乙肝表面抗原定量測(cè)定的方法學(xué)驗(yàn)證

乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法學(xué)驗(yàn)證姓名ZP學(xué)號(hào)0925400072班級(jí)09級(jí)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)本科二班指導(dǎo)老師沈富兵二〇一三年四月

乙肝表面抗原定量測(cè)定的方法學(xué)驗(yàn)證作者：ZP（成都醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院09級(jí)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)本科二班，610500）【摘要】

目的用福州藍(lán)圖生物工程有限公司出品的乙肝表面抗原ELISA法定量分析試劑盒對(duì)乙肝表面抗原定量測(cè)定的方法進(jìn)行驗(yàn)證，以判斷是否能用于教學(xué)以及臨床分析。方法運(yùn)用ELLISA法定量測(cè)定乙肝表面抗原，應(yīng)用試劑盒HBsAg標(biāo)準(zhǔn)從濃度為8ng/ml的2倍稀釋的6個(gè)濃度梯度，根據(jù)OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線再計(jì)算相對(duì)回收率和板內(nèi)和板間精密度，通過資料數(shù)據(jù)綜合分析。結(jié)果HBsAg線性較好，其準(zhǔn)確度、精密度、LOD值均在正常范內(nèi)。結(jié)論ELISA法定量檢測(cè)HBsAg能較準(zhǔn)確、快速地反映體內(nèi)乙肝病毒復(fù)制情況，可以用于教學(xué)以及臨床分析?！娟P(guān)鍵詞】

乙肝表面抗原方法學(xué)驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)曲線精密度ELLISA病毒性肝炎中乙型肝炎的危害較大，我國(guó)是病毒性乙型肝炎的高發(fā)流行區(qū)，普通人群的乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染率接近60％，約占世界HBV攜帶者的1/3。乙型肝炎病毒的病原體不僅具有傳染性，還可能導(dǎo)致發(fā)展成肝硬化，甚至肝癌，所以乙型肝炎病毒的早期、準(zhǔn)確、定量檢測(cè)對(duì)乙型肝炎臨床診斷、療效觀察及預(yù)防具有重要的意義。酶免分析法HBV—EIA是HBV抗原和抗體最常用的檢測(cè)技術(shù)，其方法簡(jiǎn)便、價(jià)廉，適合一般實(shí)驗(yàn)室推廣，其中酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)目前應(yīng)用最為廣泛，它常用聚苯乙烯為固相載體，使其與待測(cè)標(biāo)本中的相應(yīng)抗體或抗原結(jié)合，然后加酶標(biāo)記的抗原或抗體，再加底物顯色，最后根據(jù)色澤深淺來(lái)推算待測(cè)抗原或抗體的含量。此方法特異性高，有效測(cè)定范圍可達(dá)到20500ng/ml，且酶免疫法有標(biāo)記的試劑比較穩(wěn)定并且無(wú)放射線危害等優(yōu)點(diǎn)。我們采用對(duì)已知抗體濃度的樣品進(jìn)行ELISA的定量檢測(cè)，通過對(duì)其數(shù)據(jù)的分析來(lái)驗(yàn)證ELISA法最乙肝表面抗原定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性，以衡量其實(shí)用性。1材料與方法1.1材料1.1.1試劑盒乙肝表面抗原ELISA法定量分析試劑盒，福州藍(lán)圖生物工程有限公司出品。1.1.2儀器及酶標(biāo)板酶標(biāo)儀：Bio-Rad680；洗板機(jī)：Bio-Rad1575；超純水系統(tǒng)：MilliporeElix；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9052):上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。1.1.3溶液配制=1\*GB2⑴0.01MpH7.4的PBS緩沖液：稱取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4,溶于800ml蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，最后加蒸餾水定容至1L即可。=2\*GB2⑵質(zhì)控品：用PBS緩沖液將標(biāo)準(zhǔn)品配制成6、3、1.5ng/ml三個(gè)質(zhì)控品，每質(zhì)控品1ml。首先取450μl的8ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品到C1號(hào)EP管中再向其中加入150μl的PBS緩沖液，即配制成了6ng/ml的質(zhì)控品，再取300μlC1號(hào)EP管內(nèi)的溶液到C2號(hào)EP管內(nèi)，再向C2號(hào)管內(nèi)加入300μl的緩沖液混勻。即配制成了3ng/ml的質(zhì)控品。接著取300μlC2號(hào)管內(nèi)的液體到C3號(hào)EP管內(nèi)，再加入300μl的緩沖液混勻，即配制成了1.5ng/ml的質(zhì)控品。具體方法如下圖1C23C23ng/mlC1C16ng/mlC31.5ng/ml圖11.2檢測(cè)方法1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度的配制=1\*GB2⑴用PBS緩沖液將標(biāo)準(zhǔn)品配制成8、4、2、1、0.5、0.25ng/ml。=2\*GB2⑵先取6個(gè)EP管分別標(biāo)記為對(duì)應(yīng)的濃度。=3\*GB2⑶取400μl標(biāo)準(zhǔn)品于標(biāo)記為的EP管中，再取200μl號(hào)管內(nèi)液體于號(hào)管內(nèi)再向號(hào)管中加入200μl的緩沖液混勻，即配制成了濃度為4ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品。=4\*GB2⑷再?gòu)奶?hào)管內(nèi)取200μl的液體到號(hào)管內(nèi)，接著取200μl的緩沖液到號(hào)管內(nèi)混勻，即配制成了2ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品。=5\*GB2⑸從號(hào)管內(nèi)取200μl的標(biāo)準(zhǔn)品到④號(hào)管內(nèi)，再向④號(hào)管內(nèi)加入200μl的緩沖液混勻，即配制成了1ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品。=6\*GB2⑹用同樣的方法，配制好濃度分別為0.5ng/ml、0.25ng/ml.的標(biāo)準(zhǔn)品體積分別為200μl、200μl、400μl備用。具體方法如下圖2S60.25ng/mlS50.5ng/mlSS60.25ng/mlS50.5ng/mlS41ng/mlS32ng/mlS24ng/mlS18ng/ml圖21.2.2測(cè)定方法=1\*GB2⑴取出試劑盒中已包被酶標(biāo)板，取出板條，在相應(yīng)孔中加入已配制好的系列標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品及空白對(duì)照；88631.5EQ\o\ac(○,-)44631.5EQ\o\ac(○,-)22631.5EQ\o\ac(○,-)11631.5EQ\o\ac(○,-)0.50.5631.5EQ\o\ac(○,-)0.250.25EQ\o\ac(○,-)EQ\o\ac(○,-)EQ\o\ac(○,-)EQ\o\ac(○,-)EQ\o\ac(○,-)EQ\o\ac(○,-)EQ\o\ac(○,-)EQ\o\ac(○,-)EQ\o\ac(○,-)圖3注：雙線框區(qū)域?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)品,濃度依次為8、4、2、1、0.5、0.25ng/ml，三線框區(qū)域?yàn)橘|(zhì)控品，濃度依次為6、3、1.5ng/ml，粗框區(qū)域?yàn)榭瞻讓?duì)照加入的是PBS緩沖液，每個(gè)孔內(nèi)加入的均是50μl。=2\*GB2⑵37℃溫育30min，洗板4次；=3\*GB2⑶加入酶標(biāo)抗體，生物素二抗，50μl/孔；=4\*GB2⑷37℃溫育30min，洗板4次；=5\*GB2⑸加入A、B液，50μl/孔，37℃溫育15分鐘；=6\*GB2⑹加入終止液，50μl/孔。1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及結(jié)果計(jì)算=1\*GB2⑴酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀，蓋上蓋子；=2\*GB2⑵在電腦上打開MicroplateManager5.2軟件；=3\*GB2⑶選擇450nm波長(zhǎng)（參照波長(zhǎng)630nm），設(shè)置LAYOUT和報(bào)告模式，測(cè)定各孔吸收值；=4\*GB2⑷輸入標(biāo)準(zhǔn)品各濃度值，以雙對(duì)數(shù)法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲取各孔的濃度值，打印標(biāo)準(zhǔn)曲線圖和計(jì)算結(jié)果。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用MicrosoftExcel處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。2結(jié)果2.1測(cè)得的OD值如下表1.73901.63801.08500.69200.33800.01500.88400.88801.21700.67400.35300.00900.53600.50901.21800.65600.33800.01000.27200.26001.23300.67400.34700.00900.14900.13801.24800.69600.34300.01200.06200.07100.00900.01200.00200.00900.00900.01100.00900.01100.0100圖4注：圖4與圖3相對(duì)應(yīng)2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線圖5由上圖可得出如下結(jié)論：標(biāo)準(zhǔn)曲線以濃度為橫坐標(biāo)，以測(cè)得的OD值為縱坐標(biāo)。由對(duì)應(yīng)濃度和OD值得出的散點(diǎn)連成一條直線后，散點(diǎn)基本都在直線上，說明散點(diǎn)的線性非常好。在以后檢測(cè)乙肝表面抗原濃度的時(shí)候可以根據(jù)測(cè)出的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出對(duì)應(yīng)的濃度。2.3準(zhǔn)確度（回收率）計(jì)算各質(zhì)控品高中低三個(gè)濃度平均回收率分別為92.59%、100.887%、93.68%都在正常范圍內(nèi)如表1所示。ELISA法檢測(cè)VEGFR2-Fc的回收率準(zhǔn)確度（回收率）計(jì)算VEGFR2-Fc(ng/ml)測(cè)定值(ng/ml)回收率(%)平均回收率RR(%)SD(%)64.99883.392.595.3065.63793.9565.64294.03365.71595.2565.78796.4533.093103.1100.8872.6033.005100.16732.91897.26733.005100.16733.112103.7331.51.37791.893.682.071.51.45096.6671.51.3772194.7331.51.40193.4表12.4精密度計(jì)算2.4.1板內(nèi)精密度板內(nèi)精密度質(zhì)控品各濃度組的RSD都小于15%，精密度良好，如表2所示。板內(nèi)精密度VEGFR2-Fc（ng/ml）測(cè)定值1測(cè)定值2測(cè)定值3測(cè)定值4測(cè)定值5RSD(%)64.9985.6375.6425.7155.7875.694±0.3185.58533.0933.0052.9183.0053.1123.027±0.0782.5771.51.3771.4501.3771.4211.4011.405±0.0312.210表22.4.2板間精密度板間各組濃度質(zhì)控品RSD都小于15%，說明板間精密度達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。如表3所示。板間精密度VEGFR2-Fc（ng/ml）測(cè)定值測(cè)定值測(cè)定值測(cè)定值測(cè)定值RSD(%)64.9985.6375.6425.7155.7875.694±0.3185.58565.4715.4235.6745.3235.7465.5274±0.1773.20265.7735.6745.7825.5475.6675.689±0.0961.68733.0933.0052.9183.0053.1123.027±0.0782.57732.8153.3353.1873.2212.9333.098±0.2166.97232.8863.3443.1183.2342.9973.116±0.1825.8411.51.3771.4501.3771.4211.4011.405±0.0312.2101.51.2261.2571.2271.5641.3341.322±0.14210.7411.51.6651.2431.2361.5411.3201.401±0.19213.704表32.5檢測(cè)限（LOD）計(jì)算：取空白孔的OD值的均數(shù)加2倍標(biāo)準(zhǔn)差。空白孔的OD值的均數(shù)=0.0098空白孔的OD值的標(biāo)準(zhǔn)差=0.0028LOD=0.0098+2*0.0028=0.01543討論通過圖4、圖5和表1、表2、表3可知本次實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度、板內(nèi)精密度、板間精密度、LOD值都復(fù)合實(shí)際，且各數(shù)據(jù)都趨于理想，對(duì)此我們做出分析：HBsAg是乙肝病毒感染后最早出現(xiàn)的血清標(biāo)志物之一，因此HBsAg的檢測(cè)是診斷肝炎病毒感染的重要依據(jù)。而針對(duì)這項(xiàng)檢測(cè)的檢測(cè)方法的靈敏度與高特異性的高低以及二者的結(jié)合程度是影響檢驗(yàn)結(jié)果的重要因素，直接關(guān)系到臨床診斷和用藥，所以對(duì)HBsAg的檢測(cè)方法的建立和方法的驗(yàn)證是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵所在。本實(shí)驗(yàn)以HBsAg測(cè)定為例，為了對(duì)乙肝表面抗原ELISA法定量進(jìn)行分析的方法學(xué)建立與驗(yàn)證，以確認(rèn)ELISA法定量檢測(cè)HBsAg能否較準(zhǔn)確、快速地反映體內(nèi)乙肝病毒復(fù)制情況。按試劑說明書嚴(yán)格操作的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。本實(shí)驗(yàn)用的試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被人乙肝病毒表面抗原（HBsAg）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過溫浴并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人乙肝病毒表面抗原（HBsAg）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按試劑說明書操作的同時(shí)運(yùn)用計(jì)算機(jī)軟件和酶標(biāo)儀，測(cè)得了OD值且繪制出了標(biāo)準(zhǔn)曲線。本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA），通過倍比稀釋來(lái)完成其定量檢測(cè)。其中，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度依次為：8、4、2、1、0.5、0.25ng/ml，每個(gè)濃度設(shè)置兩個(gè)孔，共十二個(gè)孔；質(zhì)控品的濃度依次為:6、3、1.5ng/ml，每個(gè)濃度設(shè)置五個(gè)孔，共十五個(gè)孔。往標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，而陰性對(duì)照加入等量PBS,經(jīng)過溫浴并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算質(zhì)控品的準(zhǔn)確度、板內(nèi)精密度、板間精密度、LOD值。本實(shí)驗(yàn)是設(shè)計(jì)精密，操作簡(jiǎn)便、快捷。主要是通過對(duì)質(zhì)控品的準(zhǔn)確度、板內(nèi)精密度、板間精密度、LOD值的計(jì)算和根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以確認(rèn)ELISA法定量檢測(cè)HBsAg能否較準(zhǔn)確、快速地反映體內(nèi)乙肝病毒復(fù)制情況。如圖5所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.9985，接近于1，即相關(guān)性良好。方法準(zhǔn)確度(accuracy)，一般用相對(duì)回收率表示，表明用該方法測(cè)得的生物樣品中待測(cè)藥物的濃度與其真實(shí)濃度的接近程度，由表1可得出相對(duì)回收率符合參考值85%～115%，所以該測(cè)定方法比較準(zhǔn)確。方法精密度(precision)，一般用RSD表示，對(duì)于ng／ml級(jí)水平的RSD一般應(yīng)≤15％。由表2板內(nèi)精密度和表3板間精密度可知，板內(nèi)精密度完全符合要求，板間精密度基本符合要求。檢測(cè)限LOD，又稱方法的靈敏度，由計(jì)算得LOD=0.0154，說明本分析方法對(duì)于低濃度樣品的檢測(cè)靈敏度高。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查,我國(guó)人群乙型病毒肝炎感染率達(dá)10%左右,乙肝的實(shí)驗(yàn)診斷對(duì)于其治療及預(yù)防有重要參考意義。ELLISA適用于乙肝表面抗原的定量測(cè)定,其優(yōu)點(diǎn)是快速、方便、操作簡(jiǎn)單,且靈敏度相對(duì)于其他方法較高,自20世紀(jì)70年代以來(lái),許多高靈敏度的測(cè)定方法應(yīng)用于臨床免疫學(xué)檢測(cè),特別是酶聯(lián)免疫法(ELLISA法)應(yīng)用最廣，其解決了低濃度HBsAg的定量檢測(cè)問題,能夠及時(shí)有效的測(cè)定出乙肝表面抗原含量，對(duì)臨床診