食品微生物檢驗復(fù)習(xí)整理

食品微生物檢驗復(fù)習(xí)整理第一章緒論第一節(jié)食品微生物檢驗的意義1、食品微生物檢驗定義：應(yīng)用微生物學(xué)的理論與方法，研究外界環(huán)境和食品中微生物的種類、數(shù)量、性質(zhì)、活動規(guī)律及其對人和動物健康的影響。2、食品微生物檢驗的特點（1）研究對象及范圍廣（2）涉及學(xué)科多樣（3）實用性及應(yīng)用性強（4）采用標(biāo)準(zhǔn)化3、食品微生物檢驗方法為食品監(jiān)測必不可少的重要組成部分（原因）——它是衡量食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，也是判定被檢食品能否食用的科學(xué)依據(jù)之一。——通過食品微生物檢驗，可以判斷食品加工環(huán)境及食品衛(wèi)生情況，能夠?qū)κ称繁患?xì)菌污染的程度作出正確的評價，為各項衛(wèi)生管理工作提供科學(xué)依據(jù)，提供傳染病和人類、動物的食物中毒的防治措施?！称肺⑸餀z驗是以貫徹“預(yù)防為主”的衛(wèi)生方針，可以有效地防止或者減少食物中毒和人畜共患病的發(fā)生，保障人民的身體健康；同時，它對提高產(chǎn)品質(zhì)量，避免經(jīng)濟損失，保證出口等方面具有政治上和經(jīng)濟上的重大意義。4、食品微生物檢驗的目的：為生產(chǎn)出安全、衛(wèi)生、符合標(biāo)準(zhǔn)的食品提供科學(xué)依據(jù)。食品微生物檢驗的內(nèi)容和范圍內(nèi)容——食品加工過程：食品生產(chǎn)環(huán)境；原料、加工過程；成品運輸；保存——微生物的對象：各種指標(biāo)菌的生物學(xué)特性、各種指標(biāo)菌常規(guī)檢驗方法——食品的對象：每種食品的常見微生物；樣品的采集、處理、檢驗的方法和程序；有關(guān)材料和用品2、范圍：——生產(chǎn)環(huán)境的檢驗：車間用水空氣地面墻壁——原輔料檢驗：食用動物、果蔬谷物添加劑——食品加工、儲藏、銷售諸環(huán)節(jié)的檢驗：食品從業(yè)人員的衛(wèi)生狀況、加工工具、運輸車輛、包裝材料——食品的檢驗：出廠食品、可疑食品、食物中毒食品的檢驗食品微生物檢驗的指標(biāo)1、我國衛(wèi)生部頒布的食品微生物指標(biāo)有：菌落總數(shù)；大腸菌群；致病菌?！ぁぞ淇倲?shù)（AerobicPlateCount）：是指食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下（如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間）培養(yǎng)后，所得每g（mL）檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)。意義：是判斷食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要依據(jù)之一。（1）可以反應(yīng)食品的新鮮度。（2）可以反應(yīng)食品被細(xì)菌污染的程度。（3）生產(chǎn)過程中食品是否變質(zhì)。（4）食品生產(chǎn)的一般衛(wèi)生狀況等。··大腸菌群（ColiformBacteria）：包括大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌的一些中間類型的細(xì)菌。這些細(xì)菌是寄居于人及溫血動物腸道內(nèi)的常居菌，它隨著大便排出體外。食品中如果大腸菌群數(shù)越多，說明食品受糞便污染的程度越大。意義：以大腸菌群作為糞便污染食品的衛(wèi)生指標(biāo)來評價食品的質(zhì)量，具有廣泛的意義?！ぁぶ虏【杭茨軌蛞鹑藗儼l(fā)病的細(xì)菌。對不同的食品和不同的場合，應(yīng)選擇一定的參考菌群進行檢驗?！ぁっ咕捌涠舅赜泻芏嗝咕軌虍a(chǎn)生毒素，引起疾病，故應(yīng)該對產(chǎn)毒霉菌進行檢驗。第四節(jié)食品微生物檢驗的發(fā)展（一）致病菌檢測階段微生物從不知到知的過程：釀酒、列文虎克、巴斯德、科赫1、釀酒2、列文虎克：自制顯微鏡，微生物世界3、巴斯德——徹底否定了自然發(fā)生說——證實發(fā)酵由微生物引起——免疫學(xué)—預(yù)防接種——發(fā)明巴氏消毒法（減毒疫苗、炭疽桿菌、狂犬病疫苗）4、科赫培養(yǎng)出炭疽桿菌、霍亂弧菌、結(jié)核桿菌等病原微生物第一次用科學(xué)的方法證明某種特定的微生物是某種特定疾病的病原。“科赫原則”：（1）為了證明某一種細(xì)菌是某一疾病的病因，必須在這種疾病的所有病例中都發(fā)現(xiàn)有這種細(xì)菌；（2）然后，必須將這種細(xì)菌從病體中完全分離出來，在體外培養(yǎng)成純菌種；（3）這種純菌種，經(jīng)過接種后，必須能將疾病傳給健康的動物；（4）按上面規(guī)定的方法接種過的動物身上，必須取得同樣的細(xì)菌，然后，在動物體外，再次培養(yǎng)出這種純菌種。（二）指示菌檢測階段1、指示菌又稱指標(biāo)菌，是常規(guī)安全衛(wèi)生監(jiān)測中，可以用以指示檢品（檢驗樣品）衛(wèi)生狀況及安全性的指示性微生物2、常規(guī)檢驗指示菌的目的：主要是以安全衛(wèi)生指示菌在檢品中存在與否以及數(shù)量多少為依據(jù)，對照國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，對檢品的飲用、食用或使用的安全性作出評價。3、指示菌可分為三種類型：——第一種類型的指示菌是為了評價被檢樣品的一般衛(wèi)生質(zhì)量、污染程度以及安全性，最常用的是菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)?！诙N類型是特指糞便污染指示菌，主要是大腸菌群，其他還有腸球菌、亞硫酸鹽還原梭菌等。它們的檢出標(biāo)志著檢品受過人、畜糞便的污染，而且有腸道病原微生物存在的可能性。——第三種類型是其他指示菌，包括某些特定環(huán)境中不能檢出的菌類，如特定菌、某些致病菌或其他指示性微生物。這些指示菌在不同樣品中有不同含義。（三）微生態(tài)制劑檢測階段1、與人體共生的厭氧菌是人體存在的主要微生物菌群之一。生態(tài)平衡時，與人體“和平共處”，成為人體抵抗疾病的第一道防線；生態(tài)失調(diào)時，成為人體感染的主要條件致病菌，形成厭氧菌感染癥。微生態(tài)制劑：以調(diào)節(jié)生態(tài)平衡為目的，主要是乳酸菌、雙歧桿菌，檢測其主要菌株的特性和數(shù)量就成了20世紀(jì)末食品微生物檢測的一項重要內(nèi)容。（四）現(xiàn)代基因工程菌和尚未能培養(yǎng)菌的檢測致病性大腸桿菌、雙歧腸桿菌蛋白病毒和嗜抗生素菌、加工處理受損暫時不能繁殖的菌體、目前條件尚不能培養(yǎng)的微生物等，這方面對食品微生物檢驗技術(shù)提出了挑戰(zhàn)現(xiàn)代食品微生物檢測在快速酶促反應(yīng)及代謝產(chǎn)物的檢測、免疫學(xué)方法檢測抗原或抗體技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)檢測食源性病原菌和微生物檢測的自動化系統(tǒng)等方面得到了迅速發(fā)展，這也是食品微生物學(xué)檢測的未來發(fā)展趨勢。第二章檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識第一節(jié)良好的實驗室操作規(guī)范FDA：美國食品及藥物管理局GLP：良好的實驗室操作規(guī)范一、GLP的主要目的：是嚴(yán)格控制化學(xué)品安全性評價試驗的各個環(huán)節(jié)，即嚴(yán)格控制可能影響實驗結(jié)果準(zhǔn)確性的各種主客觀因素，降低試驗誤差，確保實驗結(jié)果的真實性。二、GLP的內(nèi)容目標(biāo)和范圍任務(wù)和職責(zé)人員項目計劃，協(xié)議和程序，以及GLP研究的實施設(shè)備材料檢測系統(tǒng)儀器培訓(xùn)，教育和經(jīng)驗文件和記錄項目報告審核糾正措施/預(yù)防措施持續(xù)改進在資助和合同下進行的研究內(nèi)容概要：實驗設(shè)施、人員管理、標(biāo)準(zhǔn)操作（SOP）、監(jiān)督體制第二節(jié)檢驗技術(shù)基本原則和要求一、基本原則1.質(zhì)量原則該原則要求檢測檢驗技術(shù)保證檢測質(zhì)量，方法成熟、穩(wěn)定，具有較高的精密度、準(zhǔn)確度和良好的選擇性，從而確保實驗數(shù)據(jù)和結(jié)論的科學(xué)性、可信性和重復(fù)性。2.安全原則該原則要求檢測檢驗技術(shù)所使用的方法不應(yīng)對操作人員造成危害及環(huán)境污染或形成安全隱患。3．快速原則4．可操作原則操作必須簡單明確，具有基本專業(yè)基礎(chǔ)的人員經(jīng)過短期培訓(xùn)都可以理解和掌握。5．經(jīng)濟原則該原則要求食品安全快速檢測方法所要求的條件易于達(dá)到，以便方法的推廣普及。二、檢測技術(shù)操作的一般要求1．檢驗方法中所采用的名詞及單位制，均應(yīng)該符合國家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)要求。2．檢驗方法中所使用試劑均為分析純，所使用水為純度能滿足分析要求的蒸餾水或軟化水或其他相當(dāng)純度的水，除非特別聲明。3．檢驗中所用計量器具必須按國家規(guī)定及規(guī)程計量和校正。4．稱取量取精度要求用數(shù)值的有效數(shù)位表示。其中準(zhǔn)確稱取系指用精密天平進行的稱量操作，其精度為土0.0001g；吸取系指用移液管、刻度吸量管取液體物質(zhì)的操作。5．檢驗有關(guān)要求：(1)檢驗時必須做空白試驗。(2)檢驗時必須做平行試驗。6．檢驗方法的選擇：同一檢驗項目，如有兩個或兩個以上檢驗方法時，可根據(jù)不同條件選擇使用。但必須以國家標(biāo)準(zhǔn)(GB)方法的第一法為仲裁方法。7．采樣必須注意樣品的生產(chǎn)日期、批號、代表性和均勻性。采集的數(shù)量應(yīng)能反映該食品的衛(wèi)生質(zhì)量和滿足檢驗項目對樣品量的需要。8．一般樣品在檢驗結(jié)束后，應(yīng)保留1個月，以備需要時復(fù)查。保留期限從檢驗報告單簽發(fā)日起計算。易變質(zhì)食品不宜保留。保留樣應(yīng)加封存放在適當(dāng)?shù)胤?，并盡可能保持其原裝。三、微生物檢驗實驗室（一）微生物檢驗室基本條件1、微生物檢驗室包括：實驗室+無菌室（無菌室+緩沖間）2、總要求：對各室的共同要求是高度的清潔衛(wèi)生，也就是要盡可能地創(chuàng)造無菌條件。3、基本條件：微生物檢驗實驗室必須具備顯微鏡工作，微生物分離培養(yǎng)工作及基本化學(xué)工作順利進行的基本條件。（二）微生物檢驗室實驗守則在進行微生物檢驗時要時刻記住：我們實驗的許多對象可能是病原微生物，如果不慎發(fā)生意外，不僅自身招致感染，而且可能造成病原微生物的傳播?！ぁぁz驗實驗室必須遵守以下守則：1、包、衣物等勿帶入實驗室，必須的文具、實驗數(shù)據(jù)、筆記等帶入后要遠(yuǎn)離操作部位。2、進入實驗室應(yīng)穿著工作服，進入無菌室應(yīng)戴口罩、帽子，換用專用鞋。3、實驗室內(nèi)要保持安靜、有秩序，不能高聲談笑，影響實驗。實驗室內(nèi)禁止飲食、吸煙或用嘴濕潤鉛筆、標(biāo)簽、吸管等，也不要用手撫摸頭部、面部等。4、樣品檢驗前應(yīng)登記日期、批號，詳細(xì)記錄樣品檢驗序號，檢驗日期，檢驗程序和結(jié)果。5、室內(nèi)應(yīng)經(jīng)常保持整潔，樣品檢驗完畢后及時清理桌面。凡是要丟棄的培養(yǎng)物應(yīng)經(jīng)高壓滅菌后處理，污染的玻璃儀器高壓滅菌后再洗刷干凈。6、無菌室應(yīng)備有專用開瓶器、金屬勺、鑷子、剪刀、接種針、接種環(huán)，每次使用前和使用后應(yīng)在酒精燈火焰上灼燒滅菌。7、無菌室內(nèi)應(yīng)備有盛放3％來蘇水或5％石炭酸溶液的玻璃缸，內(nèi)浸紗布數(shù)塊；備有75％酒精棉球，用于樣品表面消毒及意外污染消毒；無菌室每次使用前后，用紫外燈照射。8、吸過菌液的吸管，要投入盛3％來蘇水或5％石炭酸溶液的玻璃筒中，不得放在桌子上；菌液流灑桌面，立即用抹布浸沾3％來蘇水或5％石炭酸溶液泡在污染部位，經(jīng)半小時后方可抹去。若手上沾有活菌，也應(yīng)該在上訴消毒液中浸泡10～20min，再以肥皂及水洗刷。9、遇火險，應(yīng)立即關(guān)閉電門、煤氣門，如果酒精、乙醚、汽油等著火，切勿用水，應(yīng)以沙土等滅火。10、離開實驗室前一定要用肥皂將手洗凈，脫去工作服、帽、專用鞋。關(guān)閉門窗以及水電煤氣等開關(guān)，認(rèn)為妥善后方可離開?！ぁぁ追N意外情況的處理：（1）皮膚破傷：先除盡異物，用蒸餾水和生理鹽水洗凈后，涂以2％碘酒。（2）灼燒傷：涂以凡士林、5％的鞣酸或2％的苦味酸。（3）化學(xué)藥品腐蝕傷：若為強酸腐蝕，先用大量清水沖洗后，再用50g/L碳酸氫鈉或氫氧化銨溶液洗滌中和；若為強堿腐蝕，也先用大量清水沖洗后，再用5％醋酸或5％硼酸溶液洗滌中和。若受傷的是眼部，經(jīng)過上述處理后，最后滴入橄欖油或液體石蠟1～2滴。（三）無菌室結(jié)構(gòu)與滅菌···殺菌前做好一切準(zhǔn)備工作，然后用紫外線殺菌燈進行空氣消毒，開燈照射30min后關(guān)燈，間隔30min后方可進入室內(nèi)工作···無菌室的熏蒸消毒主要采用甲醛熏蒸消毒法。氧化熏蒸：甲醛熏蒸后關(guān)門密閉應(yīng)保持12小時以上。···生物安全（Biohazard）一般是指由現(xiàn)代生物技術(shù)開發(fā)和應(yīng)用所能造成的對生態(tài)環(huán)境和人體健康產(chǎn)生的潛在威脅，及對其所采取的一系列有效預(yù)防和控制措施。實驗室的生物安全水平可以分為：基礎(chǔ)實驗室——一級生物安全水平BSL-1進行試驗研究用的物質(zhì)都是已知的所有特性都已清楚并且已證明不會導(dǎo)致疾病的多種微生物物質(zhì)。操作人員只需經(jīng)過基本的實驗室實驗程序培訓(xùn)并且通常由科研人員指導(dǎo)不需要生物安全柜的存在基礎(chǔ)實驗室——二級生物安全水平BSL-2進行試驗研究用的物質(zhì)是一些已知的中等程度危險性的并且與人類某些常見疾病相關(guān)的物質(zhì)。操作者必須經(jīng)過相關(guān)研究的操作培訓(xùn)并且由專業(yè)科研人員指導(dǎo)。在這些條件下最好使用二級的生物安全柜。如：流感病毒防護實驗室——三級生物安全水平BSL-3進行試驗研究的物質(zhì)一般都是本土或者外來的有通過呼吸傳染使人們致病或者有生命危險可能的物質(zhì)。需要保護一切在周圍環(huán)境中等操作者免于暴露于這些有潛在危險的物質(zhì)中。通常使用二級或者三級的生物安全柜是必需的。如：炭疽芽孢桿菌、鼠疫桿菌、結(jié)核分枝桿菌、最高防護實驗室——四級生物安全水平BSL-4進行試驗研究的物質(zhì)是一些極高危險性并且可以致命的有毒物質(zhì)可以通過空氣傳播并且現(xiàn)今并沒有有效的疫苗或者治療方法來處理。操作者必須經(jīng)過熟練的關(guān)于進行這種極高危險性物質(zhì)研究的培訓(xùn)，有非常有經(jīng)驗的科研人員進行指導(dǎo)，嚴(yán)禁獨自在4級實驗室工作。三級的生物安全柜是必需的。如：埃博拉病毒、馬爾堡病毒、拉沙病毒一節(jié)常用儀器培養(yǎng)箱、水浴箱（亦稱水恒溫箱，為血清實驗常用儀器）、超凈工作臺、干燥箱（烘箱）、高壓蒸汽滅菌鍋、離心機二節(jié)常用玻璃器皿試管、培養(yǎng)皿、三角瓶、刻度吸管、試劑瓶、玻璃缸、玻璃棒、玻璃珠、滴瓶、玻璃漏斗、載玻片凹玻片及蓋玻片、發(fā)酵管、注射器及大小針頭、量筒、量杯1、試管要求管壁較厚，管直而口平。常用試管有以下幾種規(guī)格：74mm×10mm，適用于康氏試驗用。85mm×15mm，較前者粗短，最適宜凝集反應(yīng)用。100mm×13mm，適于作生化反應(yīng)試驗、凝集反應(yīng)及華氏血清試驗等用。120mm×16mm，始于作斜面培養(yǎng)基等用。150mm×16mm，較前者稍長，常用于盛培養(yǎng)基。200mm×25mm，用以盛較多量培養(yǎng)基，作傾注平板用2、培養(yǎng)皿主要用于細(xì)菌的分離培養(yǎng)。常用培養(yǎng)皿有50mm×10mm，75mm×10mm，90mm×10mm和100mm×10mm等幾種規(guī)格?；罹嫈?shù)原則上用90mm×10mm規(guī)格。3、三角瓶多用于貯存培養(yǎng)基和生理鹽水等溶液，有50mL，100mL，150mL，200mL，250mL，300mL，500mL，1000mL，2000mL等多種規(guī)格4、刻度吸管常用的吸管容量有1mL，2mL，5mL，10mL等；做某些血清學(xué)試驗亦常用0.1mL，0.2mL，0.25mL，0.5mL等容量吸管5、試劑瓶容量30~1000mL不等，有棕色和無色的兩種，前者盛貯避光試劑用。9、滴瓶容量有30ml貨60ml，貯存染色液用。玻璃器皿的滅菌——干熱滅菌器內(nèi)160℃，2h滅菌。滅菌：殺滅物體中或物體上所有微生物（包括病原微生物和非病原微生物）的繁殖體和芽孢的過程稱為滅菌消毒：用物理的、化學(xué)的或生物學(xué)的方法殺滅病原微生物的過程稱為消毒。防腐：防止或抑制微生物生長繁殖的方法稱為防腐。無菌：無菌是不含有活的微生物的意思第三節(jié)食品微生物檢驗的一般程序食品微生物檢驗的一般步驟菌落總數(shù)樣品保存樣品處理結(jié)果報告大腸菌群樣品采集分離培養(yǎng)染色鏡檢選擇參檢驗前致病菌純生化驗驗考菌群的準(zhǔn)備化血清學(xué)試驗增菌分離培養(yǎng)動物試驗2、樣品的種類：大樣（一整批）；中樣（200g）；小樣（25g）3、采樣的步驟采樣前調(diào)查→現(xiàn)場觀察→確定采樣方案→采樣→樣品封存→開具采樣證明檢驗?zāi)康模簷z驗食品的微生物衛(wèi)生指標(biāo)是否合格。4、抽樣方案國際食品微生物學(xué)規(guī)范委員會（ICMSF）取樣方案；美國FDA微生物學(xué)取樣方案；世界糧農(nóng)組織（FAO）取樣方案;其他方案。（1）ICMSF的取樣方案···ICMSF：國際食品微生物學(xué)規(guī)范委員會···ICMSF采樣方法中包括二級法及三級法兩種。二級法只設(shè)有n、c及m值，三級法則有n、c、m及M值。M即附加條件后判定合格的菌數(shù)限量。四個代號：n：系指同一批次產(chǎn)品應(yīng)采集的樣品件數(shù)。c：最大可允許超出m值的樣品數(shù)。m：微生物指標(biāo)可接受水平的限量值。M：微生物指標(biāo)的最高安全限量值。二級抽樣方案:自然界中材料的分布曲線一般是正態(tài)分布，以其一點作為食品微生物的限量值，只設(shè)合格判定標(biāo)準(zhǔn)m值，超過m值的，則為不合格品。Eg：以生食海產(chǎn)品魚的副溶血性弧菌為例，n=5，c=0，m=100，n=5即抽樣5個，c=0即意味著在該批檢樣中，不得有超過m值（100）的檢樣，此批貨物為合格品。如果c≧0表明該批產(chǎn)品不合格。冷凍生蝦的細(xì)菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)n=5，c=3，m=10，M=100，其意義是從一批產(chǎn)品中，取5個檢樣，經(jīng)檢樣結(jié)果，允許≤3個檢樣的菌數(shù)是在m~M值（10~100）之間，如果有3個以上檢樣的菌數(shù)是在m~M值（10~100）之間或一個檢樣菌數(shù)超過M值（100）者，則判定該批產(chǎn)品為不合格品。I類危害：老人和嬰幼兒食品及在食用前可能會增加危害的食品；Ⅱ類危害：立即食用的食品，在食用前危害基本不變；Ⅲ類危害：食用前經(jīng)加熱處理，危害減小的食品。將檢驗指標(biāo)對食品衛(wèi)生的重要程度分成一般、中等和嚴(yán)重三檔在中等或嚴(yán)重危害的情況下使用二級抽樣方案，對健康危害低的則建議使用三級抽樣方案。（2）美國FDA的取樣方案食品藥品管理局(FDA)的取樣方案與ICMSF的取樣方案基本一致，所不同的是嚴(yán)重指標(biāo)菌所取的15、30、60個樣可以分別混合，混合的樣品量最大不超過375g?！ぁな澄镏卸疚⑸餀z驗的取樣檢驗?zāi)康模翰檎沂澄镏杏泻尾≡?。···人畜共患病病原菌檢驗的取樣檢驗?zāi)康模鸿b定畜禽及其產(chǎn)品是否帶有人獸共患的病原菌?！ぁぁげ蓸訕?biāo)簽的填寫標(biāo)簽內(nèi)容主要：編號、樣品名稱、生產(chǎn)單位、生產(chǎn)日期、產(chǎn)品批號、產(chǎn)品數(shù)量、存放條件、采樣時間、采樣人姓名，現(xiàn)場情況?！ぁぁ?樣品的送檢要求——要快速運送：不要超過3小時；——若路途遙遠(yuǎn)，可在1~5℃低溫下運送；——要注意防污染、防散漏、防變質(zhì)；——要填寫檢驗申請單?！ぁぁぶ虏【鷻z驗參考菌群的選擇蛋及蛋制品：沙門氏菌、葡萄球菌、變形桿菌等水產(chǎn)品海產(chǎn)品：鏈球菌、副溶血性弧菌乳制品：沙門氏菌、志賀氏菌、葡萄球菌、鏈球菌、蠟樣芽胞桿菌畜禽肉類：腸道致病菌和致病性球菌米面類：蠟樣芽胞桿菌、變形桿菌、酵母菌、霉菌等罐頭：耐熱性芽胞桿菌、嗜熱脂肪桿菌、大芽胞桿菌、凝值芽胞桿菌··樣品的保留（1）陰性樣品：在發(fā)出報告可及時處理；（2）陽性樣品：在發(fā)出報告以后3天才能處理樣品；（3）進口食品的陽性樣品：要保留6個月才能處理。（4）微生物檢驗不進行復(fù)檢··微生物檢驗流程圖1、無菌取樣——2、樣品均質(zhì)——3、樣液稀釋——4、樣品接種——5、恒溫培養(yǎng)——6、結(jié)果觀察第三章食品微生物檢驗基礎(chǔ)第一節(jié)細(xì)菌學(xué)檢驗基礎(chǔ)一、無菌技術(shù)（一）什么是無菌技術(shù)無菌技術(shù)：指在微生物實驗工作中，控制或防止各類微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施。（二）無菌環(huán)境無菌室無菌柜超凈工作臺無菌室的結(jié)構(gòu)：更衣間、緩沖間、操作間（三）無菌器材滅菌器材：玻璃器皿、培養(yǎng)基、無菌衣等.消毒器材：無菌室內(nèi)的凳子、試管架、天平、工作臺、手等（四）無菌操作目的：（1）是保證待檢物品不被環(huán)境中微生物的污染；（2）是防止被檢微生物在操作中污染環(huán)境或感染操作人員。二、微生物的接種與分離技術(shù)（一）接種接種：將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過程叫做接種常用的接種方法有以下幾種：１）劃線接種２）三點接種３）穿刺接種４）澆混接種５）涂布接種６）液體接種７）注射接種８）活體接種(二)分離純化１.傾注平板法２.涂布平板法３.平板劃線法（斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法）三、細(xì)菌培養(yǎng)方法對氣體需求不同細(xì)菌培養(yǎng)分為三種，即需氧培養(yǎng)法、CO2培養(yǎng)法、厭氧培養(yǎng)法。(一)需氧培養(yǎng)法：適合于需氧菌及兼性厭氧菌的培養(yǎng)。(二)CO2培養(yǎng)法：CO2培養(yǎng)箱法、燭缸法、化學(xué)法(三)厭氧培養(yǎng)法如在液體培養(yǎng)基的表面加蓋凡士林或蠟，或在液體培養(yǎng)基中加入碎肉塊制成皰肉培養(yǎng)基等。此外，也可以利用物理或化學(xué)方法除去培養(yǎng)環(huán)境中的氧，以保證厭氧環(huán)境。四、細(xì)菌的生長現(xiàn)象菌落：細(xì)菌經(jīng)一定時間培養(yǎng)后，在固體培養(yǎng)基表面所形成的，肉眼可見的物體（群落），稱為菌落。細(xì)菌在鑒定培養(yǎng)基上的特征（1）在血平板上的溶血特征α溶血：在菌落周圍出現(xiàn)狹窄的草綠色的半透明區(qū)域，而紅細(xì)胞外形完整。β溶血：在菌落周圍出現(xiàn)一個大小不一的完全透明清楚的寬帶。γ溶血：看不到溶血帶的溶血。雙環(huán)：菌落周圍完全溶解的暈圈外有一部分溶血的圓圈。(2)卵黃瓊脂中的反應(yīng)(3)蛋白水解作用：在菌落周圍出現(xiàn)清晰的環(huán)。(4)色素：水溶性色素溶在培養(yǎng)基中、脂溶性色素則使細(xì)菌菌落著上顏色（5）氣味：假單胞菌屬細(xì)菌——葡萄汁氣味；變形桿菌——巧克力燒焦的臭味；鏈球菌——地窖里的霉臭；梭菌——糞臭、腐敗味；產(chǎn)黑色素類桿菌屬細(xì)菌——辛辣味等。(二)細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象液體中生長特性包括：發(fā)育程度、渾濁度、沉淀、液體表面性狀、其他(三)細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象半固體培養(yǎng)基主要用于細(xì)菌動力的觀察。五、細(xì)菌的生化反應(yīng)檢查法在培養(yǎng)物中加入某種底物與指示劑，經(jīng)接種、培養(yǎng)后，觀察培養(yǎng)基的PH值變化。在培養(yǎng)物中加入試劑，觀察它們同細(xì)菌代謝產(chǎn)物所生成的顏色反應(yīng)。根據(jù)酶作用的反應(yīng)特性，測定酶的存在。根據(jù)細(xì)菌對理化條件和藥品的敏感性，觀察細(xì)菌的生長情況。生化試驗的注意事項1、待檢菌應(yīng)是新鮮培養(yǎng)物。培養(yǎng)18-24h。2、待檢菌應(yīng)是純種培養(yǎng)物。3、遵守觀察反應(yīng)的時間。觀察結(jié)果的時間，多為24或48小時。4、應(yīng)做必要的對照試驗。5、提高陽性檢出率，至少挑取2-3個待檢的疑似菌落分別進行試驗。生化試驗分類（一）糖類代謝試驗（二）氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗（三）有機酸鹽和銨鹽代謝試驗（四）酶類試驗(一)糖類代謝試驗1.糖(醇)發(fā)酵試驗結(jié)果：陽性——培養(yǎng)基變?yōu)辄S色、氣泡/氣泡陰性——培養(yǎng)基未變色、無氣泡產(chǎn)生2.甲基紅(MR)試驗結(jié)果MR陽性：培養(yǎng)物有足夠的酸，能使培養(yǎng)基表面甲基紅試劑仍保持明顯的紅色(pH4.4)；MR陰性：培養(yǎng)基表面呈黃色(pH6.0)；延遲反應(yīng)：橙色，應(yīng)繼續(xù)孵育到4天，并重復(fù)試驗3.伏普試驗(V-P試驗)二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V-P（+）反應(yīng)。結(jié)果如立即或于數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)紅色反應(yīng)者為陽性；若為陰性應(yīng)將試管置37℃中4h后再進行觀察4.β-半乳糖苷酶試驗β-半乳糖苷酶是一種誘導(dǎo)酶，它對半乳糖苷的作用是特異的不能發(fā)酵乳糖的細(xì)菌可呈現(xiàn)兩種表型之一：一是G-P+，即沒有β-半乳糖苷酶(G)，但有滲透酶(P)，因此不能發(fā)酵半乳糖苷，但能積累半乳糖苷；二是G+P-，具有β-半乳糖苷酶(G)，但沒有滲透酶(P)。結(jié)果：如有β-半乳糖苷酶，一般在20～30min即呈現(xiàn)黃色者為陽性；如無此酶則24h不變色。5.七葉苷水解試驗七葉素可與培養(yǎng)基中的檸檬酸鐵試劑的二價鐵離子起反應(yīng)生成黑色的化合物沉淀，使培養(yǎng)基變黑。結(jié)果培養(yǎng)基變黑色者為試驗陽性6.石蕊牛乳試驗結(jié)果產(chǎn)酸：若發(fā)酵糖產(chǎn)酸，使石蕊指示劑變?yōu)榉奂t色。產(chǎn)氣：若發(fā)酵乳糖同時產(chǎn)氣者，可沖開覆蓋在培養(yǎng)基上的凡士林。凝固：若發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸甚多，可使酪蛋白凝固。胨化：若將凝固的酪蛋白，繼續(xù)水解成蛋白胨，此時牛乳培養(yǎng)基的上段則變清。產(chǎn)堿：若不發(fā)酵乳糖，分解含氮物質(zhì)，生成氨及胺，使培養(yǎng)基變堿性，石蕊指示劑變藍(lán)紫色。（二）氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗1.靛基質(zhì)（Imdole）試驗?zāi)承┘?xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來。吲哚與對二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。結(jié)果兩層液體交界處出現(xiàn)紅色為陽性，無色為陰性2.硫化氫試驗(1)瓊脂穿刺法結(jié)果：培養(yǎng)基變黑色為陽性。當(dāng)產(chǎn)生硫化氫量少時，為了便于觀察結(jié)果，在穿刺接種培養(yǎng)時，一定要沿培養(yǎng)基管壁進行。(2)醋酸鉛試紙法結(jié)果：試紙呈黑色為陽性。該法較敏感。3.尿素酶試驗結(jié)果培養(yǎng)基變紅為陽性，不變?yōu)殛幮浴?.明膠液化試驗結(jié)果半固體培養(yǎng)基不再凝固為陽性。注意事項:明膠在≤20℃時為固體，≥35℃時則為液體。從凝膠(固態(tài))轉(zhuǎn)變?yōu)橐后w大約在28℃。所以，明膠管在≥35℃下孵育時，在決定是否液化以前，必須先放在冰箱或冰浴中冷卻一段時間。因細(xì)菌在培養(yǎng)基的表面生長引起液化，當(dāng)明膠管還溫?zé)釙r不要搖動5.苯丙氨酸脫氨酶試驗原理某些細(xì)菌產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶，使苯丙氨酸脫去氨基，形成苯丙酮酸和游離氨，加入FeCl3試劑與苯丙酮酸螯合后出現(xiàn)綠色產(chǎn)物，隨后綠色可褪去。延長時間后，所生成的綠色會較快褪色。結(jié)果須在5min內(nèi)作出判斷，出現(xiàn)綠色為陽性。6.氨基酸脫羧酶試驗(1)賴氨酸：賴氨酸經(jīng)過賴氨酸脫羧酶作用生成尸胺和CO2。(2)鳥氨酸：鳥氨酸經(jīng)鳥氨酸脫羧酶的脫羧作用，產(chǎn)生腐胺和CO2。(3)精氨酸：L-精氨酸經(jīng)精氨酸脫羧酶的作用，可產(chǎn)生精胺和CO2。結(jié)果檢測培養(yǎng)基由黃色變紫色為陽性，黃色為陰性，對照(無氨基酸)為黃色。7.精氨酸雙水解試驗結(jié)果指示劑顏色轉(zhuǎn)為堿性時為陽性。即溴甲酚紫轉(zhuǎn)為紫色，酚紅轉(zhuǎn)為紅色。8.肉渣消化試驗肉渣消化試驗是測定細(xì)菌對蛋白質(zhì)的另一種分解能力。結(jié)果觀察管內(nèi)肉渣的高度有無變化，即可判定肉渣是否已被部分消化。9.凝固血清消化試驗原理某些細(xì)菌液化凝固血清，系由于這些細(xì)菌產(chǎn)生一種胞外蛋白酶的作用所致結(jié)果凝固之血清發(fā)生液化為陽性(三)有機酸鹽和銨鹽代謝試驗1.檸檬酸鹽利用試驗結(jié)果培養(yǎng)基由淡綠色變?yōu)樯钏{(lán)色為陽性，不變色為陰性。2.馬尿酸鈉水解試驗三氯化鐵法原理：B群鏈球菌具有馬尿酸水解酶，可使馬尿酸水解為苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸與三氯化鐵試劑結(jié)合，形成苯甲酸鐵沉淀.結(jié)果：出現(xiàn)穩(wěn)定的沉淀物為陽性，輕搖后沉淀物溶解為陰性。茚三酮法原理：馬尿酸被細(xì)菌分解后，形成苯甲酸及甘氨酸。甘氨酸在茚三酮的作用下，經(jīng)氧化脫氨基反應(yīng)，生成氨，CO2和相應(yīng)的醛，而茚三酮則生成了還原型茚三酮。其中形成的氨和還原型茚三酮，與殘留的茚三酮起反應(yīng)，形成紫色化合物結(jié)果：出現(xiàn)紫色為陽性3.丙二酸鹽利用試驗丙二酸鈉可被分解生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變堿性。溴麝香草酚藍(lán)：pH6.0(黃)～7.6(藍(lán))結(jié)果：培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{(lán)色為陽性，顏色無變化為陰性。(四)酶類試驗1.氧化酶試驗(Kovacs試驗)對苯二胺氧化，生成紅色的醌類化合物。結(jié)果：陽性者立即呈現(xiàn)粉紅色或紅色，顏色逐漸變深至深紫色。2.過氧化氫酶試驗(觸酶試驗)原理過氧化氫酶又稱觸酶，可使細(xì)菌代謝過程中的過氧化氫分解為水和氧。實驗時必須用18～24h新鮮培養(yǎng)物。結(jié)果30s內(nèi)有大量氣泡產(chǎn)生者為陽性，無氣泡產(chǎn)生者為陰性。3.硝酸鹽還原試驗結(jié)果出現(xiàn)紅色為陽性，無顏色變化為陰性。4.過氧化物酶試驗結(jié)果陽性者于2min內(nèi)呈現(xiàn)藍(lán)色。5.脫氫酶試驗若用美藍(lán)（亞甲藍(lán)，Methyleneblue）作為受氫體的話，細(xì)菌如有脫氫酶存在，可使美藍(lán)還原成美白(無色)。如果用無色TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）作為受氫體，在有脫氫酶存在的情況下，TTC可以接受氫而成為紅色的Formazan（甲臜zā)。結(jié)果若第1管變白即為相應(yīng)作用物的脫氫酶陽性，不變色為陰性。第2管與第3管為對照管，應(yīng)不變色。6.氧化三苯基四氮唑試驗(TTC試驗)結(jié)果出現(xiàn)紅色者為陽性，淡紅色者為弱陽性，不變色者為陰性。7.脂酶試驗原理：某些細(xì)菌產(chǎn)生卵磷脂酶，即α-毒素，在有鈣離子存在時，能迅速分解卵磷脂，生成混濁沉淀狀的甘油酯和水溶性的磷酰膽堿結(jié)果產(chǎn)生卵磷脂酶的細(xì)菌，培養(yǎng)3h后，在菌落周圍形成乳白色混濁環(huán)，6h后擴散至5～6mm。8.磷酸酶試驗用磷酸酚酞為基質(zhì)，經(jīng)磷酸酶水解后可釋放出酚酞，在堿性環(huán)境中可呈紅色。結(jié)果如有酚酞釋出，菌落即變?yōu)榉奂t色9.DNA酶試驗在DNA瓊脂平皿上加入鹽酸后，在菌落周圍形成透明環(huán)。結(jié)果菌落周圍產(chǎn)生透明環(huán)為陽性，無透明環(huán)為陰性。10.血漿凝固酶試驗金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生凝固酶，凝固酶可分為兩種，一種是與細(xì)胞壁結(jié)合的凝固酶，可用玻片法測定；另一種是菌體生成后釋放于培養(yǎng)基中的游離凝固酶，可用試管法測出。(i)玻片法：血漿中有明顯顆粒出現(xiàn)，而生理鹽水中無自凝現(xiàn)象為陽性(ii)試管法：待檢菌株管和陽性菌株管出現(xiàn)凝固，陰性對照管不出現(xiàn)凝固，為陰性。第二節(jié)免疫學(xué)基礎(chǔ)一、抗原與抗體（一）抗原（Antigen，Ag）完全抗原包括下面兩方面的免疫性能：一是免疫原性,指抗原進入體內(nèi)刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體或形成致敏淋巴細(xì)胞的特性，具有這種能力的物質(zhì)稱為免疫原；二是免疫反應(yīng)性，指抗原能和對應(yīng)的抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)的特性，又稱為反應(yīng)原性。半抗原：有些物質(zhì)，單獨存在時只有反應(yīng)原性而無免疫原性，是非免疫原物質(zhì)（2）免疫原性一種抗原能否成功地誘導(dǎo)免疫動物（宿主）產(chǎn)生免疫應(yīng)答取決于以下幾個方面的因素：抗原結(jié)構(gòu)和性質(zhì)、宿主的反應(yīng)性和免疫方式。在抗原的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)方面，包括抗原的異質(zhì)性、分子量大小和化學(xué)結(jié)構(gòu)等。異質(zhì)性是指抗原物質(zhì)和宿主動物本身物質(zhì)之間的差異?？乖姆肿淤|(zhì)量大于10ku時，均具有較好的免疫原性，分子質(zhì)量越大，免疫原性越強宿主的免疫方式，主要包括抗原的進入途徑、劑量、次數(shù)、間隔時間等。（3）特異性抗原的特異性表現(xiàn)在兩個方面：在免疫原性上，一種抗原只能誘發(fā)一種特異的免疫應(yīng)答，結(jié)果形成特異性抗體或致敏淋巴細(xì)胞；在反應(yīng)原性上，抗原只能與抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體或致敏淋巴細(xì)胞進行反應(yīng)。抗原的特異性是免疫學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于疾病診斷、鑒別和防治的基礎(chǔ)。2、抗原的分類按抗原性質(zhì)——完全抗原：既具有免疫原性又具有反應(yīng)原性的物質(zhì)?！煌耆乖褐挥蟹磻?yīng)原性而沒有免疫原性的物質(zhì)。不完全抗原（半抗原）：簡單半抗原、復(fù)合半抗原（2）按化學(xué)組成分蛋白質(zhì)抗原、多糖抗原、類脂抗原（3）按來源分異種抗原(heteroantigen)：與免疫動物不同種屬的抗原。同種抗原(Alloantigen)：與免疫動物同種屬的抗原，能刺激同種而基因型不同的個體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。自身抗原(Autoantifen)：動物的自身組織細(xì)胞、蛋白質(zhì)在特定條件下形成的抗原，對自身免疫系統(tǒng)具有抗原性。異嗜性抗原(Heterophilantigen)：是指與種屬特異性污垢、存在于人、動物、植物及微生物之間性質(zhì)相同的抗原（交叉抗原）。也叫Fossman抗原（4）按存在部位分細(xì)菌抗原：表面抗原[菌體抗原：（O存在于細(xì)胞壁、主要成分為脂多糖）為數(shù)成；鞭毛抗原：（H）指存在于鞭毛，主要成分為蛋白質(zhì)。H抗原也有不同菌群特異性；莢膜抗原：主要成分為多肽]深部抗原:指細(xì)菌的內(nèi)部結(jié)構(gòu)所形成的抗原物質(zhì)（免疫中不起作用）病毒抗原：V抗原：不耐熱；S抗原：可溶性（二）抗體抗體主要存在于動物血清中，也存在于動物的其他體液和體外分泌液；抗體還存在于某些細(xì)胞，例如B淋巴細(xì)胞的膜上。免疫球蛋白（immunoglobin，Ig）：人類的Ig可分為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE五大類IgG是Ig中主要的組成成分，約占血清總蛋白質(zhì)的15%。應(yīng)用于免疫學(xué)技術(shù)中的抗體主要是IgG和IgM，以IgG最為常用。二、常用的免疫學(xué)技術(shù)據(jù)根研究內(nèi)容的不同，免疫檢測技術(shù)可以分為細(xì)胞免疫檢驗技術(shù)和體液免疫檢驗技術(shù)兩大類。（一）抗原－抗體反應(yīng)可以發(fā)生在體內(nèi)，也可以發(fā)生在體外在進行體外免疫學(xué)實驗時，通常是以存在于血清中的抗體(也是抗體的主要存在形式)為材料進行的，所以體外免疫學(xué)反應(yīng)又稱為血清學(xué)反應(yīng)。1、抗原抗體反應(yīng)的原理抗原與抗體的特異性結(jié)合，特性是由抗原和抗體分子的一級結(jié)構(gòu)決定的。抗原抗體分子之間的特異性結(jié)合力包括電荷引力、范德華(vanderWaals)力、氫鍵和疏水作用。2、抗原-抗體反應(yīng)的特性抗原-抗體反應(yīng)的最大特點是①特異性②可逆性③比例性常見的血清學(xué)反應(yīng)：凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補體結(jié)合試驗、免疫標(biāo)記技術(shù)１、凝集反應(yīng)包括：直接凝集反應(yīng)、間接凝集反應(yīng)、反向間接凝集反應(yīng)、協(xié)同凝集反應(yīng)等。2．沉淀反應(yīng)包括：單向瓊脂擴散、雙向瓊脂擴散、對流免疫電泳、火箭電泳等。對流免疫電泳常用于鑒定血清型?；鸺娪荆╮ocketelectrophoresis）又稱電免疫擴散法，主要用于檢測標(biāo)本中某一免疫球蛋白含量。3．免疫標(biāo)記技術(shù)（1）免疫熒光技術(shù)：（2）免疫酶技術(shù)：（3）放射免疫測定法：(4)免疫印跡法：(5)免疫金標(biāo)技術(shù)：(6)免疫PCR：食品衛(wèi)生細(xì)菌檢驗常用的微生物檢驗指標(biāo)為三項，即細(xì)菌總數(shù)（主要是菌落總數(shù)）、大腸菌群最近似數(shù)和致病菌的檢測。第一節(jié)菌落總數(shù)的測定一、菌落總數(shù)與食品衛(wèi)生質(zhì)量目的：了解食品在生產(chǎn)中，從原料加工到成品包裝受外界污染的情況；也可以應(yīng)用這一方法觀察細(xì)菌在食品中繁殖的動態(tài)，確定食品的保存期，以便對被檢樣品進行衛(wèi)生學(xué)評價時提供依據(jù)。菌落總數(shù)的幾個概念菌落總數(shù)：AerobicPlateCount，食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后（如培基、溫度、時間、pH、需氧性質(zhì)等）所得1mL（g）檢樣中形成微生物菌落的總數(shù)。只包括一群在平板計數(shù)瓊脂上生長發(fā)育的嗜中溫需氧或兼性厭氧菌的菌落總數(shù)。菌落總數(shù)不等于細(xì)菌總數(shù)。菌落：Colony，單個微生物在適宜固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長繁殖到一定程度，形成肉眼可見有一定細(xì)菌群落。CFU:ColonyFormingUnits，菌落形成單位。細(xì)菌數(shù)量的表示方法：菌落總數(shù)、細(xì)菌總數(shù)菌落總數(shù)意義：食品中菌落總數(shù)的多少，直接反映著食品的衛(wèi)生質(zhì)量。是判斷食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要依據(jù)之一。（1）可以反應(yīng)食品的新鮮度。（2）可以反應(yīng)食品被細(xì)菌污染的程度。（3）生產(chǎn)過程中食品是否變質(zhì)。（4）食品生產(chǎn)的一般衛(wèi)生狀況等。如果食品中菌落總數(shù)多于10萬個，就足以引起細(xì)菌性食物中毒；如果人的感官能察覺食品因細(xì)菌的繁殖而發(fā)生變質(zhì)時，細(xì)菌數(shù)大約已達(dá)到106-107CFU/g(mL或cm2)。食品中菌落總數(shù)的測定對評定食品的新鮮度和衛(wèi)生質(zhì)量起著一定的衛(wèi)生指標(biāo)作用，但還必須配合大腸菌群的檢驗和病原菌項目的檢驗，才能作出比較全面準(zhǔn)確評定。說明：國家標(biāo)準(zhǔn)中采用的培養(yǎng)方法是樣品處理后傾注平板，36℃，培養(yǎng)48±2小時——實際測定的是嗜中溫好氧菌的菌落總數(shù)。菌落總數(shù)測定是對細(xì)菌的無差別培養(yǎng)，不能區(qū)分細(xì)菌種類，所以有時被稱為雜菌數(shù)。二、菌落總數(shù)的測定方法（重點）GB/T4789.2-2010三、菌落總數(shù)測定的方法平板傾注法：平板表面涂布法；平板表面點滴法四、平板傾注法測定菌落總數(shù)1、檢驗步驟(程序)：檢樣→稀釋處理→做平板→培養(yǎng)→菌落計數(shù)→報告結(jié)果培養(yǎng)條件：普通食品：37℃，48h清涼飲料、調(diào)味品、糕點、酒類：37℃，24h水產(chǎn)品：30℃，48h平板菌落計數(shù)法測定食品中的菌落總數(shù)，一般采用中溫培養(yǎng)2）菌落計數(shù)和報告到達(dá)規(guī)定培養(yǎng)時間，應(yīng)立即計數(shù)。如果不能立即計數(shù)，應(yīng)將平板放置于0－4℃，但不得超過24h。平板菌落的選擇（1）選取菌落數(shù)在30-300之間的平板作為菌落總數(shù)測定的標(biāo)準(zhǔn)。一個稀釋度使用兩個平皿，應(yīng)選擇兩個平板的平均數(shù)。（2）呈鏈狀生長的菌落之間無任何明顯界限，作為一個菌落計，如存在有幾條不同來源的鏈，則每條鏈均應(yīng)按一個菌落計算。（3）如片狀菌落不到平板一半，而另一半又分布均勻，則可以半個平板的菌落數(shù)乘2代表全平板的菌落數(shù)。稀釋度的選擇（1）選取菌落數(shù)在30～300之間的平板，若有二個稀釋度均在30～300之間時，比值小于或等于2取平均數(shù)，比值大于2則報告其中稀釋度較低的平皿菌落數(shù)。（2）如均大于300，則取最高稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告。（3）如均小于30，則以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)報告。（4）如菌落數(shù)有的大于300，有的又小于30，不在30～300之間，以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告。（5）如所有稀釋度均無菌落生長，則應(yīng)按小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報告。菌落數(shù)的報告1）菌落數(shù)在1～100時，按實有數(shù)字報告。2）如大于100時，則報告前面兩位有效數(shù)字，第三位數(shù)按四舍五入計算。為縮短零的個數(shù)，以10的指數(shù)表示。3）固體檢樣以克（g)為單位報告，4）液體檢樣以毫升（mL）為單位報告，5）表面涂擦則以平方厘米（cm2）報告。2、檢驗注意事項1）對照平板出現(xiàn)幾個菌落時，要追加對照平板；2）吸管進出瓶子或試管時，吸管口不得觸及瓶口、管口的外圍部分；3）進行稀釋時，吸管口不得與稀釋液接觸;4）為防止細(xì)菌增值及形成片狀菌落，檢樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用時間不宜超過20min。5）稀釋倍數(shù)愈高菌落數(shù)愈少，稀釋倍數(shù)愈低菌落數(shù)愈多。如出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，不可作為檢樣計數(shù)報告的依據(jù)。結(jié)果表述10-1均數(shù)10-2均數(shù)描述最終結(jié)果25536均在30-300間則按計數(shù)公式2.6×103多不可計345各平板均>300，取稀釋度最高者報告，余計為多不可數(shù)3.5×104122均小于30則取稀釋度最低者報告1.2×10233029所有平板均不在30-300CFU且一部分<30或>300者以最接近30或300者報告2.9×10300所有平板均無菌落則記為1乘以最低稀釋倍數(shù)報告1×10，10第二節(jié)食品中大腸菌群的測定一、大腸菌群的定義及范圍大腸菌群(coliformbacteria)在一定條件下能發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。大腸菌群主要是由腸桿菌科（Enterobacteriaceae）中四個菌屬內(nèi)的一些細(xì)菌所組成，即埃希氏菌屬（Escherichia）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）及腸桿菌屬（Enterobacter）。大腸菌群中大腸埃希氏菌I型和Ⅲ型的特點是，對靛基質(zhì)、甲基紅、V-P和枸櫞酸鹽利用四個生化反應(yīng)分別為“++--”，通常稱為典型大腸桿菌；而其他類大腸桿菌則被稱為非典型大腸桿菌。二、大腸菌群的測定意義1.糞便污染的指標(biāo)細(xì)菌2．糞便污染指標(biāo)菌的選擇作為理想的糞便污染的指標(biāo)菌應(yīng)具備以下幾個特性，才能起到比較正確的指標(biāo)作用。①存在于腸道內(nèi)特有的細(xì)菌，才能顯示出指標(biāo)的特異性。②在腸道內(nèi)占有極高的數(shù)量，即使被高度稀釋后，也能被檢出。③在腸道以外的環(huán)境中，其抵抗力大于腸道致病菌或相似，進入水中不再繁殖。④檢驗方法簡便，易于檢出和計數(shù)大腸菌群都直接或間接來自于人或溫血動物的糞便。作為糞便污染的指標(biāo)細(xì)菌還有：分叉桿菌(Bifidobacterium)、擬桿菌(Bacteroides)、乳酸菌、腸桿菌科中的梭狀芽胞和底群鏈球菌等。大腸菌群作為糞便污染指標(biāo)菌也有一些不足之處：①飲用水中含有較少量大腸菌群的情況下，有時仍能引起腸道傳染病的流行。②大腸菌群在一定條件下能在水中生長繁殖。③在外界環(huán)境中，有的沙門氏菌比大腸菌群更有耐受力。3．大腸菌群作為糞便污染指標(biāo)菌的意義糞便污染的食品，往往是腸道傳染病發(fā)生的主要原因，因此檢查食品中有無腸道菌，這對控制腸道傳染病的發(fā)生和流行，具有十分重要的意義。許多研究者的調(diào)查證明，人、畜糞便對外界環(huán)境的污染是大腸菌群在自然界存在的主要原因。大腸菌群的檢出，不僅反映檢樣被糞便污染總的情況，而且在一定程度上也反映了食品在生產(chǎn)加工、運輸、保存等過程中的衛(wèi)生狀況，所以具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義。大腸菌群作為糞便污染指標(biāo)菌而被列入食品衛(wèi)生微生物學(xué)常規(guī)檢驗項目。如果食品中大腸菌群超過規(guī)定的限量，則表示該食品有被糞便污染的可能，而糞便如果是來自腸道致病菌者或者腹瀉患者，該食品即有可能污染腸道致病菌。所以，凡是大腸菌群數(shù)超過規(guī)定限量的食品，即可確定其衛(wèi)生學(xué)上是不合格的，該食品食用是不安全的···大腸菌群的生物學(xué)特性形態(tài)與染色：革蘭氏染色陰性，無芽孢桿菌。發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。培養(yǎng)特性：1、在伊紅美蘭(ＥＭＢ)瓊脂上的典型菌落:呈深紫黑色或中心深紫色，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，常有金屬光澤。2、在麥康凱瓊脂上的典型菌落:呈桃紅色或中心桃紅、圓形，扁平，光滑濕潤?！ぁぁご竽c菌群數(shù)量的表示方法以每100g或100mL檢樣中大腸菌群最近似數(shù)（MPN)來表示。MPN是采用一定的方法，應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)的原理所測定和計算出的一種最近似數(shù)值。三、大腸菌群測定的國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.3-2010培養(yǎng)基和試劑：月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose，LST）肉湯1、初發(fā)酵試驗：蛋白胨提供細(xì)菌生長發(fā)育所需的氮源、維生素和氨基酸；乳糖提供發(fā)酵所需的碳源；磷酸氫二鉀維持緩沖體系；月桂基硫酸鹽LST中提供了磷酸鹽緩沖體系，氯化鈉可維持滲透壓，月桂基硫酸鈉可抑制非大腸菌群的生長，這個緩沖蛋白胨乳糖肉湯允許“緩慢乳糖發(fā)酵”來促進菌體產(chǎn)氣?；途G乳糖膽鹽（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉湯2、復(fù)發(fā)酵試驗煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）：BGLB中膽鹽和煌綠可以抑制革蘭氏陽性細(xì)菌和大腸菌群以外的很多革蘭氏陰性細(xì)菌，再根據(jù)發(fā)酵乳糖的情況判斷大腸菌群。結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VioletRedBileAgar，VRBA）磷酸鹽緩沖液MPN為最大可能數(shù)(MostProbableNumber)的簡稱。MPN檢索表只給了三個稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或增加10倍。大腸菌群平板計數(shù)的報告例：10-4樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落，挑取其中10個接種BGLB肉湯管，證實有6個陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105CFU/g（mL）。第五章食品中致病菌的檢驗第一節(jié)食品中腸道致病桿菌的檢驗一、沙門氏菌檢驗·沙門氏菌屬是一群形態(tài)和培養(yǎng)特性都類似的腸桿菌科中的一個大屬·沙門氏菌常作為進出口食品和其他食品的致病菌指標(biāo)。(一)形態(tài)與染色沙門氏菌為革蘭氏陰性較為細(xì)長的桿菌，除雞白痢和雞傷寒沙門氏菌外，其余都具有周身鞭毛，能運動，絕大多數(shù)都具有纖毛，(二)命名1．根據(jù)所致疾病命名如引起傷寒病的菌型，命名為傷寒沙門氏菌(S.typhi)；引起豬霍亂病的菌型，命名為豬霍亂沙門氏菌(S.cholerae-suis)，引起馬流產(chǎn)的菌型，命名為馬流產(chǎn)沙門氏菌(S.abortus-equi)等。2．根據(jù)首先發(fā)現(xiàn)的地區(qū)命名3．根據(jù)人名命名(三)培養(yǎng)特性沙門氏菌最適生長溫度為35℃～37℃，10h～42h能生長，最適生長pH為7.2～7.4沙門氏菌屬按其生化特性，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ五個亞屬，其中亞屬Ⅲ又稱為亞利桑那菌，它們在亞硫酸鉛瓊脂、DHL瓊脂、HE瓊脂和SS瓊脂平板上培養(yǎng)特性各不相同。亞硫酸鉍瓊脂(BS)：產(chǎn)硫化氫菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株不產(chǎn)生硫化氫，形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變。DHL瓊脂：無色半透明：產(chǎn)硫化氫菌落中心帶黑色或幾乎全黑色。亞利桑那菌乳糖陽性菌株是粉色。HE瓊脂：藍(lán)綠色或藍(lán)色，多數(shù)菌株產(chǎn)硫化氫，菌落中心黑色或幾乎全黑色。亞利桑那菌乳糖陽性菌株是黃色。 SS瓊脂 ：無色半透明：產(chǎn)硫化氫菌株有的菌落中心帶黑色，但不如以上培養(yǎng)基明顯。亞利桑那菌乳糖陽性菌株是粉色。XLD瓊脂培養(yǎng)基：多數(shù)菌株產(chǎn)硫化氫，菌落中心黑色或幾乎全黑色。生化特性1）發(fā)酵葡萄糖，甘露醇，山梨醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣（雞傷寒沙門氏菌少數(shù)不產(chǎn)氣）。2）不發(fā)酵乳糖，蔗糖，側(cè)金盞花醇。3）V—P試驗（-），多數(shù)產(chǎn)生H2S（+），不產(chǎn)靛基質(zhì)（-），不分解尿素（-），苯丙氨酸脫氨酶試驗（-）。(四)抗原結(jié)構(gòu)沙門氏菌具有復(fù)雜的抗原結(jié)構(gòu)，一般可分為四種：菌體抗原，又稱為Ｏ抗原；鞭毛抗原，又稱為H抗原；表面抗原又稱K抗原；以及菌毛抗原。1）O抗原：也稱菌體抗原，細(xì)胞壁最外層的多糖-類脂-蛋白質(zhì)復(fù)合物。耐熱，100℃2.5h不被破壞?？蓪⒕w進行分群或組。（A、B、…Z；O1、O2、…)，引起人類疾病的主要在A-F群，且此幾個群包含了95%以上的沙門氏菌。2）H抗原：也稱鞭毛抗原，鞭毛蛋白。不耐熱，60℃15min可破壞。每群（組）沙門氏菌根據(jù)H抗原進行分型或種。（分為兩相；第一相（特異相）（a、b、…z，z1,z2,…z55），第二相（非特異相）（1、2、…）3）Vi抗原：也稱表面抗原（莢膜抗原），糖脂，具有阻抑O抗原發(fā)生凝集的現(xiàn)象，極少數(shù)菌含有。不耐熱，60℃30min或100℃5min即可破壞。1、菌體抗原(O抗原)沙門氏菌的Ｏ抗原主要存在于細(xì)菌細(xì)胞壁的最外層，是多糖—類脂—蛋白質(zhì)的復(fù)合物，簡稱脂多糖，也就是本屬細(xì)菌的內(nèi)毒素。O抗原很穩(wěn)定，能耐熱100℃達(dá)數(shù)小時。O抗原含有許多不同的多糖成分，分別以1，2，3…等阿拉伯?dāng)?shù)字表示，O抗原與抗Ｏ血清混合后，在56℃經(jīng)4h～12h或37℃過夜，出現(xiàn)顆粒狀不易搖散的Ｏ凝集現(xiàn)象。2、鞭毛抗原(H抗原)沙門氏菌的H抗原存在于鞭毛上，化學(xué)成分為蛋白質(zhì)H抗原與抗H血清經(jīng)56℃2h后，可出現(xiàn)疏松易于搖散的絮狀凝集，稱為H凝集。H抗原可分為兩相，第1相為特異相，用英文小寫字母表示；第2相為非特異性相，用阿拉伯?dāng)?shù)字表示，但少數(shù)也有用英文字母來表示的。具有兩相鞭毛抗原的細(xì)菌稱為雙相菌，僅具有一相鞭毛抗原的細(xì)菌稱為單相菌。如甲型副傷寒沙門氏菌只具有1相抗原a。3、表面抗原(K抗原)主要包括Vi抗原和M抗原。（1）Vi抗原（微莢膜抗原，virulence）具有Vi抗原的細(xì)菌有抗吞噬作用和保護細(xì)菌避免相應(yīng)抗體在補體參與下的溶菌作用，故毒力較強。Vi抗原由多糖所組成，很不穩(wěn)定，不耐熱Vi抗原位于菌體的最表層，罩在O抗原的表面。Vi抗原對鑒定傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、都柏林沙門氏菌很重要。（2）M抗原黏多糖成分，M抗原能耐熱60℃1h，加熱100℃2h后，其可凝集性及抗體產(chǎn)生能力即被破壞，而凝集素結(jié)合能力仍然保存。經(jīng)甲醛處理或60℃處理1h后的活菌抗原，能刺激機體產(chǎn)生M凝集素。在菌型鑒定上無特殊意義。4、菌毛抗原（F抗原）沙門氏菌的菌毛有抗原性，用其免疫能獲得高效價的血清。(五)抗原變異1、H－O變異H－O變異指有動力的菌株(H型)喪失H抗原而成為無動力的變種(O型)，這些變種性質(zhì)十分穩(wěn)定，一般不能逆轉(zhuǎn)。2、S－T—R變異這是指喪失O抗原，由光滑型(S型)過渡到T(transient)型或粗糙型(R型)的一種變異。T型菌含有一種新的對熱穩(wěn)定的抗原，稱為T抗原。T型菌不含有正常的O抗原，是介于S—R型間的過渡形體，其形態(tài)光滑，與S型無法鑒別，但不被O血清凝集。3、型體變異型體變異指菌體抗原含量的改變，包括O型變異和V－W型變異。（1）O變異（2）V－W變異這是指失去Vi抗原的變異。初次從患者分離到的具有Vi抗原的菌株稱V菌株。4、位相變異位相變異是鞭毛抗原的一種質(zhì)的改變。(六)抵抗力對熱、消毒藥及外界環(huán)境的抵抗力不強，不耐熱，60℃，20－30min即被殺死。冷凍對于沙門氏菌無殺滅作用，即使在-25℃低溫環(huán)境中仍可存活10個月左右。沙門氏菌對熱及外界環(huán)境的抵抗力屬于中等。60℃20min～30min即被殺死；在普通水中雖不易繁殖，但可存活2周～3周；在自然環(huán)境的糞便可生存1～2個月；在冰箱中可生存3～4個月；在-25℃可存活10個月左右；在干燥的墊草中可存活8周～20周。當(dāng)水煮或油炸大塊魚、肉、香腸、肉餅時，若食品內(nèi)部溫度達(dá)不到足以殺死細(xì)菌的情況下，就會有細(xì)菌殘留。對化學(xué)藥品的抵抗力較弱。如以5％苯酚或1︰500升汞處理，5min可殺死；膽鹽、煌綠及孔雀綠等對本屬細(xì)菌的抑制作用較大腸桿菌為小。?？捎靡灾苽溥x擇性培養(yǎng)基；對氯霉素敏感(目前發(fā)現(xiàn)，許多菌株都能抵抗一定濃度的硫胺類、土霉素和鏈霉素等藥品)。（七）沙門氏菌食物中毒沙門氏菌能引起人和動物的疾病，主要是通過消化道傳染。沙門氏菌食物中毒的癥狀是：急性胃腸炎，如嘔吐、腹痛、腹瀉和因細(xì)菌毒素引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀（如發(fā)燒、頭痛、有時有痙攣）。有的血清型專對人致病，如傷寒沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌為人類的傷寒和副傷寒病原菌；有些血清型專對動物致病，如馬流產(chǎn)和羊流產(chǎn)沙門氏菌為馬和羊的病原菌。有些血清型的沙門氏菌對人和動物都有致病性，它們的宿主特異性較弱。如腸炎沙門氏菌、都柏林沙門氏菌為牛傷寒的病原菌等沙門氏菌污染食物的主要原因為：①病畜或病禽的肉制成食品；②病畜或病禽的糞便污染了食物；③帶菌人在制作食物的過程中污染了食物；④生熟食品未分開而造成的交叉污染。預(yù)防①加強食品衛(wèi)生管理，防止污染：主要應(yīng)采取積極措施控制感染沙門氏菌的病畜肉類流入市場。②控制繁殖：沙門氏菌的最適繁殖溫度為37℃，但在20℃以上即能大量繁殖。因此低溫貯存食品是一項重要預(yù)防措施。③殺滅病原菌：加熱殺滅病原微生物也是預(yù)防食物中毒的重要措施。（八）沙門氏菌檢驗程序GB/T4789.4-2010BPW（堿性蛋白胨水）：用于修復(fù)受損傷的沙門氏菌，但由于其不具有選擇性，因此增菌時間過長會導(dǎo)致雜菌生長過多干擾鑒定結(jié)果，故建議最好控制在4h為好。常用選擇性培養(yǎng)基比較SC（亞硒酸鹽胱氨酸增菌液）TTB（四硫磺酸鈉煌綠增菌液）MM亞硒酸鹽抑菌胱氨酸促生長四硫酸鈉和煌綠抑菌氯化鎂和孔雀綠抑菌適合傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌生長，37℃適合其他沙門菌生長，42℃，18-24h為防漏檢宜SC+TTB/MM初步生化試驗做三糖鐵(TSI)試驗，三糖鐵試驗主要是測定細(xì)菌對葡萄糖、乳糖、蔗糖的分解、產(chǎn)氣和產(chǎn)硫化氫情況，三糖鐵培養(yǎng)基成分除牛肉膏、蛋白胨外，主要有葡萄糖(1g/L)、乳糖(10g/L)、蔗糖(10g/L)、二價鐵鹽、酚紅等，pH為7.4。培養(yǎng)基做好后，擺成高層斜面，培養(yǎng)基顏色為磚紅色。使用時先將待檢菌株穿刺接種，然后再將待檢菌株劃線接種于高層斜面上，36℃培養(yǎng)18～24h國標(biāo)中采用靛基質(zhì)、尿素、氰化鉀和賴氨酸四項生化試驗。若硫化氫＋、靛基質(zhì)－、尿素－、氰化鉀－、賴氨酸＋，可判斷為沙門氏菌屬，這是典型沙門氏菌的反應(yīng)。玻片凝集法原理步驟：先多價后單價，先常見的后不常見的，先O后H，根據(jù)結(jié)果查表得到鑒定菌種第二節(jié)食品中致病性球菌的檢驗一、金黃色葡萄球菌的檢驗金黃色葡萄球菌可以產(chǎn)生腸毒素，食后能引起食物中毒（一）形態(tài)與染色致病性葡萄球菌一般較非致病性菌小，且各個菌體的大小及排列也較整齊。細(xì)菌繁殖時呈多個平面的不規(guī)則分裂，堆積成為葡萄串狀排列。葡萄球菌無鞭毛及芽胞，一般不形成莢膜，易被堿性染料著色，G+，當(dāng)衰老、死亡或被白細(xì)胞吞噬后常轉(zhuǎn)為革蘭氏陰性，對青霉素有抗藥性的菌株也為革蘭氏陰性。(二)分類葡萄球菌屬于微球菌的葡萄球菌屬，以往的分類方法是以菌落色素將葡萄球菌分為金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌和檸檬色葡萄球菌三種。很不穩(wěn)定。據(jù)《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊》第八版，按葡萄球菌的生理化學(xué)組成，將葡萄球菌分為金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌三種。其中金黃色葡萄球菌多為致病性菌，表皮葡萄球菌偶爾致病，腐生葡萄球菌一般為非致病菌。60％-70％的金黃色葡萄球菌可被相應(yīng)的噬菌體裂解，故可用噬菌體進行分型。通常使用的基本分型噬菌體有22型，根據(jù)它們對菌株的裂解反應(yīng)，可將金黃色葡萄球菌分成以下幾群：I群：29、25、52A、79、80；II群：3A、3B、3C、55、71；III群：6、7、42E、47、53、54、75、77、83A；IV群：42D。(三)培養(yǎng)特性可產(chǎn)生不同色素，因不溶于水，故色素只限于培養(yǎng)物，而不外滲至培養(yǎng)基中。色素的形成依培養(yǎng)條件而異：通常在22℃產(chǎn)生色素較多；于37℃培養(yǎng)后，再置室溫1d-2d，色素產(chǎn)生明顯；在固體培養(yǎng)基中含有碳水化合物、牛乳或血清等，色素形成最好，有O2及CO2環(huán)境下易形成色素，而在無O2環(huán)境中不形成色素。耐鹽性強，在含5％-10％的氯化鈉培養(yǎng)基中能生長，在含有20％-30％二氧化碳的環(huán)境中培養(yǎng)，可產(chǎn)生大量的毒素。在血瓊脂平板上，形成的菌落較大，多數(shù)致病性菌株可產(chǎn)生溶血毒素，使菌落周圍產(chǎn)生透明的溶血圈(β溶血)。(四)生化特性本屬細(xì)菌大多數(shù)不能分解乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖。產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。致病菌株能分解甘露醇，產(chǎn)酸。甲基紅陽性，V—P為弱陽性，多數(shù)菌株能分解尿素產(chǎn)氨，還原硝酸鹽，不產(chǎn)生吲哚。(五)毒素與酶葡萄球菌的致病力決定于細(xì)菌產(chǎn)生的毒素和酶的能力。1、溶血毒素溶血毒素是一種外毒素，根據(jù)其對動物細(xì)胞的溶血范圍、抗原性、溶血時所需溫度等不同可分為α、β、γ、δ四種，其中以β溶血素為主。2、殺白血球毒素3、腸毒素引起急性腸胃炎，為一種可溶性蛋白質(zhì)，耐熱，經(jīng)l00℃煮沸30min不被破壞腸毒素共分6型(A、B、C1．C2、D、E)，各型具有不同的血清學(xué)特性，其中以A型引起的食物中毒最多，B型和C型次之。4、血漿凝固酶是一種能使含有枸櫞酸鈉或肝素抗凝劑的兔或人血漿發(fā)生凝固的酶。凝固酶是鑒別葡萄球菌有無致病性的重要指標(biāo)。5、溶纖維蛋白酶可使人、犬、豚鼠及家兔的已經(jīng)凝固的纖維蛋白溶解。6、透明質(zhì)酸酶是機體結(jié)締組織中基質(zhì)的主要成分。又稱為擴散因子7、脫氧核糖核酸酶脫氧核糖核酸能夠增加組織滲出物的粘性有人認(rèn)為脫氧核糖核酸酶是鑒定葡萄球菌毒力的又一指標(biāo)。(六)抗原結(jié)構(gòu)葡萄球菌經(jīng)水解后，用沉淀法分析，可得到兩種抗原成分：蛋白質(zhì)抗原多糖類抗原1．蛋白質(zhì)抗原主要為葡萄球菌A蛋白(SPA)，能抑制吞噬細(xì)胞的吞噬作用，對T、B細(xì)胞是良好的促分裂原2、多糖類抗原為半抗原，存在于細(xì)胞壁上，具有型特異性。其抗原決定簇為磷壁酸的核糖醇單位。此抗原可用于葡萄球菌的分型。(七)抵抗力葡萄球菌抵抗力較強，為不形成芽胞的細(xì)菌中最強者(八)葡萄球菌的致病性葡萄球菌能引起的疾患主要有化膿性感染（如毛囊炎、癤、癰、傷口化膿、氣管炎、肺炎、中耳炎、腦膜炎、心包炎等)；全身感染(如敗血癥、膿毒血癥等)；食物中毒等等?！け乔皇瞧咸亚蚓姆敝硤鏊?，也是身體各部位的傳染源?！て咸亚蚓浅Ｒ姷幕撔郧蚓唬摬课怀３蔀閭魅驹??；既榉垦椎哪膛．a(chǎn)的奶、·有化膿癥的宰畜肉尸常帶有致病性葡萄球菌。·葡萄球菌在不同食物、不同溫度和pH值的條件下，產(chǎn)生的腸毒素是不同的。在pH值低于5的條件下很少產(chǎn)生腸毒素，當(dāng)pH值高于9.8時，無論何型葡萄球菌腸毒素都不能產(chǎn)生?！ひ鹌咸亚蚓c毒素中毒的食品，主要為肉、奶、魚、蛋類及其制品等動物性食品?！て咸亚蚓诳諝庵醒踺^低時較易產(chǎn)生腸毒素·食品污染了葡萄球菌并同時污染了其他微生物時，葡萄球菌的繁殖則受到抑制·葡萄球菌引起的食物中毒在常發(fā)生于夏秋季節(jié)(九)發(fā)病機理A型腸毒素的毒力最強，攝入1μg即能引起中毒，而B型腸毒素攝入25μg才能引起中毒。（十)檢驗原理金黃色葡萄球菌耐鹽性強，在l00-150g/L的氯化鈉培養(yǎng)基中能生長，適宜生長的鹽濃度為5％-7.5％，可以利用這個特性對金黃色葡萄球菌增菌，抑制雜菌。金黃色葡萄球菌還可產(chǎn)生凝固酶，這是鑒定致病性金黃色葡萄球菌的重要指標(biāo)，是不是致病的金黃色葡萄球菌主要看它是否產(chǎn)生凝固酶。（十一）檢驗程序GB/T4789.10-2010第三節(jié)溶血性鏈球菌的檢驗按其在血平板上溶血能力分類，可分為甲型溶血性鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、丙型溶血性鏈球菌和亞甲型溶血性鏈球菌。人類疾病有關(guān)的大多屬于乙型溶血性鏈球菌，其血清型90%屬于A族鏈球菌，?？梢鹌つw和皮下組織的化膿性炎癥及呼吸道感染，還可通過食品引起猩紅熱、流行性咽炎的爆發(fā)性流行（一）形態(tài)與染色：革蘭氏染色陽性，衰老培養(yǎng)物常成陰性（二）培養(yǎng)特性對營養(yǎng)要求高，普通培養(yǎng)基不能良好生長，（需加血清液、腹水等）最適溫度37℃，pH7.4-7.6，含M蛋白，革蘭氏染色陽性。在液體培養(yǎng)基中，溶血菌株，呈絮狀或顆粒狀沉淀生長（上清下濁）；不溶血菌球，均勻渾濁生長，如糞鏈菌。鏈激酶：αβγδ四種溶血。(三)生化特性1、均分解葡萄糖產(chǎn)酸，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。2、對乳糖、甘露醇、水楊苷等的分解因菌株而異。3、能使牛奶產(chǎn)酸而不凝固，不液化明膠4、A群菌對桿菌肽敏感5、一般不分解菊糖，不被膽汁或1%去氧膽酸鈉所溶解。這兩種特性用來鑒定甲型溶血型鏈球菌和肺炎球菌。6、鏈球菌與葡萄球菌不同，不產(chǎn)生過氧化氫酶。（四）致病性鏈球菌可產(chǎn)生的毒素和酶1、溶血素2、致熱外毒素3、透明質(zhì)酸酶4、鏈激酶5、脂磷壁酸6、鏈道酶7、殺白細(xì)胞素1、鏈球菌溶血素：有溶解紅細(xì)胞，殺死白細(xì)胞及毒害心臟的作用，主要有“O”和“S”兩種。2、致熱外毒素：是人類猩紅熱的主要毒性物質(zhì)，可分為A、B、C三種不同抗原性的毒素。無交叉保護作用3、透明質(zhì)酸酶：又稱擴散因子4、鏈激酶：又稱鏈球菌纖維蛋白溶酶，該酶耐熱，100℃50分鐘仍可保持活性。5、脂磷壁酸（LTA）：6、鏈道酶：又稱鏈球菌DNA酶，能使膿液稀薄，促進病菌擴散。主要由A、C、G族鏈球菌產(chǎn)生。用鏈激酶、鏈道酶制劑進行皮膚試驗作為測定機體細(xì)胞免疫的一種方法。7、殺白細(xì)胞素（M蛋白）：M蛋白有抗原性，刺激機體產(chǎn)生型特異性抗體，并與變態(tài)反應(yīng)疾病有關(guān)。（五）抗原結(jié)構(gòu)鏈球菌的抗原構(gòu)造較復(fù)雜，主要有三種：（1）核蛋白抗原或稱P抗原，無特異性，各種鏈球菌均相同，與葡萄球菌有交叉。（2）多糖抗原或稱C抗原，系群特異性抗原，是細(xì)胞壁的多糖組分，可用稀鹽酸等提取。（3）蛋白質(zhì)抗原或稱表面抗原，具有型特異性，位于C抗原外層，其中可分為M、T、R、S四種不同性質(zhì)的抗原成分，與致病性有關(guān)的是M抗原。（六）鏈球菌分類1、按溶血能力分類：（1）甲型（α）溶血性鏈球菌（2）乙型（β）溶血性鏈球菌（3）丙型（γ）溶血性鏈球菌（4）亞甲型溶血性鏈球菌與人類疾病有關(guān)的大多屬于乙型溶血性鏈球菌。2．根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)分類C抗原不同可分類A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U、V等20個群。對人致病的大多屬于A群。A群又稱為化膿性鏈球菌（Pyogenicstreptococcus）。3.對氧的需要分類按照是否需要氧，可分為需氧鏈球菌、厭氧鏈球菌、微嗜氧鏈球菌。其中厭氧鏈球菌常寄生于口腔、腸道和陰道中，可致病的有消化鏈球菌屬。（七）抵抗力抵抗力不強，60℃3分鐘可殺死大部分鏈球菌，對一般消毒劑敏感，在干燥塵埃中可存活數(shù)日；乙型鏈球菌對青霉素、紅霉素、氯霉素、四環(huán)素、磺胺均敏感。(八)流行病學(xué)與致病性一般來說，溶血性鏈球菌常通過以下途徑污染食品：1、食品加工或銷售人員口腔、鼻腔、手、面部有化膿性炎癥時造成食品的污染；2、食品在加工前就已帶菌、奶?；蓟撔匀橄傺谆蛐笄菥植炕摃r，其奶和肉尸某些部位污染；3、熟食制品因包裝不善而使食品受到污染。溶血性鏈球菌常可引起皮膚、皮下組織的化膿性炎癥、呼吸道感染、流行性咽炎的爆發(fā)性流行以及新生兒敗血癥、細(xì)菌性心內(nèi)膜炎、猩紅熱和風(fēng)濕熱、腎小球腎炎等變態(tài)反應(yīng)。(九)檢驗原理1、增菌溶血性鏈球菌對營養(yǎng)要求比較高，增菌一般用匹克氏肉湯或葡萄糖肉浸液肉湯。2、分離培養(yǎng)利用溶血性鏈球菌在血平板上所形成的特殊菌落分離、純化3、驗證試驗分類：鏈激酶實驗短桿菌肽敏感實驗觀察血平板溶血情況革蘭氏染色（十）檢驗程序GB/T4789.11-2003操作步驟1.樣品處理3.培養(yǎng)特性4.鏈激酶試驗5.桿菌肽敏感試驗第四節(jié)志賀氏菌檢驗志賀氏菌屬(Shigella)的細(xì)菌通稱為痢疾桿菌，是細(xì)菌性痢疾的病原菌。臨床上能引起痢疾癥狀的病原微生物很多，如志賀氏菌屬、沙門氏菌屬、變形桿菌屬、艾希氏菌屬等，還有阿米巴原蟲、鞭毛蟲及病毒等均可引起人類痢疾，其中以志賀氏菌引起的細(xì)菌性痢疾最為常見。在食物和飲用水的衛(wèi)生檢驗時，常以是否含有志賀氏菌作為指標(biāo)。志賀氏菌屬是由四個亞群組成，即A、B、C、D四個亞群。A群:痢疾志賀氏菌，有10個抗原組成各不相同的血清型，其中包括最知名的志賀氏桿菌(1型痢疾志賀氏菌)和舒密次桿菌(2型痢疾志賀氏菌)。B群:福氏志賀氏菌，有6個血清型，其中的1～5又可分為兩個亞型，還有x、y兩個變種。C群:鮑氏志賀氏菌，有15個血清型，其中有的血清型有甘露醇陰性的變種。D群:宋內(nèi)氏志賀氏菌，只有一個種(血清型)，它具有I相(光滑型)和Ⅱ相(粗糙型)的變異。(一)形態(tài)與染色為革蘭氏陰性短桿菌無莢膜、無鞭毛、不形成芽胞，無動力，是與沙門氏菌不同之處。(三)生化特性志賀氏菌屬的細(xì)菌發(fā)酵糖類和醇類的能力遠(yuǎn)比艾希氏菌屬弱，但都能發(fā)酵葡萄糖，對側(cè)金盞花醇、肌醇和水楊苷均不發(fā)酵，對其他糖類多為少數(shù)發(fā)酵：如宋內(nèi)氏志賀氏菌對乳糖能遲緩發(fā)酵，鮑氏志賀氏菌9型的一些培養(yǎng)物能發(fā)酵，痢疾志賀氏菌I型少數(shù)培養(yǎng)物能遲緩發(fā)酵。(四)抗原結(jié)構(gòu)志賀氏桿菌有O抗原和K抗原。1、O抗原脂多糖，耐熱，穩(wěn)定。不同的志賀氏菌O抗原不同。每群志賀氏菌中不同的O抗原用羅馬數(shù)字表示Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ····同一群志賀氏菌中不同菌型所帶的O抗原也不同。2、K抗原K抗原包繞于某些新分離的痢疾桿菌表面，不耐熱，加熱100℃1h即被破壞。此抗原可以阻止菌體抗原與相應(yīng)免疫血清發(fā)生凝集。(五)抵抗力志賀氏菌屬的細(xì)菌與沙門氏菌屬及其他腸道桿菌相比，對理化因素抵抗力較低。對酸較敏感，必須使用含有緩沖劑的培養(yǎng)基。在外界環(huán)境中的生存力，宋內(nèi)氏志賀氏菌最強、福氏志賀氏菌次之，而痢疾志賀氏菌最弱。日光直射30min可殺死，56℃～60℃只需19min可殺死，1％石炭酸中15min～30min可殺死。(六)變異性1．S—R型變異菌落由光滑型變?yōu)榇植谛蜁r，常伴有生化反應(yīng)，抗原結(jié)構(gòu)和致病性的變異。2、耐藥性變異賀氏菌對四環(huán)素的耐藥率達(dá)74％、氯霉素73.6％～97％、鏈霉素84％～98％、金霉素75％～100％、磺胺類97％～100％，(七)致病性志賀氏菌的致病作用，主要是侵襲力和菌體內(nèi)毒素，個別菌株能產(chǎn)生外毒素，常使人得痢疾及食物中毒。1、侵襲力對粘膜組織的侵襲力是決定致病力的主要因素。2、內(nèi)毒素引起一系列毒血癥癥狀，如發(fā)熱、神志障礙、甚至中毒性休克。典型的痢疾膿血粘液便。3．腸毒素痢疾志賀氏菌I型和II型能產(chǎn)生腸毒素，腸毒素的活性主要在小腸發(fā)生，而菌痢的病變主要在大腸。(八)志賀氏菌的食物中毒1、流行病學(xué)志賀氏菌食物中毒常稱作志賀氏菌痢疾，傳染是從人到人，無動物宿主。傳染源是病人和帶菌者，主要通過消化道傳播。病后有一定的免疫力，但是免疫期短，也不穩(wěn)固。可能因細(xì)菌菌型多，各型細(xì)菌之間無交叉免疫性之故。2、臨床癥狀志賀氏菌食物中毒引起的細(xì)菌性痢疾可分為急性和慢性兩大類、6個不同的型。（1）急性細(xì)菌性痢疾急性細(xì)菌性痢疾又分為急性典型、急性非典型和急性中毒性菌痢三型急性典型痢疾癥狀典型，有腹痛、腹瀉、膿血粘液便、里急、后重、發(fā)熱等（2）慢性細(xì)菌性痢疾慢性菌痢又分為遷延型、慢性隱伏型和急性發(fā)作型一般認(rèn)為福氏志賀氏菌感染的慢性者較多。細(xì)菌性痢疾的帶菌者有三種類型，即恢復(fù)期帶菌者、慢性帶菌者和健康帶菌者。(九)防治措施1．加強飲水衛(wèi)生嚴(yán)格做到不喝生水。2．注意飲食衛(wèi)生自覺做到四不吃，即不吃生冷蔬菜、不吃不潔瓜果、不吃腐敗變質(zhì)食物、不吃未經(jīng)回鍋煮透的剩菜剩飯。3．自覺養(yǎng)成衛(wèi)生習(xí)慣4．早期發(fā)現(xiàn)病人早期隔離治療（十）檢驗原理：1、增