微囊藻毒素對(duì)一周齡鴨胚性腺發(fā)育的影響

20-湖州師范學(xué)院求真學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文微囊藻毒素對(duì)一周齡鴨胚性腺發(fā)育的影響摘要：微囊藻毒素（Microcystins，MC）是由藍(lán)綠藻屬產(chǎn)生的一類(lèi)常見(jiàn)的具有生物活性的環(huán)狀七肽類(lèi)毒素。近年來(lái)，隨著人類(lèi)生產(chǎn)、生活活動(dòng)的發(fā)展，工農(nóng)業(yè)排污的增加，各地水體富營(yíng)養(yǎng)化日益加劇，導(dǎo)致江河、湖泊中藻類(lèi)尤其是藍(lán)藻異常繁殖生長(zhǎng)而出現(xiàn)水華現(xiàn)象。不僅破壞了水生生態(tài)系統(tǒng)的平衡，而且因藻細(xì)胞破裂后釋放出多種藻毒素通過(guò)食物鏈對(duì)動(dòng)物及人類(lèi)的健康造成了較大的危害。本文通過(guò)用一定濃度的微囊藻毒素來(lái)處理種蛋，通過(guò)石蠟組織切片觀察孵化出的一周齡鴨胚性腺來(lái)研究MC對(duì)鴨胚生殖系統(tǒng)發(fā)育的毒性影響。結(jié)果表明MC對(duì)一周齡鴨胚的性腺造成了一定的損害。關(guān)鍵詞：微囊藻毒素，組織切片，鴨胚，性腺EffectsofMicrocystinsontheGonadalDevelopmentofaWeekAgeDuckEmbryo07093135LIChuan（QiuzhenSchoolofHuzhouTeachersCollege,Huzhou313000）Abstract:Microcystin(MC)generatedbyblue-greenalgaearecommoncyclicpeptidetoxins7withbiologicalactivity.Inrecentyears,withrapiddevelopmentofindustry,aplentyofhumanproduction,increaseoflifeactivitiesandagricultureblowdown,eutrophicationismoreseriousinriversandlakes.Algaeisabnormalbreedinggrowthtoleadthebloomsoutbreak.Notonlydamagedthebalanceofaquaticecosystem,butalsocausedlargerhazardstoanimalandhumanthroughfoodchainbyavarietyofcyanobacterialtoxinsfromalgalcellbreakdown.Thisarticledealtwithfertilizedeggsbycertainconcentrationofmicrocystins,throughparaffin-embeddedtissuessectionsobserveaweakageduckgonadalorganizationalchanges,tostudytheMCtoxicityontheduckgonad.Theresultsshowthatalgaltoxinscauseddamageontheaweakageduckgonadsignificantly.Keywords:Microcystins,tissuessections,duck,gonad湖州師范學(xué)院求真學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文目錄1前言…………………12材料與方法…………22.1實(shí)驗(yàn)材料………………………22.1.1櫻桃谷鴨受精鴨蛋和微囊藻毒素2.1.22.1.32.1.42.1.5主要試劑的配制2.1.6載玻片的處理2.2實(shí)驗(yàn)方法和步驟………………32.2.1種蛋的處理2.2.22.2.3剛孵出雛鴨的飼養(yǎng)2.2.43結(jié)果……………113.1鴨胚處理結(jié)果………………113.2切片制備結(jié)果………………143.2.1注射MC后第4討論………………175總結(jié)與展望………………………18參考文獻(xiàn)………………………19致謝………………………201.引言近年來(lái)，隨著人類(lèi)生產(chǎn)、生活活動(dòng)的迅速發(fā)展，污水排放量急劇增加，世界各地淡水水體富營(yíng)養(yǎng)化情況日益加劇，湖泊、河流、池塘中浮游藻類(lèi)尤其是藍(lán)藻水華日益普遍，微囊藻污染嚴(yán)重時(shí)綠色藻細(xì)胞覆蓋整個(gè)水體形成水華，導(dǎo)致制水困難，供水暫停的情況頻繁發(fā)生[1]。而其釋放的微囊藻毒素對(duì)人類(lèi)已產(chǎn)生潛在的危害，正日益受到公眾的廣泛關(guān)注，而國(guó)內(nèi)對(duì)微囊藻毒素的毒理學(xué)研究已取得了較大的進(jìn)展，微囊藻毒素對(duì)肝癌的促進(jìn)作用已進(jìn)入了分子水平的機(jī)制研究，對(duì)其它組織器官的毒理學(xué)研究也逐步深入。早在1878年，F(xiàn)randis在南澳大利亞Alexadrina湖發(fā)現(xiàn)并首先報(bào)道了泡沫節(jié)球藻會(huì)對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生毒害作用，此后許多科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了藻類(lèi)對(duì)于動(dòng)植物毒害的現(xiàn)象，并開(kāi)始進(jìn)一步研究其原因，然后，直到1959年，Bishop等首次從銅綠微囊藻中分離出具有明確基本結(jié)構(gòu)的微囊藻毒素，認(rèn)為它是一種含7個(gè)氨基酸的多肽[2]，隨后的研究從不同的藻中分離出了性質(zhì)、組成極為相似的50多種藻毒素[3]，對(duì)主要的幾種藻毒素的結(jié)構(gòu)有了明確的了解，其基本結(jié)構(gòu)式為：D-Ala-X-D-MeAsp/D-Asp-Z-Adda-Glu-Md;ha/Dha，由于X、Z(L-氨基酸殘基）的不同以及Asp和Dha的甲基化和去甲氧化而產(chǎn)生不同的藻毒素，經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)及病理測(cè)驗(yàn)得出常用的且毒性較大的有MC-LR,MC-RR,MC-RW,MC-YR等（L:亮氨酸，R:精氨酸，Y:酪氨酸,W:色氨酸)[4]。此類(lèi)毒素對(duì)水生生物，水禽乃至人類(lèi)都構(gòu)成了重大威脅。微囊藻毒素是一類(lèi)肽毒素，大量研究表明，肝臟是其主要的靶器官。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)MC對(duì)腎臟，消化腺，腸道，心乃至性腺都有一定程度的毒性作用。通過(guò)Bhattacharya給大鼠腹腔注射MC的實(shí)驗(yàn)，我們可以發(fā)現(xiàn)大鼠血液中尿素和肌酸水平升高，白蛋白含量下降，隨后尿液中出現(xiàn)血紅素、蛋白質(zhì)、膽紅素，而腎臟乳酸脫氫酶及谷草轉(zhuǎn)氨酶下降，提示MC具有腎毒性。此外還有研究表明MC能引起動(dòng)物心肌細(xì)胞病理學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的損傷[5]。關(guān)于MC對(duì)心的毒害Leclaire等科學(xué)家發(fā)現(xiàn)MC是心臟病的潛在致病因素，它可引起心臟輸出量下降、血管擴(kuò)張、血壓降低、心率下降以及周?chē)馨l(fā)生低血壓反應(yīng)。另外，有學(xué)者在浙江海寧大腸癌高發(fā)區(qū)的調(diào)查表明，飲用河水、池塘水等淺表水是大腸癌的危險(xiǎn)因素之一，其中MC的含量與大腸癌的發(fā)病率呈正相關(guān)[6]。這也在一定程度上也暗示了MC對(duì)于腸道等器官存在毒害作用。更進(jìn)一步，美國(guó)學(xué)者用病例對(duì)照研究的方法，發(fā)現(xiàn)某些腹瀉病人糞便中含有MC，與飲用水被MCs污染有關(guān)[7]。最近，研究人員還發(fā)現(xiàn)微囊藻毒素能在無(wú)脊椎動(dòng)物性腺中大量累積，微囊藻毒素還可在卵中大量存在并傳遞到后代[8~10]。因此，微囊藻毒素對(duì)包括人類(lèi)在內(nèi)的哺乳動(dòng)物生殖的影響應(yīng)該受到關(guān)注和重視。有關(guān)微囊藻毒素的這一致害機(jī)理尚不完全清楚，有待進(jìn)一步的研究。本課題在適宜的實(shí)驗(yàn)室條件下，以櫻桃谷種受精鴨蛋作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，孵育至胎盤(pán)可見(jiàn)時(shí)注射適量毒素，然后立即用石蠟封口繼續(xù)孵化，待孵出后飼養(yǎng)雛鴨一周，取其組織器官通過(guò)包埋切片技術(shù)觀察研究MC對(duì)水禽的毒性效應(yīng)。2.材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1櫻桃谷鴨受精鴨蛋和微囊藻毒素櫻桃谷鴨受精鴨蛋購(gòu)于湖州塘甸建華種禽廠，微囊藻毒素是由購(gòu)于北京伊普瑞斯科技有限公司。2.1.2表2-1主要的化學(xué)藥品和試劑名稱(chēng)純度來(lái)源丙酮分析純浙江杭州蕭山化學(xué)試劑廠甲醛分析純浙江三鷹化學(xué)試劑有限公司苦味酸分析純廣東臺(tái)山粵僑試劑塑料有限公司碘酸鈉分析純浙江海川化學(xué)品有限公司二甲苯分析純浙江三鷹化學(xué)試劑有限公司冰醋酸分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司無(wú)水乙醇分析純杭州蕭山化學(xué)試劑廠95%乙醇分析純杭州蕭山化學(xué)試劑廠APES試劑福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司中性樹(shù)脂試劑國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司蘇木色精試劑北京拜爾迪生物公司磷酸二氫鈉試劑國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司磷酸氫二鈉試劑國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司伊紅Y（水溶性）試劑國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司十二水合硫酸鋁鉀試劑上?；瘜W(xué)試劑有限公司苯扎溴銨試劑南昌白云有限公司石蠟（熔點(diǎn)是60-62℃）材料上海經(jīng)濟(jì)區(qū)如皋市紅旗玻璃廠2.1.3主要的儀器和設(shè)備見(jiàn)表2-2所列：表2-2主要儀器與設(shè)備名稱(chēng)型號(hào)制造商或產(chǎn)地?zé)晒獾怪蔑@微鏡德國(guó)萊卡公司伯樂(lè)680型酶標(biāo)儀BIO-RAD公司單人凈化工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司冰箱BCD-251AE中國(guó)海信續(xù)表2-2名稱(chēng)型號(hào)制造商或產(chǎn)地雙人單面超凈工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司生物組織切片機(jī)RM2235德國(guó)萊卡公司超級(jí)恒溫水槽DKB-501A上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司普通顯微鏡MOTICBseries廈門(mén)麥克奧迪光學(xué)儀器有限公司SPX-250B-G微電腦光照培養(yǎng)箱上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠電子天平梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司立式壓力蒸汽滅菌鍋上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠Grumbach孵化器南京皓海儀器儀表有限公司JY96-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)寧波新芝生物股份有限公司生物體視顯微鏡S27日本OLYMPUS公司電熱鼓風(fēng)干燥箱101A-2上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司2.1.4溫度計(jì)，EP管，移液槍?zhuān)U筆，眼科鑷子，解剖刀，解剖針，解剖剪，培養(yǎng)皿，切片盒，染色缸，吸水紙，標(biāo)簽紙，蠟杯，蠟鏟，酒精燈，吸水紙，切片刀，毛筆，磨砂載玻片，展片臺(tái)，染色架，蓋玻片，樹(shù)膠，滴管，各種量程的燒杯、量筒及容量瓶，臉盆，1000mL燒杯，500mL的燒杯，1000mL容量瓶，500mL容量瓶，100mL量筒，50mL量筒，5mL移液管，1mL移液管，錐形瓶，蒸餾水瓶，培養(yǎng)瓶，膠頭滴管，試管，一次性注射器。2.1.5⑴4%中性甲醛（10％中性福爾馬林）固定液的配制：稱(chēng)取磷酸氫二鈉16.4g，磷酸二氫鈉4.0g，各自溶解后混合在一起，加入甲醛（40％）100mL，加蒸餾水定容至1000mL，倒入染色缸中室溫保存。⑵乙醇-甲醛（酒精-福爾馬林，AF）固定液的配制：量取甲醛（40％）100mL和95％乙醇900mL，倒入染色缸中室溫保存。⑶蘇木精液的配制：稱(chēng)取蘇木精2g，硫酸鋁鉀17g，碘酸鈉0.2g，量取無(wú)水乙醇250mL，蒸餾水750mL，冰醋酸20mL。先用無(wú)水乙醇溶解蘇木精，用蒸餾水溶解硫酸鋁鉀，然后將該兩液混合，加入碘酸鈉待溶液變成紫紅色時(shí)，再加入冰醋酸，混勻倒入染色缸中室溫保存。⑷0.25％-0.5％伊紅Y水溶性的配制：稱(chēng)取伊紅Y0.5g，加蒸餾水100mL，加冰醋酸1滴，混勻倒入染色缸中室溫保存。⑸70%酒精配制：先將濃度為100%的酒精注入量筒，取70mL，然后加入蒸餾水至100mL。80%酒精配制：先將濃度為100%的酒精注入量筒，取80mL，然后加入蒸餾水至100mL。90%酒精配制：先將濃度為100%的酒精注入量筒，取90mL，然后加入蒸餾水至100mL。2.1.6組織切片貼在載玻片上進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，由于染色工程操作步驟及沖洗次數(shù)較多，容易出現(xiàn)脫片現(xiàn)象，因此將載玻片涂膠或硅化是必要的。較常用較好的是采用硅化玻片。APES現(xiàn)用現(xiàn)配，將干凈的玻片放入以1：50比例丙酮稀釋的APES中，停留20-30s，取出稍停片刻，再入純丙酮溶液或蒸餾水中洗去未結(jié)合的APES，置通風(fēng)櫥中晾干即可,處理后的玻片可保存半年以上，但要注意防止污染。2.2.1種蛋的處理2.2.1種蛋的處理①第一時(shí)間將剛購(gòu)買(mǎi)回來(lái)的種蛋除菌洗凈②挑揀出擠壓破裂的蛋③將剩余完好的蛋表面雜質(zhì)及污垢洗凈④清洗第二遍保證照蛋時(shí)清晰可見(jiàn)不影響胚胎的觀察⑤將清洗兩遍的種蛋置于已配好比例的苯扎溴銨溶液中除菌消毒⑥稍置片刻后將蛋撈起并擦凈擦干排版于孵蛋框中⑦排版好的蛋置于以調(diào)節(jié)好的孵蛋箱（右圖2-1）中孵化圖2-1孵蛋箱2.2.2鴨胚的處理⑴處理劑量：16μg/50μLMC配法：取1mgMC-LR加3.125mL生理鹽水，得濃度為16μg/50μLMC3125μL（50×1000/16）。每蛋注射體積50μL。注射部位卵黃。注射器體積1mL。對(duì)照組只注射等體積的生理鹽水。實(shí)驗(yàn)結(jié)果致高死亡率。同理：8μg/50μLMC配法：取1mgMC-LR加6.25mL生理鹽水即得8μg/50μLMC6250μL（50×1000/8）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也造成高致死率。同理：3μg/50μLMC配法：取1mgMC-LR加16.67mL生理鹽水即得3μg/50μLMC166670μL（50×1000/3）實(shí)驗(yàn)結(jié)果還是造成高致死率。通過(guò)對(duì)櫻桃谷種鴨蛋的稱(chēng)量，得出對(duì)照組平均蛋重74.41±1.27g（SEM）；實(shí)驗(yàn)組平均蛋重74.13±0.60g（SEM）。經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)注射的高M(jìn)C濃度均造成高致死率，故決定本次實(shí)驗(yàn)用較低濃度的MC，注射劑量約1μg/egg，0.1μg/egg和0.01⑵處理方法：將1瓶1mg的MC純毒配成濃度為1μg/50μL、0.1μg/50μL、0.01μg/50μL的溶液，每種濃度分別注射50個(gè)蛋，每蛋卵黃注射50μL配好的MC溶液，則每個(gè)蛋卵黃實(shí)際注入毒素含量為1μg，0.1μg，0.01μg注射器體積均為50μL/egg，對(duì)照組只注射相同劑量的生理鹽水。①1μg/50μL藻劑量：每個(gè)蛋需要的藻劑量為50μL50個(gè)蛋需要的總藻劑量=50×50=2500μL將1mgMC+50ml生理鹽水即得1μg/50μLMC溶液考慮到實(shí)驗(yàn)損耗和還需要配制剩余兩濃度微囊藻毒素，現(xiàn)配50mL（1μg/50μL）MC溶液備用?？紤]到實(shí)驗(yàn)損耗，應(yīng)多配大約1/3的量，即實(shí)際應(yīng)配生理鹽水量為2500×（4/3）=3333.3μL②0.1μg/50μL溶液的配制:取1mL1μg/50μL溶液則1mL溶液包含了20μgMC→（0.05mL/0.1μg）=(1mL+X)/20μg進(jìn)一步得出X=9mL③同理可得：欲配0.01ug/50ul溶液只需取0.1ug/50μl溶液1ml再加9ml生理鹽水即可④生理鹽水：每個(gè)蛋需要的生理鹽水（高壓滅菌處理）為50μL50個(gè)蛋需要的總生理鹽水量=50×50=2500μL⑶實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)由于7、8月份購(gòu)買(mǎi)的種鴨蛋的受精率較低（受精率54.8%），考慮到此原因，先將種鴨蛋孵化至3天（可以看見(jiàn)卵黃囊血管區(qū)），待觀察到胚胎活動(dòng)時(shí)再注射藻毒素。實(shí)驗(yàn)組50枚，對(duì)照組35枚只注射生理鹽水50μL。每天照蛋檢查1次統(tǒng)計(jì)鴨胚的死亡率。孵化28天時(shí)鴨子孵出，將其取出置于適宜的條件下飼養(yǎng)一周。一周后為測(cè)量實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組鴨胚的發(fā)育情況，解剖雛鴨并分離性腺，立即用福爾馬林溶液固定進(jìn)行組織檢測(cè)。⑷鴨胚孵化參數(shù)①溫度1-14天胚齡38.5℃,14-25天胚齡37.5℃,27-28②相對(duì)濕度1-7天胚齡65-70%，8-26天胚齡55-60%，27-28天胚齡70-75%。2.2.3剛孵出雛鴨的飼養(yǎng)①了解雛鴨的生理特點(diǎn)雛鴨一般指0-4周齡的小鴨。剛出殼的雛鴨絨毛短，調(diào)節(jié)體溫的能力差，常需要人工保溫；雛鴨的消化機(jī)能尚未健全，飼養(yǎng)雛鴨時(shí)要喂給容易消化的飼料；雛鴨的生長(zhǎng)速度快，尤其是骨骼生長(zhǎng)很快，飼養(yǎng)雛鴨時(shí)一定要供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)豐富而全面的飼料。雛鴨嬌嫩，對(duì)外界環(huán)境的抵抗力差，易感染疾病，因此，育雛時(shí)要特別重視防疫衛(wèi)生工作。②做好準(zhǔn)備工作首先，要檢修好育雛舍，準(zhǔn)備好加溫、采食、飲水等育雛的工具，并連同育雛舍一起進(jìn)行徹底的清洗消毒(可按每立方米空間用2mL潔王或滅毒威噴灑消毒)。接著，要準(zhǔn)備足夠的飼料、藥品，地面飼養(yǎng)的還要準(zhǔn)備足夠數(shù)量的干燥清潔的墊料，如稻草，麥草等。進(jìn)雛鴨前還要調(diào)試好加溫設(shè)備，做好加熱試溫工作，一般要提前1天將育雛舍的溫度升高到30℃③及時(shí)給雛鴨“開(kāi)水”和“開(kāi)食”剛孵出的雛鴨第一次飲水稱(chēng)“開(kāi)水”，第一次喂食稱(chēng)“開(kāi)食”。飼養(yǎng)雛鴨要做到“早飲水、早開(kāi)食”，且要先“開(kāi)水”、后“開(kāi)食”。雛鴨出殼后原則上應(yīng)在12-24小時(shí)內(nèi)“開(kāi)水”，運(yùn)輸路途較遠(yuǎn)的，待雛鴨到達(dá)育雛舍休息半小時(shí)左右應(yīng)立即供水，在水中添加＂凱樂(lè)寶＂，可有效的平衡腸道菌群，使有益菌優(yōu)先占位．飲水時(shí)要防止雛鴨嬉水，以免弄濕羽毛而感冒。飲水15-30分鐘后即可開(kāi)食。雛鴨開(kāi)始貪吃，要注意少喂多餐。④提供適宜的環(huán)境條件1適宜的溫度溫度適宜時(shí)，雛鴨飲水、采食活動(dòng)正常，不打堆，行動(dòng)靈活，反應(yīng)敏捷，休息時(shí)分布均勻，生長(zhǎng)快。溫度偏低時(shí)，雛鴨趨向熱源，相互擠壓打堆，這樣易發(fā)生呼吸道病，易造成死傷，生長(zhǎng)速度也會(huì)受到影響。溫度偏高時(shí)，雛鴨遠(yuǎn)離熱源，渴欲增加，食欲降低，正常代謝受到影響，抗病力下降。2、適宜的濕度育雛初期育雛舍內(nèi)需保持較高的相對(duì)濕度(60-70%)。隨著雛鴨日齡的增加，體重增長(zhǎng)，呼吸量加大，排泄量增大，此時(shí)應(yīng)盡量降低育雛舍的相對(duì)濕度(50-55%)。3、新鮮的空氣雛鴨新陳代謝旺盛，需要不斷吸入新鮮的氧氣，排出大量的二氧化碳和水氣，同時(shí)地面育雛的鴨糞和墊料等分解后會(huì)產(chǎn)生大量氨氣和硫化氫等有害氣體。因此，要保證雛鴨正常健康生長(zhǎng)，應(yīng)加強(qiáng)育雛舍的通風(fēng)換氣工作，確?？諝庑迈r。4、合理的密度密度應(yīng)根據(jù)季節(jié)、雛鴨的日齡和環(huán)境條件等靈活掌握。密度過(guò)大，鴨群擁擠，采食、飲水不均，影響生長(zhǎng)發(fā)育，鴨群的整齊度差，也易造成疾病的傳播，死淘率增高。密度過(guò)小，房舍利用不經(jīng)濟(jì)。5、正確的光照剛出殼的雛鴨宜采用較強(qiáng)的連續(xù)光照，以便使其盡快熟悉環(huán)境，迅速學(xué)會(huì)飲水和采食。0-4周齡雛鴨連續(xù)光照的時(shí)間每天23小時(shí)，提供1小時(shí)黑暗，使鴨群適應(yīng)黑暗的環(huán)境，以免停電時(shí)引起驚群。光照強(qiáng)度至少為10勒克斯，如用白熾燈泡，則每平方米應(yīng)有5瓦的光照強(qiáng)度。2.2.4圖2-2鴨解剖圖1⑴固定與包埋①取材：處死飼養(yǎng)一周的雛鴨，撥開(kāi)細(xì)毛，剖開(kāi)腹腔。根據(jù)鴨胚胎的內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖（見(jiàn)圖2-3）找到性腺，并取下來(lái)進(jìn)行固定圖2-2鴨胚解剖圖21.性腺（卵巢）；2.左腎的后部；3.輸卵管分泌部；4.子宮部；5.陰道部；6.泄殖腔；7.心臟；8.左肺；9.肝臟；10.腺胃；11.肌胃；12.小腸；13.盲腸。圖2-3雛鴨解剖圖圖2-4解剖出的雛鴨各組織②固定：4%中性甲醛（10%中性福爾馬林）固定4－6h。組織大時(shí)18-24h或更長(zhǎng)。③水洗：用流水沖洗已經(jīng)固定的組織塊30min。④脫水（常溫下）Ⅰ乙醇－甲醛（AF）液固定：60minⅡ80％乙醇：120minⅢ95％乙醇I：120minⅣ95％乙醇II：120minⅤ無(wú)水乙醇I：60minⅥ無(wú)水乙醇II：60minⅦ無(wú)水乙醇III：60min注意事項(xiàng)：1.未經(jīng)充分固定的組織不得進(jìn)入脫水程序；2.用于脫水的試劑容積應(yīng)為組織塊總體積的5-10倍以上；3.自低濃度乙醇向高濃度乙醇逐級(jí)移進(jìn)脫水；4.脫水試劑應(yīng)及時(shí)過(guò)濾、更換（500mL乙醇可用于500個(gè)組織塊脫水；加入硫酸銅的無(wú)水乙醇變藍(lán)時(shí)，提示需要更換）5.較大組織塊的脫水時(shí)間長(zhǎng)于較小者，應(yīng)將兩者分開(kāi)進(jìn)行脫水；6.組織塊置于無(wú)水乙醇內(nèi)的時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)（以免硬化）；7.丙酮脫水性能強(qiáng)，會(huì)使組織塊過(guò)縮、硬脆，不宜用以替代無(wú)水乙醇。⑤透明Ⅰ二甲苯1：20minⅡ二甲苯2：20minⅢ二甲苯3：20min注意事項(xiàng)：1.二甲苯的容積應(yīng)為組織塊總體積的5-10倍以上；2.組織塊在二甲苯中透明的時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)（以防組織硬、脆），并依不同種類(lèi)組織及其大小而異（組織塊呈現(xiàn)棕黃或暗紅色透明即可）；3.二甲苯應(yīng)及時(shí)過(guò)濾、更換；4.組織塊經(jīng)二甲苯適度處理后不顯透明時(shí)，常提示該組塊脫水不充分，應(yīng)查找原因并妥善處理。⑥浸蠟Ⅰ石蠟1（60-62℃Ⅱ石蠟2（60-62℃Ⅲ石蠟3（60-62℃注意事項(xiàng)：1.融化石蠟必須有專(zhuān)人負(fù)責(zé)，必須在熔蠟箱內(nèi)（652.熔蠟的容積應(yīng)為組織塊總體積的5-10倍以上；3.組織塊經(jīng)二甲苯適度透明后方可轉(zhuǎn)入浸蠟過(guò)程，應(yīng)盡可能減少透明后組織塊表面的二甲苯帶入熔蠟中；4.浸蠟時(shí)間適宜，過(guò)短時(shí)浸蠟不充分（組織過(guò)軟），過(guò)長(zhǎng)時(shí)間組織硬脆；5.熔蠟應(yīng)及時(shí)過(guò)濾、更換。⑦包埋Ⅰ用加熱的鑷子輕輕夾取已經(jīng)過(guò)浸蠟的組織塊，使組織塊的最大面或被特別指定處的組織面向下包埋。注意事項(xiàng)：1.將熔化的石蠟傾入切片盒中，應(yīng)將組織塊平整地置放于切片盒底面的中央處；2.包埋于同一蠟塊內(nèi)的多塊細(xì)小組織應(yīng)彼此靠近并位于同一平面上；3.腔壁、皮膚和黏膜組織必須垂直包埋（立埋）。Ⅱ待包切片盒內(nèi)的熔蠟表面凝固后，立即將切片盒移入冷水中加速凝固。Ⅲ從切片盒中取出凝固的包埋蠟塊（簡(jiǎn)稱(chēng)蠟塊），用刀片去除組織塊周?chē)倪^(guò)多石蠟Ⅳ用鉛筆對(duì)包埋有組織的石蠟進(jìn)行編號(hào)，要求標(biāo)出組織塊來(lái)源，還應(yīng)清晰可見(jiàn)。Ⅴ把修整好的蠟塊放入冰箱，以備切片注意事項(xiàng):1.應(yīng)將組織塊嚴(yán)格分件包埋。包埋時(shí)一定要首先認(rèn)真核對(duì)組織塊的編號(hào)（包括組織塊種類(lèi)和器官）2.必須嚴(yán)防各種異物污染，勿將無(wú)關(guān)組織如縫線(xiàn)、紙屑或其他異物（尤其是硬質(zhì)異物）埋入蠟塊內(nèi)。3.包埋過(guò)程里要操作迅速，以免組織塊尚未埋妥前熔蠟?zāi)?。⑧切片：調(diào)節(jié)切片機(jī)（一般厚度調(diào)至3μm，刀片傾斜角5度），進(jìn)行切片。切出的蠟片應(yīng)連續(xù)呈帶狀，完整無(wú)缺，厚度適宜（3-5μm）、均勻、無(wú)刀痕、顫痕、皺褶、開(kāi)裂、缺損、松解等。⑨展片：用鑷子輕輕夾取完整、無(wú)刀痕、厚度均勻的蠟片，放入伸展器的溫水中（37℃），使切片全面展開(kāi)（注意：必須水溫適宜、潔凈尤其是水面；每切完一個(gè)蠟塊后；必須認(rèn)真清理水面，不得遺留其他病例的組織碎片，以免污染）。對(duì)于展片困難的切片經(jīng)30%的乙醇初展后再用載玻片撈起蠟帶放人展片儀水盒內(nèi)可使切片更易展平。⑩貼片：用經(jīng)APES處理過(guò)的載玻片撈展得好的片子，蠟片與載玻片之間無(wú)氣泡?？酒罕３蛛姛峁娘L(fēng)干燥箱的溫度在60℃，烘烤60⑵蘇木精－伊紅（HE）染色1.二甲苯I：5min2.二甲苯II：5min3.無(wú)水酒精I(xiàn)：3min4.無(wú)水酒精I(xiàn)I：3min5.95%酒精I(xiàn)：3min6.95%酒精I(xiàn)I：3min7.80%酒精：1min8.蒸餾水：1min9.蘇木素液染色：30min（注意：染色的效果做好在顯微鏡下觀察一下，如果效果不好，再加長(zhǎng)時(shí)間，時(shí)間長(zhǎng)了要更換蘇木素液）10.流水洗去蘇木精液：30min（注意：染色的效果做好在顯微鏡下觀察一下，如果效果不好，再加長(zhǎng)時(shí)間，時(shí)間長(zhǎng)了要更換0.5％伊紅液）11.稍水洗：2s12.13.蒸餾水稍洗：2s14.80％酒精：2s15.95%酒精I(xiàn)：3min16.95%酒精I(xiàn)I：3min17.無(wú)水酒精I(xiàn)：5min18.無(wú)水酒精I(xiàn)I：5min19.無(wú)水酒精I(xiàn)II：5min20.二甲苯I：5min21.二甲苯II：5min22.二甲苯III：5min23.中性樹(shù)膠封固：干涸前封好（注意：封片要速度快，以免二甲苯揮發(fā)完了影響切片的色澤效果，最好在10s中完成）。結(jié)果3.1鴨胚處理結(jié)果⑴櫻桃谷鴨蛋的平均重量（見(jiàn)表3-1，表3-2）。表3-1櫻桃谷種鴨蛋重量鴨蛋質(zhì)量（g）實(shí)驗(yàn)組72.2678.2171.0175.0468.6776.2869.868.9570.9379.6780.6675.6771.2374.9969.5276.5472.2267.373.3677.427471.0775.574.6573.7180.0676.8273.8574.4678.977.4677.9973.1668.1675.04對(duì)照組74.5378.2377.376.5871.4179.3563.2375.477.9174.2880.6476.9275.1867.8467.38本實(shí)驗(yàn)從400枚櫻桃谷鴨蛋中隨機(jī)抽取50枚進(jìn)行稱(chēng)量。其中15枚為對(duì)照組，35枚為實(shí)驗(yàn)組，具體數(shù)據(jù)如表3-1所示。表3-2實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組蛋重差異分析實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組蛋重std.ErrorMean74.13±0.674.41±1.27標(biāo)準(zhǔn)差3.584.91P值0.273經(jīng)T檢測(cè)分析得15枚對(duì)照組鴨蛋重量74.41±1.27g（SEM）；35枚為實(shí)驗(yàn)組，鴨蛋重量74.13±0.60g（SEM）。使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件使用單一樣本T檢驗(yàn)分析可得：P⑵藻毒素處理后鴨胚的死亡量及死亡率（表3-2，圖3-1）表3-2不同日齡鴨胚死亡率組別不同日齡的死亡率7天11天15天19天23天27天29天總死亡率對(duì)照組6.93%1.98%3.96%0%0.99%0%5.94%19.8%0.01μg/egg32.32%3.03%17.17%9.09%12.12%1.01%7.07%81.81%0.1μg/egg16%14%16%7%0%3%5%61%1μg/egg45%15.57%25.41%9.02%0%0.82%2.46%98.36%此表中鴨胚的死亡率使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件使用單一樣本T檢驗(yàn)分析可得出對(duì)照組與三個(gè)實(shí)驗(yàn)組中的顯著性Sig即P值均大于0.05，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)的差異性為不顯著。各小組之間死亡率的差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有影響。所以，本實(shí)驗(yàn)的可信度較高。圖3-1不同日齡鴨蛋死亡率從上圖可直觀發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組死亡率較低為19%左右，而注射毒素的實(shí)驗(yàn)組死亡率均很高，都處在60%以上提示了MC對(duì)鴨胚正常生長(zhǎng)發(fā)育有所影響。⑶鴨蛋的各參數(shù)統(tǒng)計(jì)（表3-3，圖3-2，圖3-3）表3-3鴨蛋的參數(shù)統(tǒng)計(jì)組別日期鴨蛋總數(shù)鴨蛋破損鴨蛋破損率孵化數(shù)量受精數(shù)量受精率實(shí)驗(yàn)一7月30410327.8%37820754.8%實(shí)驗(yàn)二8月72602911.2%23112855.4%實(shí)驗(yàn)三8月25254207.9%23415465.8%實(shí)驗(yàn)四9月24250176.8%23315566.5%實(shí)驗(yàn)五10月1010887.4%1006969%實(shí)驗(yàn)六10月241612213.7%1399971.2%表中實(shí)驗(yàn)一，實(shí)驗(yàn)二，實(shí)驗(yàn)三分別代表預(yù)實(shí)驗(yàn)中16ug/egg組與對(duì)照組之和，8ug/egg組，3ug/egg組實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)其數(shù)據(jù)是為探究受精率隨天氣變化的影響。表中實(shí)驗(yàn)四，實(shí)驗(yàn)五，實(shí)驗(yàn)六分別代表實(shí)驗(yàn)中1ug/egg組，0.1ug/egg組，0..01ug/egg組。受精率使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件使用單一樣本T檢驗(yàn)分析可得出不同組別之間受獎(jiǎng)率顯著性Sig即P值均大于0.05，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)的差異性為不顯著。各小組之間受精率的差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有影響。所以，本實(shí)驗(yàn)的可信度較高。圖3-2鴨蛋參數(shù)統(tǒng)計(jì)圖從圖3-2中可可發(fā)現(xiàn)基本上鴨蛋的破損率維持在比較平穩(wěn)的水平，對(duì)實(shí)驗(yàn)精確性無(wú)影響。圖3-3鴨蛋的受精率從（圖3-3）可得出鴨蛋的受精率與氣溫有關(guān)。在炎熱的夏季受精率在55%左右，當(dāng)天氣轉(zhuǎn)涼時(shí)受精率呈上升趨勢(shì)。得出秋季櫻桃谷鴨受精率高于夏季。3.2切片制備結(jié)果3.2.1注射MC后第35天（一周齡）時(shí)雛鴨胎性腺組織的變化（圖3-4，圖3-5，圖3-6圖3-4對(duì)照組和注射0.01μg/egg組卵巢橫切的比較圖圖3-5對(duì)照組與注射0.1μg/egg卵巢橫切比較圖（圖3-5圖中a：初級(jí)卵母細(xì)胞，b：卵泡帶，c：原始卵泡，d：透明帶）上兩圖為一周齡雛鴨卵巢橫切圖，紫色（深色）部分為管壁細(xì)胞核，紅色（淺色）部分為細(xì)胞質(zhì)，中間空白部分為管腔。對(duì)照組中初級(jí)卵母細(xì)胞之間排列緊密，卵泡內(nèi)透明帶小。而藻毒素處理后實(shí)驗(yàn)組各卵母細(xì)胞間排列變得稀疏，并且隨著MC濃度的升高，卵泡內(nèi)透明帶有呈增多增大趨勢(shì)。如圖所示，0.1ug/egg的透明帶明顯多于0.01ug/egg和對(duì)照組。有的也不是很明顯。：圖3-6實(shí)驗(yàn)樣本與資料樣本比較圖初級(jí)卵泡中央為一個(gè)初級(jí)卵母細(xì)胞a，周?chē)粚踊蚨鄬勇雅菁?xì)胞常位于皮質(zhì)淺部。卵巢皮質(zhì)是卵巢的主要部分，呈杯狀包圍著狹小的髓質(zhì)區(qū)。皮質(zhì)有不同數(shù)量的卵泡和黃體，其間為梭形的成纖維細(xì)胞及網(wǎng)狀纖維。卵巢由皮質(zhì)和髓質(zhì)組成。圖3-6對(duì)照組與0.01圖3-6對(duì)照組與0.01μg/eggMC濃度，0.1μg/eggMC濃度對(duì)一周齡雛鴨睪丸曲精管橫切對(duì)比圖（均為400X）左圖是雛鴨睪丸曲細(xì)精管橫切圖，管狀圓圈表示曲細(xì)精管，紫色（深色）部分為曲細(xì)精管管壁細(xì)胞核，紅色（淺色）部分為曲細(xì)精管管壁細(xì)胞質(zhì)，中間空白部分為管腔。對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，隨MC濃度加大出現(xiàn)曲細(xì)精管萎縮、組織脫落、堵塞管腔、曲細(xì)精管內(nèi)細(xì)胞減少、排列紊亂，提示MC-dLR可能破壞睪丸結(jié)構(gòu)，影響睪丸功能。隨著藻毒素濃度的增加其性腺管腔空隙也相應(yīng)的有所縮小，但有的不是很明顯。4.討論目前淡水藻類(lèi)可分為8門(mén)：藍(lán)藻、綠藻、硅藻、甲藻、隱藻、裸藻、金藻和黃藻，而其中藍(lán)藻是產(chǎn)毒最多的一門(mén)。一個(gè)藻種可以產(chǎn)生多種毒素，一種毒素也可由多個(gè)藻種產(chǎn)生。經(jīng)前人研究得到MC主要是山微囊藻、水花魚(yú)腥藻、束絲藻及顫藻產(chǎn)生，其結(jié)構(gòu)為單環(huán)七肽。并發(fā)現(xiàn)肝臟是MC的主要靶器官，這己被動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和流行病學(xué)調(diào)查所證實(shí)，因此，我們需要了解此類(lèi)毒素。微囊毒素對(duì)動(dòng)物的毒害程度主要與水華密度、水華毒素含量有關(guān)，也與動(dòng)物種類(lèi)和大小有關(guān)[11]。經(jīng)研究單胃動(dòng)物對(duì)于MC沒(méi)有動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)來(lái)的敏感。會(huì)產(chǎn)毒的藻類(lèi)生長(zhǎng)會(huì)降低水質(zhì)，藻細(xì)胞破裂后釋放出毒素，增加了人和動(dòng)物接觸毒素的風(fēng)險(xiǎn)。多種生物如鳥(niǎo)類(lèi)(包括家禽和水禽)、寵物和牲畜、猴子等接觸微囊藻毒素后都表現(xiàn)出中毒現(xiàn)象。其中毒癥狀主要有昏迷、肌肉痙攣、呼吸急促、腹瀉甚至在數(shù)小時(shí)至數(shù)天內(nèi)死亡[12]。故微囊藻毒素的危害必須引起高度關(guān)注。在其中雖然浮游動(dòng)物和魚(yú)類(lèi)對(duì)MC有較大的耐受性，但毒素會(huì)在其體內(nèi)積累和產(chǎn)生放大效應(yīng)，達(dá)到相當(dāng)高的濃度，通過(guò)食物連對(duì)人類(lèi)健康造成潛在的危害。有資料表明，淡水蚌類(lèi)是淡水環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)種群，經(jīng)常被人們捕食，但它們能夠蓄積肝毒性物質(zhì)MC[13]，人類(lèi)食用此類(lèi)蚌類(lèi)攝入毒素，所以它們?cè)斐傻奈：Σ蝗莺鲆暋Ｓ袑?shí)驗(yàn)表明用I125標(biāo)記MC，分別經(jīng)腹腔、口腔和靜脈注入小鼠體內(nèi)，有70%以上的毒素分布在肝臟和腎臟。也已驗(yàn)證MC在靶器官內(nèi)主要定位于肝細(xì)胞核內(nèi)和腎皮質(zhì)區(qū)域的腎細(xì)胞核內(nèi)[14]。在一種蚌中，MC主要分布于肝胰腺中，其次是鰓和肌肉中，在性腺和消化道中也發(fā)現(xiàn)了微量的MC。表明MC亦可在水生生物性腺中富集。最近，研究人員也發(fā)現(xiàn)微囊藻毒素能在無(wú)脊椎動(dòng)物性腺中大量累積，微囊藻毒素還可在卵中大量存在并傳遞到后代[15]。因此，微囊藻毒素對(duì)包括人類(lèi)在內(nèi)的哺乳動(dòng)物生殖的影響應(yīng)該受到關(guān)注和重視。有關(guān)微囊藻毒素的這一致害機(jī)理尚不完全清楚，有待進(jìn)一步的研究。本實(shí)驗(yàn)采用微囊藻毒素處理鴨胚，借助石蠟切片技術(shù)用于觀察正常性腺細(xì)胞組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，對(duì)比病變的以及受微囊藻毒素影響的性腺組織細(xì)胞是研究、觀察及判斷細(xì)胞組織的形態(tài)變化的主要方法，同時(shí)HE染色主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核糖體著紫藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)紅色，兩者相結(jié)合可以很好的觀察組織或細(xì)胞的一般形態(tài)及特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)分別用1μg/egg，0.1/μg/egg，0.01μg/egg三種劑量的MC來(lái)處理種蛋，通過(guò)對(duì)比觀察對(duì)照組發(fā)現(xiàn)隨MC濃度加大出現(xiàn)曲細(xì)精管萎縮、組織脫落、堵塞管腔、曲細(xì)精管內(nèi)細(xì)胞減少、排列紊亂，隨著藻毒素濃度的增加其性腺管腔空隙也相應(yīng)的有所縮小，但有的不是很明顯。提示了MC-LR可能破壞睪丸結(jié)構(gòu)，影響睪丸功能。而藻毒素處理后實(shí)驗(yàn)組各卵母細(xì)胞間排列變得稀疏，并且隨著MC濃度的升高，卵泡內(nèi)透明帶有呈增多增大趨勢(shì)，提示MC-LR可能影響卵巢結(jié)構(gòu)[16]。本文通過(guò)石蠟切片和HE染色觀察得出MC對(duì)于一周齡鴨胚性腺發(fā)育有一定的影響。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)由于三日齡的鴨胚可在鴨蛋中浮動(dòng)，如果長(zhǎng)時(shí)間將打孔過(guò)的鴨蛋放置而未對(duì)其進(jìn)行藻毒素的注射，胚胎會(huì)浮游到打孔處，此時(shí)在對(duì)鴨蛋注射藻毒素可能會(huì)破壞鴨胚組織[17]，導(dǎo)致注射后死亡率成倍的上升，而不能確定是否是濃度過(guò)高造成的死亡，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生誤導(dǎo)，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。16μg/egg，8μg/egg，3μg/egg，1μg/egg均對(duì)鴨胚造成致死性影響。死亡率隨濃度升高而增加。由于一周齡鴨胚組織過(guò)大，造成包埋與切片上的不便，故使制成的片子有組織裂開(kāi)的情況，在一定程度上影響了觀察。本實(shí)驗(yàn)不管在鴨胚的發(fā)育階段、統(tǒng)計(jì)鴨胚的死亡率，還是在分析曲精管組織學(xué)上的變化均設(shè)置了實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，通過(guò)反復(fù)比較以及統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件的應(yīng)用確定實(shí)驗(yàn)最佳方案，從而減少實(shí)驗(yàn)誤差，確保了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。對(duì)MC的研究目前主要是集中在其對(duì)各器官的毒性作用上，以后的工作將集中在進(jìn)一步明確其致病機(jī)制、在各飲水體系中建立有效的藻毒素監(jiān)測(cè)體制、尋找有效的生物標(biāo)志物以及在臨床上找到有效的防治藻毒素中毒的方法。5.總結(jié)與展望雖然MC的研究歷史已近百年，而且也取得了很多有價(jià)值的研究成果，但在MC的產(chǎn)生機(jī)理、毒素的功能以及毒理學(xué)等方面尚有很多值得深入探討的問(wèn)題。關(guān)于MC產(chǎn)生機(jī)理研究是目前的熱點(diǎn)，究竟MC的產(chǎn)生是受遺傳控制還是環(huán)境因子左右，研究者各持己見(jiàn)，尚無(wú)定論。我國(guó)對(duì)MC的研究起步較晚，調(diào)查MC的污染狀況，尤其是保健品，水產(chǎn)食品中MC的污染狀況，另外慢性、亞慢性暴露于MC所引起的危害，應(yīng)引起足夠的重視[18-19]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)水禽胚胎（鴨胚）獨(dú)特的發(fā)育系統(tǒng)的研究初步證實(shí)了微囊藻毒素對(duì)動(dòng)物性腺具有一定的毒性效應(yīng)。但對(duì)于其致毒機(jī)理尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)[1]何振榮,俞敏娟,何家芡.銅綠微囊藻毒株M.8641的毒素生物化學(xué)雜志[J].1993,9:168-172[2]俞家祿,陳明慧,林坤二,等.武漢東湖藍(lán)藻水華毒性的研究[J].淡水藍(lán)藻毒性的檢測(cè)水生生物學(xué)報(bào),1987,11(3):11-21[3]CoddGA.DetectionMethodsforCyanobacterialToxins.Cambridge:TheRoyalSocietyofChemistry,1994,90-99.[4]于明.北京師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2001,37(5):680-6845[5]樊有賦,詹壽發(fā),甘金蓮,等.微囊藻毒素的危害及其防治[J].生命的化學(xué),2008,28(1):101-103[6]PouriaS,AndradeA,BarbosaJ,etal.FatalmicrocystinintoxicationinhaemodialysisunitinCaruaru.Brazil[J].TheLancet,1998,352:21-26[7]徐立紅.微囊藻毒素致毒機(jī)理研究及一種新生分子生態(tài)毒理學(xué)指標(biāo)的建立和應(yīng)用[J].中科院水生生物研究所博士論文,1997[8]AralldaRodriguezR,KubwaboC,BenoitFM.Extrationof15microcystinsandnodularinusingimmunoamnitycolumns[J].Toxicon,2003,42(6):587-599[9]CHENJ,XIEP,GUOL,etal.Tissuedistributionsandseasonaldynamicsofthehepatotoxicmicrocystins2LRand2RRinafreshwatersnail(Bellamyaaeruginosa)fromalargeshallow,eutrophiclakeofthesubtropicalChina[J].EnvironPollut,2005,134(3):423-430[10]ZeguraB,ZajcI,LahTT,FilipicM.Patternsofmicrocystin-LRinducedalt