雙熒光素報(bào)告系統(tǒng)課件

RNAi(RNAinterference)即RNA干涉，是由雙鏈RNA（dsRNA）介導(dǎo)的、由特定酶參與的特異性基因沉默現(xiàn)象,它在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達(dá)。在RNAi研究中，我們可以人工合成特定的dsRNA，對(duì)目的基因進(jìn)行干涉。但設(shè)計(jì)的dsRNA不同，實(shí)際干涉效果差異很大。所以有時(shí)候就需要篩選dsRNA片斷。

PsiCHECK載體將RNAi與熒光素酶發(fā)光相偶聯(lián)：當(dāng)RNAi有效時(shí)，轉(zhuǎn)錄的熒光素酶RNA將被降解，無發(fā)光反應(yīng)；當(dāng)RNAi無效時(shí)，轉(zhuǎn)錄的熒光素酶RNA將翻譯為熒光素酶，并參與發(fā)光反應(yīng)。通過檢測(cè)發(fā)光即可反應(yīng)RNAi的效果。

以PsiCHECK-2載體為例：將RNAi的靶片段插入到hRlu片段下游的多克隆位點(diǎn)中，然后將構(gòu)建好的載體與特定的dsRNA片段或能轉(zhuǎn)錄dsRNA的載體共轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞；轉(zhuǎn)然后，細(xì)胞培養(yǎng)一定時(shí)間，裂解細(xì)胞使用發(fā)光檢測(cè)的方法檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)情況。

RNA干涉（RNAi）效率發(fā)光法檢測(cè)

雙報(bào)告基因用于實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中作相關(guān)的或成比例的檢測(cè),通常一個(gè)報(bào)告基因作為內(nèi)對(duì)照,使另一個(gè)報(bào)告基因的檢測(cè)均一化。檢測(cè)基因表達(dá)時(shí)雙報(bào)告基因通常用來瞬時(shí)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞，帶有實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因的載體共轉(zhuǎn)染帶有不同的報(bào)告基因作為對(duì)照的第二個(gè)載體。通常實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因偶聯(lián)到調(diào)控的啟動(dòng)子,研究調(diào)控基因的結(jié)構(gòu)和生理基礎(chǔ)。報(bào)告基因表達(dá)活力的相對(duì)改變與偶聯(lián)調(diào)控啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活力的改變相關(guān)，偶聯(lián)到組成型啟動(dòng)子的第二個(gè)報(bào)告基因，提供轉(zhuǎn)錄活力的內(nèi)對(duì)照,使測(cè)試不被實(shí)驗(yàn)條件變化所干擾。通過這種方法,可減少內(nèi)在的變化因素所削弱的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性,比如,培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目和活力的差別,細(xì)胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率。

此前使用螢火蟲熒光素酶，可以結(jié)合氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT),β-半乳糖苷酶(β-Gal),或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)作為雙報(bào)告基因。但CAT、β-Gal等的檢測(cè)方式復(fù)雜，且靈敏度和可檢測(cè)范圍較差，作為內(nèi)參不是很理想。

而使用螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶作為雙報(bào)告基因有多種好處：

螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶反應(yīng)都為發(fā)光反應(yīng)，檢測(cè)方式一致

兩種反應(yīng)檢測(cè)靈敏度與檢測(cè)范圍近似，可以檢測(cè)到更小的量和更大的范圍

兩種發(fā)光反應(yīng)底物不同，不會(huì)相互影響

通過方法將兩個(gè)檢測(cè)串聯(lián)起來，實(shí)現(xiàn)同一樣品，兩步檢測(cè)，得到兩個(gè)檢測(cè)結(jié)果。雙熒光素酶報(bào)告基因發(fā)光檢測(cè)原理：

參考文獻(xiàn)：Kumar,R.,Conklin,D.S.andMittal,V.(2003)High-throughputselectionofeffectiveRNAiprobesforgenesilencing.GenomeRes.13,2333–40.Brummelkamp,T.R.,Bernards,R.andAgami,R.(2002)AsystemforstableexpressionofshortinterferingRNAsinmammaliancell.Science296,550–3.miRNA靶基因驗(yàn)證服務(wù)

一個(gè)miRNA對(duì)應(yīng)一個(gè)基因的費(fèi)用如下，周期30個(gè)工作日靶基因3'UTR是否受miRNA調(diào)控，最直接的證據(jù)可來自于熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證。雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)構(gòu)建包含您所要研究的靶基因3'UTR區(qū)域，并結(jié)合miRNAmimics或inhibitor，進(jìn)行靶點(diǎn)驗(yàn)證及鑒定，快速，準(zhǔn)確。服務(wù)流程優(yōu)惠價(jià)miRNA生物信息學(xué)分析免費(fèi)靶基因3'UTR雙熒光素酶野生型載體構(gòu)建（3'UTR長(zhǎng)度<1kb）2500元靶基因3'UTR雙熒光