譜HPLC固定相粒徑流動(dòng)相驅(qū)動(dòng)方式流動(dòng)相流速150-200μm重力或低壓泵很慢3-10μm高壓泵快(1-10mL/min)例：分離20種氨基酸柱長(zhǎng)：170cm柱徑：0.9cmF：30mL/ht分離:>20h經(jīng)典柱色譜HPLCt分離：1h§11-1概述高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法經(jīng)典液相§11-2基本理論一、色譜柱柱效的基本關(guān)系式二、分離度GC基本理論（塔板、速率）也適合于LC§11-2基本理論一、色譜柱柱效的基本關(guān)系式二、分離度G三、速率方程溶質(zhì)在液相流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)，約為氣相中擴(kuò)散系數(shù)的萬分之一A渦流擴(kuò)散項(xiàng)B/u分子擴(kuò)散項(xiàng)Cu傳質(zhì)阻力項(xiàng)三、速率方程溶質(zhì)在液相流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)，約為氣相中擴(kuò)散系數(shù)流動(dòng)相流速對(duì)板高的影響小顆粒填料，填充均勻；選擇較低的流動(dòng)相流速；選擇粘度小的溶劑作流動(dòng)相，改善傳質(zhì)。修正的速率方程：提高柱效途徑流動(dòng)相流速對(duì)板高的影響小顆粒填料，填充均勻；修正的速率方程：§11-3高效液相色譜分離方法一、吸附色譜法（液固吸附色譜LSC）1.分離原理Kad值越大，保留時(shí)間越長(zhǎng)吸附平衡常數(shù)吸附競(jìng)爭(zhēng)X：組分分子S：流動(dòng)相分子§11-3高效液相色譜分離方法一、吸附色譜法（液固吸附色2.固定相硅膠－強(qiáng)極性氧化鋁－弱極性活性炭－非極性分子篩－強(qiáng)極性高分子多孔微球(GDX)固體吸附劑應(yīng)用最廣2.固定相硅膠－強(qiáng)極性固體吸附劑應(yīng)用最廣硅膠表面結(jié)構(gòu)弱酸性，對(duì)堿性化合物強(qiáng)保留，拖尾硅膠表面結(jié)構(gòu)弱酸性，對(duì)堿性化合物強(qiáng)保留，拖尾硅膠表面結(jié)構(gòu)經(jīng)熱處理發(fā)生的變化硅膠表面結(jié)構(gòu)經(jīng)熱處理發(fā)生的變化3.流動(dòng)相(洗脫劑)越大，表明流動(dòng)相溶劑分子對(duì)吸附劑的親和能力越強(qiáng)，則越易從吸附劑上將被吸附的溶質(zhì)洗脫下來。溶劑分子在單位吸附劑表面上的吸附自由能溶劑強(qiáng)度參數(shù)吸附競(jìng)爭(zhēng)溶劑極性3.流動(dòng)相(洗脫劑)越大，表明流動(dòng)相溶劑分子對(duì)吸附劑例:硅膠固定相分離苯，甲苯，乙苯，丙苯，丁苯流動(dòng)相：干燥正庚烷1份水飽和的正庚烷2份干燥正庚烷水飽和的正庚烷改變流動(dòng)相的組成可改變分離的選擇性例:硅膠固定相分離苯，甲苯，乙苯，丙苯，丁苯流動(dòng)相：1份水4.應(yīng)用具有不同官能團(tuán)的化合物具有相同官能團(tuán)，但數(shù)量不同的化合物異構(gòu)體例：幾種取代位置不同的硝基苯胺的分離。在硅膠吸附劑上的滯留順序：鄰位<間位<對(duì)位鄰硝基苯胺間硝基苯胺對(duì)硝基苯胺適合分離的物質(zhì)4.應(yīng)用具有不同官能團(tuán)的化合物例：幾種取代位置不同的硝基苯二、分配色譜法（液-液分配色譜LLC+鍵合相色譜）LLC分離原理K不僅與固定相的種類有關(guān)，也與流動(dòng)相的種類有關(guān)二、分配色譜法（液-液分配色譜LLCLLC分離原理K不僅與固固定相極性>流動(dòng)相極性正相分配色譜組分極性越大，保留時(shí)間越長(zhǎng)反相分配色譜固定相極性<流動(dòng)相極性組分極性越小，保留時(shí)間越長(zhǎng)分離強(qiáng)極性物分離弱、非極性物?固定相極性>流動(dòng)相極性正相分配色譜組分極性越大，保留時(shí)間越長(zhǎng)三、離子交換色譜法（IEC）陽離子交換陰離子交換陽離子交換樹脂1.分離原理組分對(duì)交換劑親和力不同三、離子交換色譜法（IEC）陽離子交換陰離子交換陽離子交換樹2.固定相陽離子：－SO3H(強(qiáng))－CO2H(弱)陰離子：－N+R3(強(qiáng))－NH2(弱)基質(zhì)合成樹脂纖維素硅膠離子交換劑2.固定相陽離子：基質(zhì)合成樹脂離子交換劑3.流動(dòng)相水相緩沖液+有機(jī)改性劑（甲醇、乙醇和乙腈）調(diào)節(jié)選擇性的主要參數(shù)鹽種類及濃度pH值各種陰離子的在陰離子交換劑上的滯留次序：用檸檬酸離子洗脫比用氟離子洗脫快3.流動(dòng)相水相緩沖液+有機(jī)改性劑調(diào)節(jié)選擇性的主要參數(shù)鹽種4.應(yīng)用

離子型化合物、可離解的化合物、帶電荷的物質(zhì)等。如無機(jī)鹽、生物大分子氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等4.應(yīng)用離子型化合物、可離解的化合物、帶電荷的物四、化學(xué)鍵合相色譜采用化學(xué)鍵合相的液相色譜固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失。由于可將各種極性的官能團(tuán)鍵合到載體表面，因此它適用于種類繁多樣品的分離。特點(diǎn)分配色譜：液液色譜+鍵合色譜四、化學(xué)鍵合相色譜采用化學(xué)鍵合相的液相色譜固1.鍵合固定相制備ODS(C18)鍵合相硅膠十八烷基氯硅烷非極性硅烷化反應(yīng)使用pH范圍：2～81.鍵合固定相制備ODS(C18)鍵合相硅膠十八烷基氯硅鍵合固定相類型1.疏水基團(tuán)：烷烴（C8和C18）、苯基等2.極性基團(tuán)：丙氨基、氰乙基、氨基、醚和醇等3.離子交換基團(tuán)：胺基、季銨鹽、磺酸、羧酸鍵合固定相類型1.疏水基團(tuán)：烷烴（C8和C18）、苯基等2.鍵合相色譜法分類反相鍵合相色譜:常用固定相：C18分離對(duì)象非極性中等極性化合物常用流動(dòng)相甲醇-水乙腈-水反相鍵合相色譜疏溶劑分離機(jī)制固定相極性<流動(dòng)相極性2.鍵合相色譜法分類反相鍵合相色譜:常用固定相：C1正相鍵合相色譜

固定相極性>流動(dòng)相極性離子性鍵合相色譜將各種離子交換基團(tuán)化學(xué)鍵合到硅膠基質(zhì)表面上，就形成了離子性鍵合相色譜的固定相。其分離原理與離子交換色譜類同。正相鍵合相色譜離子性鍵合相色譜例：甲苯和苯酚的分離。流動(dòng)相：甲醇-水出峰順序：苯酚，甲苯出峰順序：甲苯，苯酚十八烷基鍵合相二醇基鍵合相例：甲苯和苯酚的分離。流動(dòng)相：甲醇-水出峰順序：苯酚，甲苯出保留時(shí)間：<例：以O(shè)DS鍵合色譜柱、甲醇-水為流動(dòng)相分離以下兩種苯甲酸，試判斷出峰次序。沒食子酸3,4-二羥基苯甲酸固定相:非極性

流動(dòng)相:極性組分極性:3,4-二羥基苯甲酸<沒食子酸保留時(shí)間：<例：以O(shè)DS鍵合色譜柱、甲醇-水為流動(dòng)相分離以下五、尺寸排阻(凝膠)色譜法SEC、GPC相對(duì)分子質(zhì)量差別大于10％的化合物才可以分離1.分離原理（Size-ExclusionChromatography）五、尺寸排阻(凝膠)色譜法SEC、GPC相對(duì)分子質(zhì)量差別1.2.固定相是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體，其中含有大量液體（一般是水），柔軟而富于彈性。凝膠3.流動(dòng)相不采用改變流動(dòng)相組成的方法控制分離度凝膠色譜主要分離高分子化合物，常用流動(dòng)相：四氫呋喃、甲苯、二氯甲苯、二氯乙烷、氯仿、丙酮等；分離生物物質(zhì)時(shí)主要用水、緩沖液、乙醇、丙酮等。2.固定相是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體，其中含有★分離方法的選擇★分離方法的選擇§11-4高效液相色譜儀WatersUPLC超高效液相色譜儀§11-4高效液相色譜儀WatersUPLC超高效液高壓泵流動(dòng)相溶劑廢液色譜柱進(jìn)樣口檢測(cè)器高壓輸液系統(tǒng)+進(jìn)樣系統(tǒng)+分離系統(tǒng)+檢測(cè)系統(tǒng)高壓泵流動(dòng)相溶劑廢液色譜柱進(jìn)樣口檢測(cè)器高壓輸液系統(tǒng)+進(jìn)樣一、高壓輸液系統(tǒng)1.高壓泵要求：輸出壓力高平穩(wěn)、脈沖小流量穩(wěn)定可調(diào)耐腐蝕LC最重要的部件一、高壓輸液系統(tǒng)1.高壓泵要求：LC最重要的部件2.梯度洗脫裝置

低壓梯度（外梯度）

高壓梯度（內(nèi)梯度）通過改變流動(dòng)相的組成來調(diào)整組分的k值，改變分離因子α值，以達(dá)到最短時(shí)間內(nèi)得到最佳分離的目的。梯度洗脫①改善分離②縮短分離時(shí)間泵增壓混合混合泵輸入按比例2.梯度洗脫裝置低壓梯度（外梯度）高壓梯度（內(nèi)梯度）等度洗脫與梯度洗脫等度洗脫與梯度洗脫梯度洗脫的特點(diǎn)改善分離,加快分析速度；改善峰形,減少拖尾;可能引起基線漂移梯度洗脫適用于：分配比變化范圍寬的復(fù)雜樣品梯度洗脫的特點(diǎn)改善分離,加快分析速度；梯度洗脫適用于：3.貯液瓶及流動(dòng)相1)對(duì)樣品有一定的溶解度，以防在柱頭產(chǎn)生沉淀。2)適用于所選擇的檢測(cè)器。3)化學(xué)惰性好，以免破壞固定相。4)低粘度，增加樣品的擴(kuò)散系數(shù)，提高柱效。5)純度高，溶劑不純會(huì)增加檢測(cè)器噪聲，產(chǎn)生偽峰。對(duì)流動(dòng)相溶劑的一般要求3.貯液瓶及流動(dòng)相1)對(duì)樣品有一定的溶解度，以防在柱頭產(chǎn)生二、進(jìn)樣系統(tǒng)

準(zhǔn)備狀態(tài)進(jìn)樣狀態(tài)六通閥進(jìn)樣裝置自動(dòng)進(jìn)樣器直接進(jìn)樣進(jìn)樣閥自動(dòng)進(jìn)樣器二、進(jìn)樣系統(tǒng)準(zhǔn)備狀態(tài)進(jìn)樣狀三、色譜柱內(nèi)徑：1～6mm，柱長(zhǎng)：5～30cm；柱填料粒徑：≤5μm分離柱色譜儀心臟◆預(yù)柱（保護(hù)柱、前置柱）三、色譜柱內(nèi)徑：1～6mm，柱長(zhǎng)：5～30cm；分離柱色四、檢測(cè)系統(tǒng)1.紫外吸收檢測(cè)器(ultravioletphotometricdetector)(b)可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器(c)二極管陣列檢測(cè)器(a)固定波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器通用型選擇型氘燈190-600nm光柵流通池測(cè)量光電二極管參比光電二極管分束器聚焦四、檢測(cè)系統(tǒng)1.紫外吸收檢測(cè)器(ultravioletph兩種檢測(cè)器的色譜圖(a)：可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器；(b)：二極管陣列檢測(cè)器(b)(a)兩種檢測(cè)器的色譜圖(b)(a)靈敏度高，精密度及線性范圍較好，可用于梯度洗脫、色譜峰的識(shí)別和純度分析。不能分析紫外沒有吸收的化合物。流動(dòng)相選擇有限制。一些常用溶劑的紫外截止波長(zhǎng)溶劑CS2氯仿四氫呋喃苯乙腈甲醇水紫外截止波長(zhǎng)/nm380245212210190205187紫外檢測(cè)器特點(diǎn)靈敏度高，精密度及線性范圍較好，可用于梯度洗脫、色譜峰的識(shí)別2.熒光檢測(cè)器(fluorescencldetector)靈敏度高，比UV高103倍選擇性好，可用于梯度洗脫。

弧燈220-650nm2.熒光檢測(cè)器(fluorescencldetector)3.示差折光檢測(cè)器(differenticalrefractiveindexdetector)利用組分與流動(dòng)相的折射率之差進(jìn)行檢測(cè)。

通用性好，靈敏度較低，不適用于梯度洗脫。3.示差折光檢測(cè)器(differenticalrefrac4.電化學(xué)檢測(cè)器(electrochemicaldetector)電導(dǎo)檢測(cè)器安培檢測(cè)器7.質(zhì)譜檢測(cè)器LC-MS6.化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器5.蒸發(fā)光閃射檢測(cè)器(evaporativelightseatteringdetector,ELSD)4.電化學(xué)檢測(cè)器(electrochemicaldetec§11-5

LC應(yīng)用一、定性分析純品對(duì)照法光譜檢測(cè)器定性：IR、NMR、MS二、定量分析同GC§11-5LC應(yīng)用一、定性分析二、定量分析本章基本要求1.液相色譜法分類2.液相色譜儀器基本構(gòu)成3.高效液相色譜法分析條件的選擇4.反相鍵合相色譜法原理及特點(diǎn)5.梯度洗脫方法特點(diǎn)6.液相色譜定性和定量分析方法本章基本要求1.液相色譜法分類作業(yè)p.2193，4，5，6，8，9作業(yè)p.219高效液相色譜法(11)幻燈片PPT本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請(qǐng)自行刪除，謝謝！本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請(qǐng)自行刪除，謝謝！本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請(qǐng)自行刪除，謝謝！本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請(qǐng)自行刪除，謝謝！高效液相色譜法(11)幻燈片PPT本課件PPT僅供大主要內(nèi)容11-1概述11-2基本理論11-3高效液相色譜分離方法11-4高效液相色譜儀11-5高效液相色譜應(yīng)用主要內(nèi)容11-1概述§11-1概述高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法經(jīng)典液相柱色譜裝置高效液相色譜儀經(jīng)典液相色譜HPLC固定相粒徑流動(dòng)相驅(qū)動(dòng)方式流動(dòng)相流速150-200μm重力或低壓泵很慢3-10μm高壓泵快(1-10mL/min)例：分離20種氨基酸柱長(zhǎng)：170cm柱徑：0.9cmF：30mL/ht分離:>20h經(jīng)典柱色譜HPLCt分離：1h§11-1概述高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法經(jīng)典液相§11-2基本理論一、色譜柱柱效的基本關(guān)系式二、分離度GC基本理論（塔板、速率）也適合于LC§11-2基本理論一、色譜柱柱效的基本關(guān)系式二、分離度G三、速率方程溶質(zhì)在液相流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)，約為氣相中擴(kuò)散系數(shù)的萬分之一A渦流擴(kuò)散項(xiàng)B/u分子擴(kuò)散項(xiàng)Cu傳質(zhì)阻力項(xiàng)三、速率方程溶質(zhì)在液相流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)，約為氣相中擴(kuò)散系數(shù)流動(dòng)相流速對(duì)板高的影響小顆粒填料，填充均勻；選擇較低的流動(dòng)相流速；選擇粘度小的溶劑作流動(dòng)相，改善傳質(zhì)。修正的速率方程：提高柱效途徑流動(dòng)相流速對(duì)板高的影響小顆粒填料，填充均勻；修正的速率方程：§11-3高效液相色譜分離方法一、吸附色譜法（液固吸附色譜LSC）1.分離原理Kad值越大，保留時(shí)間越長(zhǎng)吸附平衡常數(shù)吸附競(jìng)爭(zhēng)X：組分分子S：流動(dòng)相分子§11-3高效液相色譜分離方法一、吸附色譜法（液固吸附色2.固定相硅膠－強(qiáng)極性氧化鋁－弱極性活性炭－非極性分子篩－強(qiáng)極性高分子多孔微球(GDX)固體吸附劑應(yīng)用最廣2.固定相硅膠－強(qiáng)極性固體吸附劑應(yīng)用最廣硅膠表面結(jié)構(gòu)弱酸性，對(duì)堿性化合物強(qiáng)保留，拖尾硅膠表面結(jié)構(gòu)弱酸性，對(duì)堿性化合物強(qiáng)保留，拖尾硅膠表面結(jié)構(gòu)經(jīng)熱處理發(fā)生的變化硅膠表面結(jié)構(gòu)經(jīng)熱處理發(fā)生的變化3.流動(dòng)相(洗脫劑)越大，表明流動(dòng)相溶劑分子對(duì)吸附劑的親和能力越強(qiáng)，則越易從吸附劑上將被吸附的溶質(zhì)洗脫下來。溶劑分子在單位吸附劑表面上的吸附自由能溶劑強(qiáng)度參數(shù)吸附競(jìng)爭(zhēng)溶劑極性3.流動(dòng)相(洗脫劑)越大，表明流動(dòng)相溶劑分子對(duì)吸附劑例:硅膠固定相分離苯，甲苯，乙苯，丙苯，丁苯流動(dòng)相：干燥正庚烷1份水飽和的正庚烷2份干燥正庚烷水飽和的正庚烷改變流動(dòng)相的組成可改變分離的選擇性例:硅膠固定相分離苯，甲苯，乙苯，丙苯，丁苯流動(dòng)相：1份水4.應(yīng)用具有不同官能團(tuán)的化合物具有相同官能團(tuán)，但數(shù)量不同的化合物異構(gòu)體例：幾種取代位置不同的硝基苯胺的分離。在硅膠吸附劑上的滯留順序：鄰位<間位<對(duì)位鄰硝基苯胺間硝基苯胺對(duì)硝基苯胺適合分離的物質(zhì)4.應(yīng)用具有不同官能團(tuán)的化合物例：幾種取代位置不同的硝基苯二、分配色譜法（液-液分配色譜LLC+鍵合相色譜）LLC分離原理K不僅與固定相的種類有關(guān)，也與流動(dòng)相的種類有關(guān)二、分配色譜法（液-液分配色譜LLCLLC分離原理K不僅與固固定相極性>流動(dòng)相極性正相分配色譜組分極性越大，保留時(shí)間越長(zhǎng)反相分配色譜固定相極性<流動(dòng)相極性組分極性越小，保留時(shí)間越長(zhǎng)分離強(qiáng)極性物分離弱、非極性物?固定相極性>流動(dòng)相極性正相分配色譜組分極性越大，保留時(shí)間越長(zhǎng)三、離子交換色譜法（IEC）陽離子交換陰離子交換陽離子交換樹脂1.分離原理組分對(duì)交換劑親和力不同三、離子交換色譜法（IEC）陽離子交換陰離子交換陽離子交換樹2.固定相陽離子：－SO3H(強(qiáng))－CO2H(弱)陰離子：－N+R3(強(qiáng))－NH2(弱)基質(zhì)合成樹脂纖維素硅膠離子交換劑2.固定相陽離子：基質(zhì)合成樹脂離子交換劑3.流動(dòng)相水相緩沖液+有機(jī)改性劑（甲醇、乙醇和乙腈）調(diào)節(jié)選擇性的主要參數(shù)鹽種類及濃度pH值各種陰離子的在陰離子交換劑上的滯留次序：用檸檬酸離子洗脫比用氟離子洗脫快3.流動(dòng)相水相緩沖液+有機(jī)改性劑調(diào)節(jié)選擇性的主要參數(shù)鹽種4.應(yīng)用

離子型化合物、可離解的化合物、帶電荷的物質(zhì)等。如無機(jī)鹽、生物大分子氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等4.應(yīng)用離子型化合物、可離解的化合物、帶電荷的物四、化學(xué)鍵合相色譜采用化學(xué)鍵合相的液相色譜固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失。由于可將各種極性的官能團(tuán)鍵合到載體表面，因此它適用于種類繁多樣品的分離。特點(diǎn)分配色譜：液液色譜+鍵合色譜四、化學(xué)鍵合相色譜采用化學(xué)鍵合相的液相色譜固1.鍵合固定相制備ODS(C18)鍵合相硅膠十八烷基氯硅烷非極性硅烷化反應(yīng)使用pH范圍：2～81.鍵合固定相制備ODS(C18)鍵合相硅膠十八烷基氯硅鍵合固定相類型1.疏水基團(tuán)：烷烴（C8和C18）、苯基等2.極性基團(tuán)：丙氨基、氰乙基、氨基、醚和醇等3.離子交換基團(tuán)：胺基、季銨鹽、磺酸、羧酸鍵合固定相類型1.疏水基團(tuán)：烷烴（C8和C18）、苯基等2.鍵合相色譜法分類反相鍵合相色譜:常用固定相：C18分離對(duì)象非極性中等極性化合物常用流動(dòng)相甲醇-水乙腈-水反相鍵合相色譜疏溶劑分離機(jī)制固定相極性<流動(dòng)相極性2.鍵合相色譜法分類反相鍵合相色譜:常用固定相：C1正相鍵合相色譜

固定相極性>流動(dòng)相極性離子性鍵合相色譜將各種離子交換基團(tuán)化學(xué)鍵合到硅膠基質(zhì)表面上，就形成了離子性鍵合相色譜的固定相。其分離原理與離子交換色譜類同。正相鍵合相色譜離子性鍵合相色譜例：甲苯和苯酚的分離。流動(dòng)相：甲醇-水出峰順序：苯酚，甲苯出峰順序：甲苯，苯酚十八烷基鍵合相二醇基鍵合相例：甲苯和苯酚的分離。流動(dòng)相：甲醇-水出峰順序：苯酚，甲苯出保留時(shí)間：<例：以O(shè)DS鍵合色譜柱、甲醇-水為流動(dòng)相分離以下兩種苯甲酸，試判斷出峰次序。沒食子酸3,4-二羥基苯甲酸固定相:非極性

流動(dòng)相:極性組分極性:3,4-二羥基苯甲酸<沒食子酸保留時(shí)間：<例：以O(shè)DS鍵合色譜柱、甲醇-水為流動(dòng)相分離以下五、尺寸排阻(凝膠)色譜法SEC、GPC相對(duì)分子質(zhì)量差別大于10％的化合物才可以分離1.分離原理（Size-ExclusionChromatography）五、尺寸排阻(凝膠)色譜法SEC、GPC相對(duì)分子質(zhì)量差別1.2.固定相是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體，其中含有大量液體（一般是水），柔軟而富于彈性。凝膠3.流動(dòng)相不采用改變流動(dòng)相組成的方法控制分離度凝膠色譜主要分離高分子化合物，常用流動(dòng)相：四氫呋喃、甲苯、二氯甲苯、二氯乙烷、氯仿、丙酮等；分離生物物質(zhì)時(shí)主要用水、緩沖液、乙醇、丙酮等。2.固定相是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體，其中含有★分離方法的選擇★分離方法的選擇§11-4高效液相色譜儀WatersUPLC超高效液相色譜儀§11-4高效液相色譜儀WatersUPLC超高效液高壓泵流動(dòng)相溶劑廢液色譜柱進(jìn)樣口檢測(cè)器高壓輸液系統(tǒng)+進(jìn)樣系統(tǒng)+分離系統(tǒng)+檢測(cè)系統(tǒng)高壓泵流動(dòng)相溶劑廢液色譜柱進(jìn)樣口檢測(cè)器高壓輸液系統(tǒng)+進(jìn)樣一、高壓輸液系統(tǒng)1.高壓泵要求：輸出壓力高平穩(wěn)、脈沖小流量穩(wěn)定可調(diào)耐腐蝕LC最重要的部件一、高壓輸液系統(tǒng)1.高壓泵要求：LC最重要的部件2.梯度洗脫裝置

低壓梯度（外梯度）

高壓梯度（內(nèi)梯度）通過改變流動(dòng)相的組成來調(diào)整組分的k值，改變分離因子α值，以達(dá)到最短時(shí)間內(nèi)得到最佳分離的目的。梯度洗脫①改善分離②縮短分離時(shí)間泵增壓混合混合泵輸入按比例2.梯度洗脫裝置低壓梯度（外梯度）高壓梯度（內(nèi)梯度）等度洗脫與梯度洗脫等度洗脫與梯度洗脫梯度洗脫的特點(diǎn)改善分離,加快分析速度；改善峰形,減少拖尾;可能引起基線漂移梯度洗脫適用于：分配比變化范圍寬的復(fù)雜樣品梯度洗脫的特點(diǎn)改善分離,加快分析速度；梯度洗脫適用于：3.貯液瓶及流動(dòng)相1)對(duì)樣品有一定的溶解度，以防在柱頭產(chǎn)生沉淀。2)適用于所選擇的檢測(cè)器。3)化學(xué)惰性好，以免破壞固定相。4)低粘度，增加樣品的擴(kuò)散系數(shù)，提高柱效。5)純度高，溶劑不純會(huì)增加檢測(cè)器噪聲，產(chǎn)生偽峰。對(duì)流動(dòng)相溶劑的一般要求3.貯液瓶及流動(dòng)相1)對(duì)樣品有一定的溶解度，以防在柱頭產(chǎn)生二、進(jìn)樣系統(tǒng)

準(zhǔn)備狀態(tài)進(jìn)樣狀態(tài)六通閥進(jìn)樣裝置自動(dòng)進(jìn)樣器直接進(jìn)樣進(jìn)樣閥自動(dòng)進(jìn)樣器二、進(jìn)樣系統(tǒng)準(zhǔn)備狀態(tài)進(jìn)樣狀三、色譜柱內(nèi)徑：1～6mm，柱長(zhǎng)：5～30cm；柱填料粒徑：≤5μm分離柱色譜儀心臟◆預(yù)柱（保護(hù)柱、前置柱）三、色譜柱內(nèi)徑：1～6mm，柱長(zhǎng)：5～30cm；分離柱色四、檢測(cè)系統(tǒng)1.紫外吸收檢測(cè)器(ultravioletphotomet