微囊藻毒素對一周齡鴨胚性腺發(fā)育的影響

20-湖州師范學(xué)院求真學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文微囊藻毒素對一周齡鴨胚性腺發(fā)育的影響摘要：微囊藻毒素（Microcystins，MC）是由藍(lán)綠藻屬產(chǎn)生的一類常見的具有生物活性的環(huán)狀七肽類毒素。近年來，隨著人類生產(chǎn)、生活活動的發(fā)展，工農(nóng)業(yè)排污的增加，各地水體富營養(yǎng)化日益加劇，導(dǎo)致江河、湖泊中藻類尤其是藍(lán)藻異常繁殖生長而出現(xiàn)水華現(xiàn)象。不僅破壞了水生生態(tài)系統(tǒng)的平衡，而且因藻細(xì)胞破裂后釋放出多種藻毒素通過食物鏈對動物及人類的健康造成了較大的危害。本文通過用一定濃度的微囊藻毒素來處理種蛋，通過石蠟組織切片觀察孵化出的一周齡鴨胚性腺來研究MC對鴨胚生殖系統(tǒng)發(fā)育的毒性影響。結(jié)果表明MC對一周齡鴨胚的性腺造成了一定的損害。關(guān)鍵詞：微囊藻毒素，組織切片，鴨胚，性腺EffectsofMicrocystinsontheGonadalDevelopmentofaWeekAgeDuckEmbryo07093135LIChuan（QiuzhenSchoolofHuzhouTeachersCollege,Huzhou313000）Abstract:Microcystin(MC)generatedbyblue-greenalgaearecommoncyclicpeptidetoxins7withbiologicalactivity.Inrecentyears,withrapiddevelopmentofindustry,aplentyofhumanproduction,increaseoflifeactivitiesandagricultureblowdown,eutrophicationismoreseriousinriversandlakes.Algaeisabnormalbreedinggrowthtoleadthebloomsoutbreak.Notonlydamagedthebalanceofaquaticecosystem,butalsocausedlargerhazardstoanimalandhumanthroughfoodchainbyavarietyofcyanobacterialtoxinsfromalgalcellbreakdown.Thisarticledealtwithfertilizedeggsbycertainconcentrationofmicrocystins,throughparaffin-embeddedtissuessectionsobserveaweakageduckgonadalorganizationalchanges,tostudytheMCtoxicityontheduckgonad.Theresultsshowthatalgaltoxinscauseddamageontheaweakageduckgonadsignificantly.Keywords:Microcystins,tissuessections,duck,gonad湖州師范學(xué)院求真學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文目錄1前言…………………12材料與方法…………22.1實驗材料………………………22.1.1櫻桃谷鴨受精鴨蛋和微囊藻毒素2.1.22.1.32.1.42.1.5主要試劑的配制2.1.6載玻片的處理2.2實驗方法和步驟………………32.2.1種蛋的處理2.2.22.2.3剛孵出雛鴨的飼養(yǎng)2.2.43結(jié)果……………113.1鴨胚處理結(jié)果………………113.2切片制備結(jié)果………………143.2.1注射MC后第4討論………………175總結(jié)與展望………………………18參考文獻(xiàn)………………………19致謝………………………201.引言近年來，隨著人類生產(chǎn)、生活活動的迅速發(fā)展，污水排放量急劇增加，世界各地淡水水體富營養(yǎng)化情況日益加劇，湖泊、河流、池塘中浮游藻類尤其是藍(lán)藻水華日益普遍，微囊藻污染嚴(yán)重時綠色藻細(xì)胞覆蓋整個水體形成水華，導(dǎo)致制水困難，供水暫停的情況頻繁發(fā)生[1]。而其釋放的微囊藻毒素對人類已產(chǎn)生潛在的危害，正日益受到公眾的廣泛關(guān)注，而國內(nèi)對微囊藻毒素的毒理學(xué)研究已取得了較大的進展，微囊藻毒素對肝癌的促進作用已進入了分子水平的機制研究，對其它組織器官的毒理學(xué)研究也逐步深入。早在1878年，F(xiàn)randis在南澳大利亞Alexadrina湖發(fā)現(xiàn)并首先報道了泡沫節(jié)球藻會對動物產(chǎn)生毒害作用，此后許多科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了藻類對于動植物毒害的現(xiàn)象，并開始進一步研究其原因，然后，直到1959年，Bishop等首次從銅綠微囊藻中分離出具有明確基本結(jié)構(gòu)的微囊藻毒素，認(rèn)為它是一種含7個氨基酸的多肽[2]，隨后的研究從不同的藻中分離出了性質(zhì)、組成極為相似的50多種藻毒素[3]，對主要的幾種藻毒素的結(jié)構(gòu)有了明確的了解，其基本結(jié)構(gòu)式為：D-Ala-X-D-MeAsp/D-Asp-Z-Adda-Glu-Md;ha/Dha，由于X、Z(L-氨基酸殘基）的不同以及Asp和Dha的甲基化和去甲氧化而產(chǎn)生不同的藻毒素，經(jīng)大量實驗及病理測驗得出常用的且毒性較大的有MC-LR,MC-RR,MC-RW,MC-YR等（L:亮氨酸，R:精氨酸，Y:酪氨酸,W:色氨酸)[4]。此類毒素對水生生物，水禽乃至人類都構(gòu)成了重大威脅。微囊藻毒素是一類肽毒素，大量研究表明，肝臟是其主要的靶器官。進一步研究發(fā)現(xiàn)MC對腎臟，消化腺，腸道，心乃至性腺都有一定程度的毒性作用。通過Bhattacharya給大鼠腹腔注射MC的實驗，我們可以發(fā)現(xiàn)大鼠血液中尿素和肌酸水平升高，白蛋白含量下降，隨后尿液中出現(xiàn)血紅素、蛋白質(zhì)、膽紅素，而腎臟乳酸脫氫酶及谷草轉(zhuǎn)氨酶下降，提示MC具有腎毒性。此外還有研究表明MC能引起動物心肌細(xì)胞病理學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的損傷[5]。關(guān)于MC對心的毒害Leclaire等科學(xué)家發(fā)現(xiàn)MC是心臟病的潛在致病因素，它可引起心臟輸出量下降、血管擴張、血壓降低、心率下降以及周圍血管發(fā)生低血壓反應(yīng)。另外，有學(xué)者在浙江海寧大腸癌高發(fā)區(qū)的調(diào)查表明，飲用河水、池塘水等淺表水是大腸癌的危險因素之一，其中MC的含量與大腸癌的發(fā)病率呈正相關(guān)[6]。這也在一定程度上也暗示了MC對于腸道等器官存在毒害作用。更進一步，美國學(xué)者用病例對照研究的方法，發(fā)現(xiàn)某些腹瀉病人糞便中含有MC，與飲用水被MCs污染有關(guān)[7]。最近，研究人員還發(fā)現(xiàn)微囊藻毒素能在無脊椎動物性腺中大量累積，微囊藻毒素還可在卵中大量存在并傳遞到后代[8~10]。因此，微囊藻毒素對包括人類在內(nèi)的哺乳動物生殖的影響應(yīng)該受到關(guān)注和重視。有關(guān)微囊藻毒素的這一致害機理尚不完全清楚，有待進一步的研究。本課題在適宜的實驗室條件下，以櫻桃谷種受精鴨蛋作為實驗對象，孵育至胎盤可見時注射適量毒素，然后立即用石蠟封口繼續(xù)孵化，待孵出后飼養(yǎng)雛鴨一周，取其組織器官通過包埋切片技術(shù)觀察研究MC對水禽的毒性效應(yīng)。2.材料與方法2.1實驗材料2.1.1櫻桃谷鴨受精鴨蛋和微囊藻毒素櫻桃谷鴨受精鴨蛋購于湖州塘甸建華種禽廠，微囊藻毒素是由購于北京伊普瑞斯科技有限公司。2.1.2表2-1主要的化學(xué)藥品和試劑名稱純度來源丙酮分析純浙江杭州蕭山化學(xué)試劑廠甲醛分析純浙江三鷹化學(xué)試劑有限公司苦味酸分析純廣東臺山粵僑試劑塑料有限公司碘酸鈉分析純浙江海川化學(xué)品有限公司二甲苯分析純浙江三鷹化學(xué)試劑有限公司冰醋酸分析純國藥集團化學(xué)試劑有限公司無水乙醇分析純杭州蕭山化學(xué)試劑廠95%乙醇分析純杭州蕭山化學(xué)試劑廠APES試劑福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司中性樹脂試劑國藥集團化學(xué)試劑有限公司蘇木色精試劑北京拜爾迪生物公司磷酸二氫鈉試劑國藥集團化學(xué)試劑有限公司磷酸氫二鈉試劑國藥集團化學(xué)試劑有限公司伊紅Y（水溶性）試劑國藥集團化學(xué)試劑有限公司十二水合硫酸鋁鉀試劑上?；瘜W(xué)試劑有限公司苯扎溴銨試劑南昌白云有限公司石蠟（熔點是60-62℃）材料上海經(jīng)濟區(qū)如皋市紅旗玻璃廠2.1.3主要的儀器和設(shè)備見表2-2所列：表2-2主要儀器與設(shè)備名稱型號制造商或產(chǎn)地?zé)晒獾怪蔑@微鏡德國萊卡公司伯樂680型酶標(biāo)儀BIO-RAD公司單人凈化工作臺蘇州凈化設(shè)備有限公司冰箱BCD-251AE中國海信續(xù)表2-2名稱型號制造商或產(chǎn)地雙人單面超凈工作臺蘇州凈化設(shè)備有限公司生物組織切片機RM2235德國萊卡公司超級恒溫水槽DKB-501A上海森信實驗儀器有限公司普通顯微鏡MOTICBseries廈門麥克奧迪光學(xué)儀器有限公司SPX-250B-G微電腦光照培養(yǎng)箱上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠電子天平梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司立式壓力蒸汽滅菌鍋上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠Grumbach孵化器南京皓海儀器儀表有限公司JY96-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機寧波新芝生物股份有限公司生物體視顯微鏡S27日本OLYMPUS公司電熱鼓風(fēng)干燥箱101A-2上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司2.1.4溫度計，EP管，移液槍，鉛筆，眼科鑷子，解剖刀，解剖針，解剖剪，培養(yǎng)皿，切片盒，染色缸，吸水紙，標(biāo)簽紙，蠟杯，蠟鏟，酒精燈，吸水紙，切片刀，毛筆，磨砂載玻片，展片臺，染色架，蓋玻片，樹膠，滴管，各種量程的燒杯、量筒及容量瓶，臉盆，1000mL燒杯，500mL的燒杯，1000mL容量瓶，500mL容量瓶，100mL量筒，50mL量筒，5mL移液管，1mL移液管，錐形瓶，蒸餾水瓶，培養(yǎng)瓶，膠頭滴管，試管，一次性注射器。2.1.5⑴4%中性甲醛（10％中性福爾馬林）固定液的配制：稱取磷酸氫二鈉16.4g，磷酸二氫鈉4.0g，各自溶解后混合在一起，加入甲醛（40％）100mL，加蒸餾水定容至1000mL，倒入染色缸中室溫保存。⑵乙醇-甲醛（酒精-福爾馬林，AF）固定液的配制：量取甲醛（40％）100mL和95％乙醇900mL，倒入染色缸中室溫保存。⑶蘇木精液的配制：稱取蘇木精2g，硫酸鋁鉀17g，碘酸鈉0.2g，量取無水乙醇250mL，蒸餾水750mL，冰醋酸20mL。先用無水乙醇溶解蘇木精，用蒸餾水溶解硫酸鋁鉀，然后將該兩液混合，加入碘酸鈉待溶液變成紫紅色時，再加入冰醋酸，混勻倒入染色缸中室溫保存。⑷0.25％-0.5％伊紅Y水溶性的配制：稱取伊紅Y0.5g，加蒸餾水100mL，加冰醋酸1滴，混勻倒入染色缸中室溫保存。⑸70%酒精配制：先將濃度為100%的酒精注入量筒，取70mL，然后加入蒸餾水至100mL。80%酒精配制：先將濃度為100%的酒精注入量筒，取80mL，然后加入蒸餾水至100mL。90%酒精配制：先將濃度為100%的酒精注入量筒，取90mL，然后加入蒸餾水至100mL。2.1.6組織切片貼在載玻片上進行免疫組織化學(xué)染色，由于染色工程操作步驟及沖洗次數(shù)較多，容易出現(xiàn)脫片現(xiàn)象，因此將載玻片涂膠或硅化是必要的。較常用較好的是采用硅化玻片。APES現(xiàn)用現(xiàn)配，將干凈的玻片放入以1：50比例丙酮稀釋的APES中，停留20-30s，取出稍停片刻，再入純丙酮溶液或蒸餾水中洗去未結(jié)合的APES，置通風(fēng)櫥中晾干即可,處理后的玻片可保存半年以上，但要注意防止污染。2.2.1種蛋的處理2.2.1種蛋的處理①第一時間將剛購買回來的種蛋除菌洗凈②挑揀出擠壓破裂的蛋③將剩余完好的蛋表面雜質(zhì)及污垢洗凈④清洗第二遍保證照蛋時清晰可見不影響胚胎的觀察⑤將清洗兩遍的種蛋置于已配好比例的苯扎溴銨溶液中除菌消毒⑥稍置片刻后將蛋撈起并擦凈擦干排版于孵蛋框中⑦排版好的蛋置于以調(diào)節(jié)好的孵蛋箱（右圖2-1）中孵化圖2-1孵蛋箱2.2.2鴨胚的處理⑴處理劑量：16μg/50μLMC配法：取1mgMC-LR加3.125mL生理鹽水，得濃度為16μg/50μLMC3125μL（50×1000/16）。每蛋注射體積50μL。注射部位卵黃。注射器體積1mL。對照組只注射等體積的生理鹽水。實驗結(jié)果致高死亡率。同理：8μg/50μLMC配法：取1mgMC-LR加6.25mL生理鹽水即得8μg/50μLMC6250μL（50×1000/8）。實驗結(jié)果也造成高致死率。同理：3μg/50μLMC配法：取1mgMC-LR加16.67mL生理鹽水即得3μg/50μLMC166670μL（50×1000/3）實驗結(jié)果還是造成高致死率。通過對櫻桃谷種鴨蛋的稱量，得出對照組平均蛋重74.41±1.27g（SEM）；實驗組平均蛋重74.13±0.60g（SEM）。經(jīng)過多次實驗注射的高MC濃度均造成高致死率，故決定本次實驗用較低濃度的MC，注射劑量約1μg/egg，0.1μg/egg和0.01⑵處理方法：將1瓶1mg的MC純毒配成濃度為1μg/50μL、0.1μg/50μL、0.01μg/50μL的溶液，每種濃度分別注射50個蛋，每蛋卵黃注射50μL配好的MC溶液，則每個蛋卵黃實際注入毒素含量為1μg，0.1μg，0.01μg注射器體積均為50μL/egg，對照組只注射相同劑量的生理鹽水。①1μg/50μL藻劑量：每個蛋需要的藻劑量為50μL50個蛋需要的總藻劑量=50×50=2500μL將1mgMC+50ml生理鹽水即得1μg/50μLMC溶液考慮到實驗損耗和還需要配制剩余兩濃度微囊藻毒素，現(xiàn)配50mL（1μg/50μL）MC溶液備用?？紤]到實驗損耗，應(yīng)多配大約1/3的量，即實際應(yīng)配生理鹽水量為2500×（4/3）=3333.3μL②0.1μg/50μL溶液的配制:取1mL1μg/50μL溶液則1mL溶液包含了20μgMC→（0.05mL/0.1μg）=(1mL+X)/20μg進一步得出X=9mL③同理可得：欲配0.01ug/50ul溶液只需取0.1ug/50μl溶液1ml再加9ml生理鹽水即可④生理鹽水：每個蛋需要的生理鹽水（高壓滅菌處理）為50μL50個蛋需要的總生理鹽水量=50×50=2500μL⑶實驗設(shè)計由于7、8月份購買的種鴨蛋的受精率較低（受精率54.8%），考慮到此原因，先將種鴨蛋孵化至3天（可以看見卵黃囊血管區(qū)），待觀察到胚胎活動時再注射藻毒素。實驗組50枚，對照組35枚只注射生理鹽水50μL。每天照蛋檢查1次統(tǒng)計鴨胚的死亡率。孵化28天時鴨子孵出，將其取出置于適宜的條件下飼養(yǎng)一周。一周后為測量實驗組和對照組鴨胚的發(fā)育情況，解剖雛鴨并分離性腺，立即用福爾馬林溶液固定進行組織檢測。⑷鴨胚孵化參數(shù)①溫度1-14天胚齡38.5℃,14-25天胚齡37.5℃,27-28②相對濕度1-7天胚齡65-70%，8-26天胚齡55-60%，27-28天胚齡70-75%。2.2.3剛孵出雛鴨的飼養(yǎng)①了解雛鴨的生理特點雛鴨一般指0-4周齡的小鴨。剛出殼的雛鴨絨毛短，調(diào)節(jié)體溫的能力差，常需要人工保溫；雛鴨的消化機能尚未健全，飼養(yǎng)雛鴨時要喂給容易消化的飼料；雛鴨的生長速度快，尤其是骨骼生長很快，飼養(yǎng)雛鴨時一定要供應(yīng)營養(yǎng)豐富而全面的飼料。雛鴨嬌嫩，對外界環(huán)境的抵抗力差，易感染疾病，因此，育雛時要特別重視防疫衛(wèi)生工作。②做好準(zhǔn)備工作首先，要檢修好育雛舍，準(zhǔn)備好加溫、采食、飲水等育雛的工具，并連同育雛舍一起進行徹底的清洗消毒(可按每立方米空間用2mL潔王或滅毒威噴灑消毒)。接著，要準(zhǔn)備足夠的飼料、藥品，地面飼養(yǎng)的還要準(zhǔn)備足夠數(shù)量的干燥清潔的墊料，如稻草，麥草等。進雛鴨前還要調(diào)試好加溫設(shè)備，做好加熱試溫工作，一般要提前1天將育雛舍的溫度升高到30℃③及時給雛鴨“開水”和“開食”剛孵出的雛鴨第一次飲水稱“開水”，第一次喂食稱“開食”。飼養(yǎng)雛鴨要做到“早飲水、早開食”，且要先“開水”、后“開食”。雛鴨出殼后原則上應(yīng)在12-24小時內(nèi)“開水”，運輸路途較遠(yuǎn)的，待雛鴨到達(dá)育雛舍休息半小時左右應(yīng)立即供水，在水中添加＂凱樂寶＂，可有效的平衡腸道菌群，使有益菌優(yōu)先占位．飲水時要防止雛鴨嬉水，以免弄濕羽毛而感冒。飲水15-30分鐘后即可開食。雛鴨開始貪吃，要注意少喂多餐。④提供適宜的環(huán)境條件1適宜的溫度溫度適宜時，雛鴨飲水、采食活動正常，不打堆，行動靈活，反應(yīng)敏捷，休息時分布均勻，生長快。溫度偏低時，雛鴨趨向熱源，相互擠壓打堆，這樣易發(fā)生呼吸道病，易造成死傷，生長速度也會受到影響。溫度偏高時，雛鴨遠(yuǎn)離熱源，渴欲增加，食欲降低，正常代謝受到影響，抗病力下降。2、適宜的濕度育雛初期育雛舍內(nèi)需保持較高的相對濕度(60-70%)。隨著雛鴨日齡的增加，體重增長，呼吸量加大，排泄量增大，此時應(yīng)盡量降低育雛舍的相對濕度(50-55%)。3、新鮮的空氣雛鴨新陳代謝旺盛，需要不斷吸入新鮮的氧氣，排出大量的二氧化碳和水氣，同時地面育雛的鴨糞和墊料等分解后會產(chǎn)生大量氨氣和硫化氫等有害氣體。因此，要保證雛鴨正常健康生長，應(yīng)加強育雛舍的通風(fēng)換氣工作，確保空氣新鮮。4、合理的密度密度應(yīng)根據(jù)季節(jié)、雛鴨的日齡和環(huán)境條件等靈活掌握。密度過大，鴨群擁擠，采食、飲水不均，影響生長發(fā)育，鴨群的整齊度差，也易造成疾病的傳播，死淘率增高。密度過小，房舍利用不經(jīng)濟。5、正確的光照剛出殼的雛鴨宜采用較強的連續(xù)光照，以便使其盡快熟悉環(huán)境，迅速學(xué)會飲水和采食。0-4周齡雛鴨連續(xù)光照的時間每天23小時，提供1小時黑暗，使鴨群適應(yīng)黑暗的環(huán)境，以免停電時引起驚群。光照強度至少為10勒克斯，如用白熾燈泡，則每平方米應(yīng)有5瓦的光照強度。2.2.4圖2-2鴨解剖圖1⑴固定與包埋①取材：處死飼養(yǎng)一周的雛鴨，撥開細(xì)毛，剖開腹腔。根據(jù)鴨胚胎的內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖（見圖2-3）找到性腺，并取下來進行固定圖2-2鴨胚解剖圖21.性腺（卵巢）；2.左腎的后部；3.輸卵管分泌部；4.子宮部；5.陰道部；6.泄殖腔；7.心臟；8.左肺；9.肝臟；10.腺胃；11.肌胃；12.小腸；13.盲腸。圖2-3雛鴨解剖圖圖2-4解剖出的雛鴨各組織②固定：4%中性甲醛（10%中性福爾馬林）固定4－6h。組織大時18-24h或更長。③水洗：用流水沖洗已經(jīng)固定的組織塊30min。④脫水（常溫下）Ⅰ乙醇－甲醛（AF）液固定：60minⅡ80％乙醇：120minⅢ95％乙醇I：120minⅣ95％乙醇II：120minⅤ無水乙醇I：60minⅥ無水乙醇II：60minⅦ無水乙醇III：60min注意事項：1.未經(jīng)充分固定的組織不得進入脫水程序；2.用于脫水的試劑容積應(yīng)為組織塊總體積的5-10倍以上；3.自低濃度乙醇向高濃度乙醇逐級移進脫水；4.脫水試劑應(yīng)及時過濾、更換（500mL乙醇可用于500個組織塊脫水；加入硫酸銅的無水乙醇變藍(lán)時，提示需要更換）5.較大組織塊的脫水時間長于較小者，應(yīng)將兩者分開進行脫水；6.組織塊置于無水乙醇內(nèi)的時間不宜過長（以免硬化）；7.丙酮脫水性能強，會使組織塊過縮、硬脆，不宜用以替代無水乙醇。⑤透明Ⅰ二甲苯1：20minⅡ二甲苯2：20minⅢ二甲苯3：20min注意事項：1.二甲苯的容積應(yīng)為組織塊總體積的5-10倍以上；2.組織塊在二甲苯中透明的時間不宜過長（以防組織硬、脆），并依不同種類組織及其大小而異（組織塊呈現(xiàn)棕黃或暗紅色透明即可）；3.二甲苯應(yīng)及時過濾、更換；4.組織塊經(jīng)二甲苯適度處理后不顯透明時，常提示該組塊脫水不充分，應(yīng)查找原因并妥善處理。⑥浸蠟Ⅰ石蠟1（60-62℃Ⅱ石蠟2（60-62℃Ⅲ石蠟3（60-62℃注意事項：1.融化石蠟必須有專人負(fù)責(zé)，必須在熔蠟箱內(nèi)（652.熔蠟的容積應(yīng)為組織塊總體積的5-10倍以上；3.組織塊經(jīng)二甲苯適度透明后方可轉(zhuǎn)入浸蠟過程，應(yīng)盡可能減少透明后組織塊表面的二甲苯帶入熔蠟中；4.浸蠟時間適宜，過短時浸蠟不充分（組織過軟），過長時間組織硬脆；5.熔蠟應(yīng)及時過濾、更換。⑦包埋Ⅰ用加熱的鑷子輕輕夾取已經(jīng)過浸蠟的組織塊，使組織塊的最大面或被特別指定處的組織面向下包埋。注意事項：1.將熔化的石蠟傾入切片盒中，應(yīng)將組織塊平整地置放于切片盒底面的中央處；2.包埋于同一蠟塊內(nèi)的多塊細(xì)小組織應(yīng)彼此靠近并位于同一平面上；3.腔壁、皮膚和黏膜組織必須垂直包埋（立埋）。Ⅱ待包切片盒內(nèi)的熔蠟表面凝固后，立即將切片盒移入冷水中加速凝固。Ⅲ從切片盒中取出凝固的包埋蠟塊（簡稱蠟塊），用刀片去除組織塊周圍的過多石蠟Ⅳ用鉛筆對包埋有組織的石蠟進行編號，要求標(biāo)出組織塊來源，還應(yīng)清晰可見。Ⅴ把修整好的蠟塊放入冰箱，以備切片注意事項:1.應(yīng)將組織塊嚴(yán)格分件包埋。包埋時一定要首先認(rèn)真核對組織塊的編號（包括組織塊種類和器官）2.必須嚴(yán)防各種異物污染，勿將無關(guān)組織如縫線、紙屑或其他異物（尤其是硬質(zhì)異物）埋入蠟塊內(nèi)。3.包埋過程里要操作迅速，以免組織塊尚未埋妥前熔蠟?zāi)?。⑧切片：調(diào)節(jié)切片機（一般厚度調(diào)至3μm，刀片傾斜角5度），進行切片。切出的蠟片應(yīng)連續(xù)呈帶狀，完整無缺，厚度適宜（3-5μm）、均勻、無刀痕、顫痕、皺褶、開裂、缺損、松解等。⑨展片：用鑷子輕輕夾取完整、無刀痕、厚度均勻的蠟片，放入伸展器的溫水中（37℃），使切片全面展開（注意：必須水溫適宜、潔凈尤其是水面；每切完一個蠟塊后；必須認(rèn)真清理水面，不得遺留其他病例的組織碎片，以免污染）。對于展片困難的切片經(jīng)30%的乙醇初展后再用載玻片撈起蠟帶放人展片儀水盒內(nèi)可使切片更易展平。⑩貼片：用經(jīng)APES處理過的載玻片撈展得好的片子，蠟片與載玻片之間無氣泡。烤片：保持電熱鼓風(fēng)干燥箱的溫度在60℃，烘烤60⑵蘇木精－伊紅（HE）染色1.二甲苯I：5min2.二甲苯II：5min3.無水酒精I(xiàn)：3min4.無水酒精I(xiàn)I：3min5.95%酒精I(xiàn)：3min6.95%酒精I(xiàn)I：3min7.80%酒精：1min8.蒸餾水：1min9.蘇木素液染色：30min（注意：染色的效果做好在顯微鏡下觀察一下，如果效果不好，再加長時間，時間長了要更換蘇木素液）10.流水洗去蘇木精液：30min（注意：染色的效果做好在顯微鏡下觀察一下，如果效果不好，再加長時間，時間長了要更換0.5％伊紅液）11.稍水洗：2s12.13.蒸餾水稍洗：2s14.80％酒精：2s15.95%酒精I(xiàn)：3min16.95%酒精I(xiàn)I：3min17.無水酒精I(xiàn)：5min18.無水酒精I(xiàn)I：5min19.無水酒精I(xiàn)II：5min20.二甲苯I：5min21.二甲苯II：5min22.二甲苯III：5min23.中性樹膠封固：干涸前封好（注意：封片要速度快，以免二甲苯揮發(fā)完了影響切片的色澤效果，最好在10s中完成）。結(jié)果3.1鴨胚處理結(jié)果⑴櫻桃谷鴨蛋的平均重量（見表3-1，表3-2）。表3-1櫻桃谷種鴨蛋重量鴨蛋質(zhì)量（g）實驗組72.2678.2171.0175.0468.6776.2869.868.9570.9379.6780.6675.6771.2374.9969.5276.5472.2267.373.3677.427471.0775.574.6573.7180.0676.8273.8574.4678.977.4677.9973.1668.1675.04對照組74.5378.2377.376.5871.4179.3563.2375.477.9174.2880.6476.9275.1867.8467.38本實驗從400枚櫻桃谷鴨蛋中隨機抽取50枚進行稱量。其中15枚為對照組，35枚為實驗組，具體數(shù)據(jù)如表3-1所示。表3-2實驗組和對照組蛋重差異分析實驗組對照組蛋重std.ErrorMean74.13±0.674.41±1.27標(biāo)準(zhǔn)差3.584.91P值0.273經(jīng)T檢測分析得15枚對照組鴨蛋重量74.41±1.27g（SEM）；35枚為實驗組，鴨蛋重量74.13±0.60g（SEM）。使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件使用單一樣本T檢驗分析可得：P⑵藻毒素處理后鴨胚的死亡量及死亡率（表3-2，圖3-1）表3-2不同日齡鴨胚死亡率組別不同日齡的死亡率7天11天15天19天23天27天29天總死亡率對照組6.93%1.98%3.96%0%0.99%0%5.94%19.8%0.01μg/egg32.32%3.03%17.17%9.09%12.12%1.01%7.07%81.81%0.1μg/egg16%14%16%7%0%3%5%61%1μg/egg45%15.57%25.41%9.02%0%0.82%2.46%98.36%此表中鴨胚的死亡率使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件使用單一樣本T檢驗分析可得出對照組與三個實驗組中的顯著性Sig即P值均大于0.05，說明實驗的差異性為不顯著。各小組之間死亡率的差異對實驗結(jié)果沒有影響。所以，本實驗的可信度較高。圖3-1不同日齡鴨蛋死亡率從上圖可直觀發(fā)現(xiàn)，對照組死亡率較低為19%左右，而注射毒素的實驗組死亡率均很高，都處在60%以上提示了MC對鴨胚正常生長發(fā)育有所影響。⑶鴨蛋的各參數(shù)統(tǒng)計（表3-3，圖3-2，圖3-3）表3-3鴨蛋的參數(shù)統(tǒng)計組別日期鴨蛋總數(shù)鴨蛋破損鴨蛋破損率孵化數(shù)量受精數(shù)量受精率實驗一7月30410327.8%37820754.8%實驗二8月72602911.2%23112855.4%實驗三8月25254207.9%23415465.8%實驗四9月24250176.8%23315566.5%實驗五10月1010887.4%1006969%實驗六10月241612213.7%1399971.2%表中實驗一，實驗二，實驗三分別代表預(yù)實驗中16ug/egg組與對照組之和，8ug/egg組，3ug/egg組實驗，統(tǒng)計其數(shù)據(jù)是為探究受精率隨天氣變化的影響。表中實驗四，實驗五，實驗六分別代表實驗中1ug/egg組，0.1ug/egg組，0..01ug/egg組。受精率使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件使用單一樣本T檢驗分析可得出不同組別之間受獎率顯著性Sig即P值均大于0.05，說明實驗的差異性為不顯著。各小組之間受精率的差異對實驗結(jié)果沒有影響。所以，本實驗的可信度較高。圖3-2鴨蛋參數(shù)統(tǒng)計圖從圖3-2中可可發(fā)現(xiàn)基本上鴨蛋的破損率維持在比較平穩(wěn)的水平，對實驗精確性無影響。圖3-3鴨蛋的受精率從（圖3-3）可得出鴨蛋的受精率與氣溫有關(guān)。在炎熱的夏季受精率在55%左右，當(dāng)天氣轉(zhuǎn)涼時受精率呈上升趨勢。得出秋季櫻桃谷鴨受精率高于夏季。3.2切片制備結(jié)果3.2.1注射MC后第35天（一周齡）時雛鴨胎性腺組織的變化（圖3-4，圖3-5，圖3-6圖3-4對照組和注射0.01μg/egg組卵巢橫切的比較圖圖3-5對照組與注射0.1μg/egg卵巢橫切比較圖（圖3-5圖中a：初級卵母細(xì)胞，b：卵泡帶，c：原始卵泡，d：透明帶）上兩圖為一周齡雛鴨卵巢橫切圖，紫色（深色）部分為管壁細(xì)胞核，紅色（淺色）部分為細(xì)胞質(zhì)，中間空白部分為管腔。對照組中初級卵母細(xì)胞之間排列緊密，卵泡內(nèi)透明帶小。而藻毒素處理后實驗組各卵母細(xì)胞間排列變得稀疏，并且隨著MC濃度的升高，卵泡內(nèi)透明帶有呈增多增大趨勢。如圖所示，0.1ug/egg的透明帶明顯多于0.01ug/egg和對照組。有的也不是很明顯。：圖3-6實驗樣本與資料樣本比較圖初級卵泡中央為一個初級卵母細(xì)胞a，周圍一層或多層卵泡細(xì)胞常位于皮質(zhì)淺部。卵巢皮質(zhì)是卵巢的主要部分，呈杯狀包圍著狹小的髓質(zhì)區(qū)。皮質(zhì)有不同數(shù)量的卵泡和黃體，其間為梭形的成纖維細(xì)胞及網(wǎng)狀纖維。卵巢由皮質(zhì)和髓質(zhì)組成。圖3-6對照組與0.01圖3-6對照組與0.01μg/eggMC濃度，0.1μg/eggMC濃度對一周齡雛鴨睪丸曲精管橫切對比圖（均為400X）左圖是雛鴨睪丸曲細(xì)精管橫切圖，管狀圓圈表示曲細(xì)精管，紫色（深色）部分為曲細(xì)精管管壁細(xì)胞核，紅色（淺色）部分為曲細(xì)精管管壁細(xì)胞質(zhì)，中間空白部分為管腔。對比后發(fā)現(xiàn)，隨MC濃度加大出現(xiàn)曲細(xì)精管萎縮、組織脫落、堵塞管腔、曲細(xì)精管內(nèi)細(xì)胞減少、排列紊亂，提示MC-dLR可能破壞睪丸結(jié)構(gòu)，影響睪丸功能。隨著藻毒素濃度的增加其性腺管腔空隙也相應(yīng)的有所縮小，但有的不是很明顯。4.討論目前淡水藻類可分為8門：藍(lán)藻、綠藻、硅藻、甲藻、隱藻、裸藻、金藻和黃藻，而其中藍(lán)藻是產(chǎn)毒最多的一門。一個藻種可以產(chǎn)生多種毒素，一種毒素也可由多個藻種產(chǎn)生。經(jīng)前人研究得到MC主要是山微囊藻、水花魚腥藻、束絲藻及顫藻產(chǎn)生，其結(jié)構(gòu)為單環(huán)七肽。并發(fā)現(xiàn)肝臟是MC的主要靶器官，這己被動物實驗和流行病學(xué)調(diào)查所證實，因此，我們需要了解此類毒素。微囊毒素對動物的毒害程度主要與水華密度、水華毒素含量有關(guān)，也與動物種類和大小有關(guān)[11]。經(jīng)研究單胃動物對于MC沒有動物和鳥類來的敏感。會產(chǎn)毒的藻類生長會降低水質(zhì)，藻細(xì)胞破裂后釋放出毒素，增加了人和動物接觸毒素的風(fēng)險。多種生物如鳥類(包括家禽和水禽)、寵物和牲畜、猴子等接觸微囊藻毒素后都表現(xiàn)出中毒現(xiàn)象。其中毒癥狀主要有昏迷、肌肉痙攣、呼吸急促、腹瀉甚至在數(shù)小時至數(shù)天內(nèi)死亡[12]。故微囊藻毒素的危害必須引起高度關(guān)注。在其中雖然浮游動物和魚類對MC有較大的耐受性，但毒素會在其體內(nèi)積累和產(chǎn)生放大效應(yīng)，達(dá)到相當(dāng)高的濃度，通過食物連對人類健康造成潛在的危害。有資料表明，淡水蚌類是淡水環(huán)境中的優(yōu)勢種群，經(jīng)常被人們捕食，但它們能夠蓄積肝毒性物質(zhì)MC[13]，人類食用此類蚌類攝入毒素，所以它們造成的危害不容忽視。有實驗表明用I125標(biāo)記MC，分別經(jīng)腹腔、口腔和靜脈注入小鼠體內(nèi)，有70%以上的毒素分布在肝臟和腎臟。也已驗證MC在靶器官內(nèi)主要定位于肝細(xì)胞核內(nèi)和腎皮質(zhì)區(qū)域的腎細(xì)胞核內(nèi)[14]。在一種蚌中，MC主要分布于肝胰腺中，其次是鰓和肌肉中，在性腺和消化道中也發(fā)現(xiàn)了微量的MC。表明MC亦可在水生生物性腺中富集。最近，研究人員也發(fā)現(xiàn)微囊藻毒素能在無脊椎動物性腺中大量累積，微囊藻毒素還可在卵中大量存在并傳遞到后代[15]。因此，微囊藻毒素對包括人類在內(nèi)的哺乳動物生殖的影響應(yīng)該受到關(guān)注和重視。有關(guān)微囊藻毒素的這一致害機理尚不完全清楚，有待進一步的研究。本實驗采用微囊藻毒素處理鴨胚，借助石蠟切片技術(shù)用于觀察正常性腺細(xì)胞組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，對比病變的以及受微囊藻毒素影響的性腺組織細(xì)胞是研究、觀察及判斷細(xì)胞組織的形態(tài)變化的主要方法，同時HE染色主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核糖體著紫藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)紅色，兩者相結(jié)合可以很好的觀察組織或細(xì)胞的一般形態(tài)及特點。實驗分別用1μg/egg，0.1/μg/egg，0.01μg/egg三種劑量的MC來處理種蛋，通過對比觀察對照組發(fā)現(xiàn)隨MC濃度加大出現(xiàn)曲細(xì)精管萎縮、組織脫落、堵塞管腔、曲細(xì)精管內(nèi)細(xì)胞減少、排列紊亂，隨著藻毒素濃度的增加其性腺管腔空隙也相應(yīng)的有所縮小，但有的不是很明顯。提示了MC-LR可能破壞睪丸結(jié)構(gòu)，影響睪丸功能。而藻毒素處理后實驗組各卵母細(xì)胞間排列變得稀疏，并且隨著MC濃度的升高，卵泡內(nèi)透明帶有呈增多增大趨勢，提示MC-LR可能影響卵巢結(jié)構(gòu)[16]。本文通過石蠟切片和HE染色觀察得出MC對于一周齡鴨胚性腺發(fā)育有一定的影響。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)由于三日齡的鴨胚可在鴨蛋中浮動，如果長時間將打孔過的鴨蛋放置而未對其進行藻毒素的注射，胚胎會浮游到打孔處，此時在對鴨蛋注射藻毒素可能會破壞鴨胚組織[17]，導(dǎo)致注射后死亡率成倍的上升，而不能確定是否是濃度過高造成的死亡，會對實驗產(chǎn)生誤導(dǎo)，影響實驗結(jié)果。16μg/egg，8μg/egg，3μg/egg，1μg/egg均對鴨胚造成致死性影響。死亡率隨濃度升高而增加。由于一周齡鴨胚組織過大，造成包埋與切片上的不便，故使制成的片子有組織裂開的情況，在一定程度上影響了觀察。本實驗不管在鴨胚的發(fā)育階段、統(tǒng)計鴨胚的死亡率，還是在分析曲精管組織學(xué)上的變化均設(shè)置了實驗組和對照組，通過反復(fù)比較以及統(tǒng)計學(xué)軟件的應(yīng)用確定實驗最佳方案，從而減少實驗誤差，確保了實驗結(jié)果的可靠性。對MC的研究目前主要是集中在其對各器官的毒性作用上，以后的工作將集中在進一步明確其致病機制、在各飲水體系中建立有效的藻毒素監(jiān)測體制、尋找有效的生物標(biāo)志物以及在臨床上找到有效的防治藻毒素中毒的方法。5.總結(jié)與展望雖然MC的研究歷史已近百年，而且也取得了很多有價值的研究成果，但在MC的產(chǎn)生機理、毒素的功能以及毒理學(xué)等方面尚有很多值得深入探討的問題。關(guān)于MC產(chǎn)生機理研究是目前的熱點，究竟MC的產(chǎn)生是受遺傳控制還是環(huán)境因子左右，研究者各持己見，尚無定論。我國對MC的研究起步較晚，調(diào)查MC的污染狀況，尤其是保健品，水產(chǎn)食品中MC的污染狀況，另外慢性、亞慢性暴露于MC所引起的危害，應(yīng)引起足夠的重視[18-19]。本實驗通過對水禽胚胎（鴨胚）獨特的發(fā)育系統(tǒng)的研究初步證實了微囊藻毒素對動物性腺具有一定的毒性效應(yīng)。但對于其致毒機理尚不清楚，有待進一步研究。參考文獻(xiàn)[1]何振榮,俞敏娟,何家芡.銅綠微囊藻毒株M.8641的毒素生物化學(xué)雜志[J].1993,9:168-172[2]俞家祿,陳明慧,林坤二,等.武漢東湖藍(lán)藻水華毒性的研究[J].淡水藍(lán)藻毒性的檢測水生生物學(xué)報,1987,11(3):11-21[3]CoddGA.DetectionMethodsforCyanobacterialToxins.Cambridge:TheRoyalSocietyofChemistry,1994,90-99.[4]于明.北京師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2001,37(5):680-6845[5]樊有賦,詹壽發(fā),甘金蓮,等.微囊藻毒素的危害及其防治[J].生命的化學(xué),2008,28(1):101-103[6]PouriaS,AndradeA,BarbosaJ,etal.FatalmicrocystinintoxicationinhaemodialysisunitinCaruaru.Brazil[J].TheLancet,1998,352:21-26[7]徐立紅.微囊藻毒素致毒機理研究及一種新生分子生態(tài)毒理學(xué)指標(biāo)的建立和應(yīng)用[J].中科院水生生物研究所博士論文,1997[8]AralldaRodriguezR,KubwaboC,BenoitFM.Extrationof15microcystinsandnodularinusingimmunoamnitycolumns[J].Toxicon,2003,42(6):587-599[9]CHENJ,XIEP,GUOL,etal.Tissuedistributionsandseasonaldynamicsofthehepatotoxicmicrocystins2LRand2RRinafreshwatersnail(Bellamyaaeruginosa)fromalargeshallow,eutrophiclakeofthesubtropicalChina[J].EnvironPollut,2005,134(3):423-430[10]ZeguraB,ZajcI,LahTT,FilipicM.Patternsofmicrocystin-LRinducedalt