微軟用戶-酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法-CDESIGNL 9952608課件

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法

免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)基本原理它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接，然后通過(guò)酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測(cè)定。測(cè)定的對(duì)象可以是抗體也可以是抗原。在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）②酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）③酶作用的底物（顯色劑）實(shí)驗(yàn)器材和藥品固相載體在ELISA測(cè)定過(guò)程中作為吸附劑和容器。最常用的是聚苯乙烯和聚氯乙烯。它們有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來(lái)的免疫學(xué)活性。

微量滴定板，量滴定板為8×12的96孔式。ELISA板的特點(diǎn)是可以同時(shí)進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測(cè)，并可在特制的比色計(jì)上迅速讀出結(jié)果。聚苯乙烯經(jīng)射線照射后，其吸附性增加。

酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用。在ELISA中，常用的酶為辣根過(guò)氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)和堿性磷

酸酶(alkalinephosohatase,AP)。陽(yáng)性對(duì)照品(positivecontrol)和陰性對(duì)照品(negativecontrol)陰性對(duì)照品須先行檢測(cè)，確定其中不含待測(cè)物質(zhì)。陽(yáng)性對(duì)照品在含蛋白保護(hù)劑的緩沖液中加入一定量的待檢物質(zhì)，含量約為最低檢測(cè)敏感度的10~20倍。實(shí)驗(yàn)方法:

1.加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時(shí)。然后洗滌。(同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔)。

2.加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小時(shí)，洗滌。

3.加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。

4.終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。

5.結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺。也可測(cè)O·D值：在ELISA檢測(cè)儀