色譜分析概論課件

色譜分析概論第一節(jié)色譜法概述一、色譜法的定義和用途二、色譜法的特點三、色譜法的起源四、色譜法的分類五、色譜法的發(fā)展色譜分析概論第一節(jié)色譜法概述一、色譜法的定義和用途一、色譜法的定義及用途定義：色譜法(chromatography)，是一種物理或物理化學(xué)的分離分析方法。原理：利用物質(zhì)在固定相和流動相中的分配系數(shù)不同，使混合物中的各組分分離。以前學(xué)過的分離方法有：1.

沉淀法

是利用物質(zhì)溶解度的不同而進行分離。2.蒸餾法

是利用有機物沸點的差異進行分離。3.萃取法是利用組分在水相和有機相（互不相溶）中的分配素數(shù)不同進行而分離。

一、色譜法的定義及用途定義：色譜法(chromatogra色譜法的用途用途：色譜法已廣泛用于各個領(lǐng)域，是多組分混合物首選的分離分析方法。以《中國藥典》2005版為例，一部收載中藥1146個品種，用薄層色譜進行鑒別或含量測定的有1523項，用高效液相色譜進行定量分析的有479種518項，用氣相色譜進行檢測的有47種。二部收載的有1967個品種，采用高效液相色譜法的品種有848種?，F(xiàn)在色譜法已形成一門專門的科學(xué)。色譜法的用途用途：色譜法已廣泛用于各個領(lǐng)域，是多組分混合物首二、色譜法的起源1．創(chuàng)立：1906年，俄國植物學(xué)家Tsweet

植物色素分離見圖示

2．現(xiàn)狀：一種重要的分離、分析技術(shù)分離混合物各組分并加以分析,還可以進行制備

固定相——除了固體，還可以是液體

流動相——液體或氣體色譜柱——各種材質(zhì)和尺寸被分離組分——不再僅局限于有色物質(zhì)二、色譜法的起源1．創(chuàng)立：1906年，俄國植物學(xué)家Tsw碳酸鈣（固定相）色素混合液石油醚(流動相）1906年，Tsweet

發(fā)現(xiàn)色譜分離現(xiàn)象色譜柱色帶碳酸鈣色素混合液石油醚1906年，Tsweet

發(fā)現(xiàn)色譜分植物色素分離圖示植物色素分離圖示三、色譜法的特點優(yōu)點：“三高”、“一快”、“一廣”缺點：高選擇性、高效能、高靈敏度、分析速度快、應(yīng)用范圍廣對未知物分析的定性專屬性差需要與其他分析方法聯(lián)用(GC-MS,LC-MS)三、色譜法的特點優(yōu)點：“三高”、“一快”、“一廣”缺點：高選四、色譜法的分類1．按兩相分子的聚集狀態(tài)分類流動相固定相類型液相色譜液體固體液-固色譜液體液體液-液色譜氣體固體氣-固色譜氣體液體氣-液色譜氣相色譜超臨界流體色譜法——流動相為超臨界流體四、色譜法的分類流動相固定相色譜法分類（續(xù)前）2．按固定相的固定方式分類3．按分離機制分類平面色譜

紙色譜薄層色譜高分子薄膜色譜柱色譜

填充柱色譜毛細管柱色譜

分配色譜吸附色譜離子交換色譜空間排阻色譜毛細管電詠法毛細管電色譜法毛細管電泳色譜法分類（續(xù)前）2．按固定相的固定方式分類3．按分離機制分色譜法分類（圖示）色譜法簡單分類毛細管電泳法色譜法分類（圖示）色譜法簡單分類毛細管電泳法五、色譜法的發(fā)展1、歷史30年代茨維特分離綠葉色素，產(chǎn)生固液吸附色譜40年代液—液分配色譜法、TLC、紙色譜50年代GC出現(xiàn)使色譜具備分離和在線分析功能60年代推出了色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）

70年代HPLC出現(xiàn)使色譜分析范圍進一步擴大80年代出現(xiàn)了超臨界流體色譜法、毛細管電泳法90年代崛起的電色譜法，兼有毛細管電泳法與微微填充柱色譜法的優(yōu)點21世紀

色譜科學(xué)將在生命科學(xué)等的前沿發(fā)揮他不可替代的重要作用五、色譜法的發(fā)展1、歷史2、展望⑴新型固定相和檢測器手性固定相、浸透限制性固定相、灌注色譜固定相、生物色譜固定相等；蒸發(fā)光散射檢測器⑵色譜新方法的研究

超臨界流體色譜法、毛細管電詠法、毛細管電色譜法⑶色譜聯(lián)用技術(shù)

GC-MS、LC-MS、GC-FTIR⑷色譜專家系統(tǒng)

是一種色譜－計算機聯(lián)用技術(shù)2、展望⑴新型固定相和檢測器第二節(jié)色譜過程和基本原理一、色譜過程、分離原理及特點二、色譜流出曲線和有關(guān)概念三、分配系數(shù)與色譜分離第二節(jié)色譜過程和基本原理一、色譜過程、分離原理及特點一、色譜過程、分離原理及特點㈠色譜過程指被分離組分在兩相中的“分配”平衡過程以吸附色譜為例見圖示

吸附→解吸→再吸附→再解吸→反復(fù)多次洗脫→被測組分分配系數(shù)不同→差速遷移→分離一、色譜過程、分離原理及特點㈠色譜過程以吸附色譜為例見圖示圖示分配系數(shù)的微小差異→吸附能力的微小差異微小差異積累→較大差異→吸附能力弱的組分先流出；吸附能力強的組分后流出back圖示分配系數(shù)的微小差異→吸附能力的微小差異續(xù)前㈡色譜分離原理色譜分離基于各組分在兩相之間平衡分配的差異平衡分配可以用分配系數(shù)和分配比來衡量㈢色譜分離特點

1．不同組分通過色譜柱時的遷移速度不等→提供了分離的可能性2．各組分沿柱子擴散分布→峰寬→不利于不同組分分離續(xù)前㈡色譜分離原理㈢色譜分離特點二、色譜流出曲線和有關(guān)概念㈠色譜流出曲線和色譜峰流出曲線(色譜圖)：電信號強度隨時間變化曲線基線：無樣品時的電信號，反映儀器噪音的情況色譜峰：流出曲線上突起部分圖17－2二、色譜流出曲線和有關(guān)概念㈠色譜流出曲線和色譜峰流出曲線(色續(xù)前對稱因子正常峰（對稱）非正常峰

前沿峰

拖尾峰色譜峰——fs=0.95~1.05——fs<0.95——fs>1.05續(xù)前對稱因子正常峰（對稱）色譜峰——fs=0.95~1.05（二）保留值：色譜定性參數(shù)1.保留時間（tR)：從進樣開始到組分出現(xiàn)濃度極大點時所需時間，即組分通過色譜柱所需要的時間2.死時間（t0）：不被固定相溶解或吸附的組分的保留時間。即，分配系數(shù)為零的組分。3.調(diào)整保留時間（tR’）：組分的保留時間與死時間之差值，即組分在固定相中滯留的時間（二）保留值：色譜定性參數(shù)1.保留時間（tR)：從進樣開始到圖片圖片4.保留體積（VR）：從進樣開始到組分出現(xiàn)濃度極大點時所消耗的流動相的體積5.死體積

(V0)

：由進樣器至檢測器的流路中未被固定相占有的空間。4.保留體積（VR）：從進樣開始到組分出現(xiàn)濃度極大點時所消耗6.調(diào)整保留體積VR'：保留體積與死體積之差，即組分停留在固定相時所消耗流動相的體積7.相對保留值ri,s(選擇性系數(shù))：調(diào)整保留值之比6.調(diào)整保留體積VR'：保留體積與死體積之差，即組分停留在固8.保留指數(shù)Ix指將待測物的保留行為換算成相當(dāng)于正構(gòu)烷烴的保留行為(已知范圍內(nèi)組分的定性參數(shù))Ix:待測組分的保留指數(shù)，z與z+n為一對正構(gòu)烷烴的含C數(shù)，一般n為1。t’R(X)應(yīng)介于t’R(Z)和

t’R(Z+n)之間8.保留指數(shù)Ix指將待測物的保留行為換算成相當(dāng)于正構(gòu)烷烴的保（三）色譜峰高和峰面積2.峰面積A：指色譜曲線與基線間包圍的面積1.峰高h：指組分在柱后出現(xiàn)濃度極大時的檢測信號，即色譜峰頂至基線的距離（三）色譜峰高和峰面積2.峰面積A：指色譜曲線與基線間包圍的（四）色譜峰區(qū)域?qū)挾龋荷V柱效參數(shù)3.峰寬W：正態(tài)分布色譜曲線兩拐點切線與基線相交的截距1.標準差σ：正態(tài)分布色譜曲線兩拐點距離的一半

σ→對應(yīng)0.607h處峰寬的一半

注：σ↓小，峰↓窄，柱效↑高2.半峰寬W1/2：峰高一半處所對應(yīng)的峰寬

注：除了用于衡量柱效，還可以計算峰面積（四）色譜峰區(qū)域?qū)挾龋荷V柱效參數(shù)3.峰寬W：正態(tài)分布色譜曲圖示圖示（五）分離度R(分辨率)相臨兩組分間峰頂間距離是峰底寬平均值的幾倍,衡量色譜分離條件優(yōu)劣的參數(shù)討論：（五）分離度R(分辨率)相臨兩組分間峰頂間距離是峰底寬平均值三、分配系數(shù)與色譜分離㈠分配系數(shù)和容量因子：相平衡參數(shù)1.分配系數(shù)K(平衡常數(shù))：指在一定溫度和壓力下，組分在色譜柱中達分配平衡后，在固定相與流動相中的濃度比（色譜過程的相平衡參數(shù)）注：K為熱力學(xué)常數(shù)與組分性質(zhì)、固定相性質(zhì)、流動相性質(zhì)及溫度有關(guān)實驗條件固定，K僅與組分性質(zhì)有關(guān)三、分配系數(shù)與色譜分離㈠分配系數(shù)和容量因子：相平衡參數(shù)1.分2.容量因子k(容量比，分配比)：指在一定溫度和壓力下，組分在色譜柱中達分配平衡時，在固定相與流動相中的質(zhì)量比3.分配系數(shù)與容量因子的關(guān)系2.容量因子k(容量比，分配比)：指在一定溫度和壓力下，組（二）分配系數(shù)和容量因子與保留時間的關(guān)系保留比R'：衡量溶質(zhì)分子在色譜柱上相對移行速度R'=組分在色譜柱中遷移速度流動相的線速度vu=（二）分配系數(shù)和容量因子與保留時間的關(guān)系保留比R'：衡量溶質(zhì)續(xù)前設(shè)R為單位時間內(nèi)一個分子在流動相中出現(xiàn)的幾率設(shè)1－R為單位時間內(nèi)一個分子在固動相中出現(xiàn)的幾率續(xù)前設(shè)R為單位時間內(nèi)一個分子在流動相中出現(xiàn)的幾率設(shè)1－R為單續(xù)前討論：色譜條件一定時，tR主要取決K的大?。ㄉV法基本的定性參數(shù)）

K↑，tR↑，組分后出柱K=0，組分不保留K→∞，組分完全保留續(xù)前討論：K↑，tR↑，組分后出柱（三）色譜分離前提結(jié)論：各組分分配系數(shù)K或容量因子k不等是分離的前提。選擇合適分離條件使得難分離的組分K不等而分離.組分一定時，改變流動相、固定相和溫度，可改變K。（三）色譜分離前提結(jié)論：各組分分配系數(shù)K或容量因子k不等是分第三節(jié)基本類型色譜法的分離機制根據(jù)色譜法的作用機制不同，有多種類型色譜方法，以下列四種為基本類型：一、分配色譜法二、吸附色譜法三、離子交換色譜法四、空間排阻色譜法第三節(jié)基本類型色譜法的分離機制根據(jù)色譜法的作用機制不同，一、分配色譜法1.分離原理：將液體均勻地涂漬在惰性物質(zhì)(載體)表面上作為固定相，利用被分離組分在固定相與流動相中的溶解度差別所造成的分配系數(shù)差別而被分離。見圖示狹義分配系數(shù)注：K與組分的性質(zhì)、流動相的性質(zhì)、固定相的性質(zhì)以及柱溫有關(guān)next一、分配色譜法1.分離原理：將液體均勻地涂漬在惰性物質(zhì)(載體圖示分離機制利用組分在流動相和固定相間溶解度差別實現(xiàn)分離連續(xù)萃取過程back圖示分離機制連續(xù)萃取過程back2.固定相和流動相要求：固定相→機械吸附在惰性載體上的液體,常用的固定液有水、稀硫酸、甲醇、甲酰胺等強極性溶劑載體→惰性物質(zhì)，無吸附性性質(zhì)穩(wěn)定，不與固定相和流動相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)常用的有吸水硅膠、纖維素、多孔硅藻土等。流動相→必須與固定相不為互溶石油醚、醇類、酮類、酯類、鹵代烷及苯等。2.固定相和流動相要求：流動相→必須與固定相不為互溶石油醚、3.洗脫順序正相色譜

固定相極性大于流動相極性,主要分離極性樣品.極性弱的組分先被洗脫，極性強的組分后被洗脫。反相色譜固定相極性小于流動相極性,主要分離非極性樣品和中等極性樣品.極性強的組分先出柱，極性弱的組分后出柱。3.洗脫順序正相色譜固定相極性大于流動相極性,主要分1.分離原理各組分與流動相分子爭奪吸附劑表面活性中心,利用吸附劑對不同組分的吸附能力差異而實現(xiàn)分離.經(jīng)過吸附、解吸、再吸附、再解吸……最后混合物得到分離.見圖示

吸附平衡Xm+nYa→Xa+nYm

吸附系數(shù)二、吸附色譜法注：Ka與組分的性質(zhì)、吸附劑的活性、流動相的性質(zhì)及溫度有關(guān)next（流動相的量很大，常數(shù)）1.分離原理各組分與流動相分子爭奪吸附劑表面活性圖示a:吸附劑m:流動相Xm:流動相中的組分分子Xa:固定相中組分的分子Ym:流動相分子Ya:固定相中溶劑分子吸附過程是試樣中組分分子與流動相分子爭奪吸附劑表面活性中心的過程。

backm圖示a:吸附劑m:流動相Xm:流動相2.固定相及其選擇

固定相是表面具有許多吸附中心的吸附劑，常用吸附劑硅膠表面的硅醇基為吸附中心。經(jīng)典液相柱色譜和薄層色譜使用一般硅膠，高效液相色譜常用球型或無定型全多孔硅膠和堆積硅珠。（1）對吸附劑的要求①有大的表面積和足夠的吸附能力；②對不同的化學(xué)成分有不同的吸附力，能較好地把混合物分開；③與流動相、溶劑及樣品中各成分不起化學(xué)反應(yīng)；④在所用的溶劑及流動相中不溶解；⑤顆粒均勻，操作過程中不會碎裂。2.固定相及其選擇固定相是表面具有許多（2）吸附劑的類別①有機類淀粉、葡萄糖、聚酰胺、纖維素等②無機類氧化鋁、硅膠、活性炭、碳酸鈣、硅藻土等（3）吸附劑的活度因含水使吸附劑活度，含水量，活性(活度)級別，活性（2）吸附劑的類別①有機類淀粉、葡萄糖、聚酰胺、纖維素等（4）吸附劑的選擇a硅膠：為首選吸附劑。本身具微酸性，適用于分離酸性及中性物質(zhì)，如有機酸、氨基酸、甾體等。nextb氧化鋁：氧化鋁具有分離能力強、活性可以控制等優(yōu)點。

堿性氧化鋁pH9～10適于分析堿性、中性物質(zhì)

中性氧化鋁pH7.5適于分析酸性堿性和中性物質(zhì)

酸性氧化鋁pH4～5適于分析酸性、中性物質(zhì)C聚酰胺:氫鍵作用,氫鍵能力↑強，組分越后出柱

分離極性小的物質(zhì)，一般選用活性大些的吸附劑；反之，分離極性大的物質(zhì)，選用活性小的吸附劑。next（4）吸附劑的選擇a硅膠：為首選吸附劑。本身具微酸性，適硅膠（SiO2·H2O）結(jié)構(gòu)：內(nèi)部——硅氧交聯(lián)結(jié)構(gòu)→多孔結(jié)構(gòu)表面——有硅醇基→氫鍵作用→吸附活性中心

特性：

1）與極性物質(zhì)或不飽和化合物形成氫鍵物質(zhì)極性↑，吸附能力↑→強極性吸附中心，不易洗脫吸附活性次序：活潑型>束縛型>游離型2）吸水→失活→105～110OC烘干30分鐘(可逆失水)→吸附力最大→500OC烘干(不可逆失水)→活性喪失，無吸附力適用：分析酸性或中性物質(zhì)

back硅膠（SiO2·H2O）結(jié)構(gòu)：內(nèi)部——硅氧交聯(lián)結(jié)構(gòu)→多孔結(jié)3.流動相及其選擇（1）要求

①應(yīng)使用較純試劑，含雜質(zhì)會影響洗脫能力②與樣品或吸附劑不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)③能溶解樣品中各成分，且各被分離組分有不同的K值④粘度小，易流動

（2）流動相

流動相的洗脫能力主要由其極性決定，極性強的流動相分子占據(jù)極性中心的能力強，洗脫能力就強。流動相的選擇要依據(jù)樣品的極性、吸附劑的活性而定。3.流動相及其選擇（1）要求（2）流動相（3）常用溶劑的極性

石油醚<環(huán)己烷<二硫化碳<四氯化碳<三氯乙烷<苯<甲苯<二氯甲烷<乙醚<氯仿<乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇<吡啶<酸<水（4）流動相的選擇用硅膠或氧化鋁作色譜分離時，如被測成分極性較大，用活性較低的吸附劑，極性較大的沖洗劑；被測成分極性較小，選用活性較強的吸附劑，極性較小的沖洗劑（3）常用溶劑的極性石油醚<環(huán)己烷<二硫化碳<四氯化碳<三4.洗脫順序

吸附弱的組分先被洗脫，吸附強的組分后被洗脫。吸附的強弱與組分的性質(zhì)(極性、取代基的類型和數(shù)目、構(gòu)型）有關(guān)。一般規(guī)律是：①非極性化合物，吸附弱。②基本母核相同，分子中取代基的極性越強，或極性基團越多，分子極性越強(但要考慮其他因素的影響)，吸附能力越強。③分子中雙鍵數(shù)越多，則吸附力越強。④能形成分子內(nèi)氫鍵的化合物，其吸附能力降低。4.洗脫順序吸附弱的組分先被洗脫，吸附強的組分后常見化合物的吸附能力的順序如下：

烷烴(-CH3、-CH2-)<烯烴(-CH=CH-)<醚類(-OCH3)<硝基化合物(-NO2)<二甲胺(-N(CH3)2)<酯類(-COOR)<酮類(>C=O)<醛類(-CHO)<硫醇(-SH)<胺類(-NH2)<酰胺(-NHCOCH3)<醇類(-OH)<酚類(Ar-OH)<羧酸類(-COOH)常見化合物的吸附能力的順序如下：烷烴(-CH3、-CH2三、離子交換色譜法要求：固定相→離子交換樹脂流動相→水為溶劑的緩沖溶液被分離組分→離子型的有機物或無機物1.分離原理見圖示選擇性系數(shù)

陽離子交換樹脂RSO3-H++X+→RSO3-X++H+

注：Ks與離子的電荷數(shù)、水合離子半徑、流動相性質(zhì)、離子交換樹脂性質(zhì)以及溫度有關(guān)next固定離子可交換離子待測離子三、離子交換色譜法要求：選擇性系數(shù)陽離子交換樹脂注：K圖示分離機制：

依據(jù)被測組分與離子交換劑交換能力（親和力）不同而實現(xiàn)分離backE離子交換劑流動相可交換離子固定離子圖示分離機制：E離子交換劑流動相可交換離子固定離子2.固定相和流動相

固定相是離子交換劑——常見的是離子交換樹脂，是具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)高分子的聚合物。如，苯乙烯和二乙烯苯聚合，其中二乙烯苯是交聯(lián)劑。交聯(lián)度(degreeofcrosslinking)——指交聯(lián)劑在原料中所占總重量的百分比理論交換容量(exchangecapacity)——每克干樹脂能交換離子的毫摩爾數(shù)粒度——指離子交換樹脂顆粒的大小，一般以溶脹態(tài)所能通過的篩孔來表示。

流動相——水、緩沖溶液、或加入少量的乙醇、四氫呋喃、乙腈等有機溶劑，提高選擇性2.固定相和流動相固定相是離子交換劑——常見的是離子交換3．影響保留行為的因素

(1)溶質(zhì)離子的電荷和水合半徑：價態(tài)高，K大；同價離子，水合離子半徑增大，K小。常見陽離子在交換樹脂上的交換順序是：Fe3+>A13+>Ba2+≥pb2+>Sr2+>Ca2+>Ni2+>Cd2+≥Cu2+≥C02+≥Mg2+≥Zn2+≥Mn2+>Ag+>Cs+>Rb+>K+≥NH4+>Na+>H+>Li+

常見陰離子在交換樹脂上的交換順序通常為：檸檬酸根>P043->S042->I->NO3>SCN->NO2->C1->HCO3-

>CH3COO->OH>F-3．影響保留行為的因素(1)溶質(zhì)離子的電荷和水合半徑：價態(tài)續(xù)前(2)離子交換劑的交聯(lián)度和交換容量：在一定的范圍內(nèi)樹脂的交聯(lián)度越大，交換容量越大，則組分的保留時間越長。

(3)流動相的組成和pH：交換能力強的離子組成的流動相有較強的洗脫能力。強離子交換樹脂的交換容量不隨流動相的pH變化，調(diào)節(jié)pH值的主要作用是控制弱電解質(zhì)離解。續(xù)前(2)離子交換劑的交聯(lián)度和交換容量：在一定的范圍內(nèi)樹脂的（四）空間排阻色譜法要求：固定相→多孔性凝膠流動相→水——凝膠過濾色譜流動相→有機溶劑——凝膠滲透色譜分離機制見圖示滲透系數(shù)

注：Kp僅取決于待測分子尺寸和凝膠孔徑大小，與流動相的性質(zhì)無關(guān)。當(dāng)KP=1時，分子能進入所有的孔隙，KP=0時，分子不能進入任何孔隙。

next（四）空間排阻色譜法要求：滲透系數(shù)注：Kp僅取決于待測分子圖示分離機制：利用被測組分分子大小不同、在固定相上選擇性滲透實現(xiàn)分離back圖示分離機制：2．固定相和流動相固定相多孔凝膠，主要性能參數(shù)是：平均孔徑：凝膠孔徑大小。排斥極限：不能滲透進入凝膠的任何孔隙的某分子量(KP=0)。分子量范圍：排斥極限(KP=0)與全滲透點(KP=1)之間的分子量范圍。選擇凝膠時應(yīng)使試樣的分子量落入此范圍。流動相要選對樣品的溶解好，又能潤濕凝膠。粘度要低的溶劑，否則，會限制分子擴散而影響分離效果。一般水溶性試樣選水溶液，非水溶性試樣選四氫呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等有機溶劑。2．固定相和流動相固定相多孔凝膠，主要性能參數(shù)是：流動相3．保留體積與滲透系數(shù)的關(guān)系

凝膠色譜的保留值常用保留體積(淋洗體積)表示。當(dāng)組分的分子量在凝膠的分子量范圍內(nèi)時，其保留體積與滲透系數(shù)有如下關(guān)系：Vm為色譜柱內(nèi)凝膠的粒間體積，為凝膠孔隙的總體積。Vm近似死體積V0，所以，此式表明，分子線團尺寸(分子量)大的組分，其滲透系數(shù)小，保留體積也小，因而先被洗脫出柱。3．保留體積與滲透系數(shù)的關(guān)系凝膠色譜的保留值常用保留體積(

結(jié)論：四種色譜的分離機制各不相同，分別形成吸附平衡、分配平衡、離子交換平衡和滲透平衡。K分別為吸附系數(shù)，狹義分配系數(shù)，選擇性系數(shù)和滲透系數(shù).保留時間、保留體積和分配系數(shù)的關(guān)系皆為：

除了凝膠色譜法中的K僅與待測分子大小尺寸、凝膠孔徑大小有關(guān)外，其他三種K值都受組分的性質(zhì)、流動相的性質(zhì)、固定相的性質(zhì)以及柱溫的影響.結(jié)論：四種色譜的分離機制各不相同，分別形成吸附平衡、除了凝六、參考書及文獻1.BraithwaiteA.andSmithFJ.Chromatographicmethods.4thed.London:Chapman&HallLtd，1985．2.達世祿.色譜學(xué)導(dǎo)論．武漢：武漢大學(xué)出版社，1988.3.盧佩章、戴朝政．色譜理論基礎(chǔ)(分析化學(xué)叢書，第三卷，第一冊)．北京：科學(xué)出版社，1989.4.孫毓慶主編．現(xiàn)代色譜法及其在醫(yī)藥中的應(yīng)用．北京：人民衛(wèi)生出版社，1998.5.JournalofChromatography6.JournalofChromatographyScience7.AnalyticalChemistry8.分析化學(xué)9.色譜10.分析測試通報11.藥物分析雜志六、參考書及文獻1.BraithwaiteA.andS色譜分析概論第一節(jié)色譜法概述一、色譜法的定義和用途二、色譜法的特點三、色譜法的起源四、色譜法的分類五、色譜法的發(fā)展色譜分析概論第一節(jié)色譜法概述一、色譜法的定義和用途一、色譜法的定義及用途定義：色譜法(chromatography)，是一種物理或物理化學(xué)的分離分析方法。原理：利用物質(zhì)在固定相和流動相中的分配系數(shù)不同，使混合物中的各組分分離。以前學(xué)過的分離方法有：1.

沉淀法

是利用物質(zhì)溶解度的不同而進行分離。2.蒸餾法

是利用有機物沸點的差異進行分離。3.萃取法是利用組分在水相和有機相（互不相溶）中的分配素數(shù)不同進行而分離。

一、色譜法的定義及用途定義：色譜法(chromatogra色譜法的用途用途：色譜法已廣泛用于各個領(lǐng)域，是多組分混合物首選的分離分析方法。以《中國藥典》2005版為例，一部收載中藥1146個品種，用薄層色譜進行鑒別或含量測定的有1523項，用高效液相色譜進行定量分析的有479種518項，用氣相色譜進行檢測的有47種。二部收載的有1967個品種，采用高效液相色譜法的品種有848種?，F(xiàn)在色譜法已形成一門專門的科學(xué)。色譜法的用途用途：色譜法已廣泛用于各個領(lǐng)域，是多組分混合物首二、色譜法的起源1．創(chuàng)立：1906年，俄國植物學(xué)家Tsweet

植物色素分離見圖示

2．現(xiàn)狀：一種重要的分離、分析技術(shù)分離混合物各組分并加以分析,還可以進行制備

固定相——除了固體，還可以是液體

流動相——液體或氣體色譜柱——各種材質(zhì)和尺寸被分離組分——不再僅局限于有色物質(zhì)二、色譜法的起源1．創(chuàng)立：1906年，俄國植物學(xué)家Tsw碳酸鈣（固定相）色素混合液石油醚(流動相）1906年，Tsweet

發(fā)現(xiàn)色譜分離現(xiàn)象色譜柱色帶碳酸鈣色素混合液石油醚1906年，Tsweet

發(fā)現(xiàn)色譜分植物色素分離圖示植物色素分離圖示三、色譜法的特點優(yōu)點：“三高”、“一快”、“一廣”缺點：高選擇性、高效能、高靈敏度、分析速度快、應(yīng)用范圍廣對未知物分析的定性專屬性差需要與其他分析方法聯(lián)用(GC-MS,LC-MS)三、色譜法的特點優(yōu)點：“三高”、“一快”、“一廣”缺點：高選四、色譜法的分類1．按兩相分子的聚集狀態(tài)分類流動相固定相類型液相色譜液體固體液-固色譜液體液體液-液色譜氣體固體氣-固色譜氣體液體氣-液色譜氣相色譜超臨界流體色譜法——流動相為超臨界流體四、色譜法的分類流動相固定相色譜法分類（續(xù)前）2．按固定相的固定方式分類3．按分離機制分類平面色譜

紙色譜薄層色譜高分子薄膜色譜柱色譜

填充柱色譜毛細管柱色譜

分配色譜吸附色譜離子交換色譜空間排阻色譜毛細管電詠法毛細管電色譜法毛細管電泳色譜法分類（續(xù)前）2．按固定相的固定方式分類3．按分離機制分色譜法分類（圖示）色譜法簡單分類毛細管電泳法色譜法分類（圖示）色譜法簡單分類毛細管電泳法五、色譜法的發(fā)展1、歷史30年代茨維特分離綠葉色素，產(chǎn)生固液吸附色譜40年代液—液分配色譜法、TLC、紙色譜50年代GC出現(xiàn)使色譜具備分離和在線分析功能60年代推出了色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）

70年代HPLC出現(xiàn)使色譜分析范圍進一步擴大80年代出現(xiàn)了超臨界流體色譜法、毛細管電泳法90年代崛起的電色譜法，兼有毛細管電泳法與微微填充柱色譜法的優(yōu)點21世紀

色譜科學(xué)將在生命科學(xué)等的前沿發(fā)揮他不可替代的重要作用五、色譜法的發(fā)展1、歷史2、展望⑴新型固定相和檢測器手性固定相、浸透限制性固定相、灌注色譜固定相、生物色譜固定相等；蒸發(fā)光散射檢測器⑵色譜新方法的研究

超臨界流體色譜法、毛細管電詠法、毛細管電色譜法⑶色譜聯(lián)用技術(shù)

GC-MS、LC-MS、GC-FTIR⑷色譜專家系統(tǒng)

是一種色譜－計算機聯(lián)用技術(shù)2、展望⑴新型固定相和檢測器第二節(jié)色譜過程和基本原理一、色譜過程、分離原理及特點二、色譜流出曲線和有關(guān)概念三、分配系數(shù)與色譜分離第二節(jié)色譜過程和基本原理一、色譜過程、分離原理及特點一、色譜過程、分離原理及特點㈠色譜過程指被分離組分在兩相中的“分配”平衡過程以吸附色譜為例見圖示

吸附→解吸→再吸附→再解吸→反復(fù)多次洗脫→被測組分分配系數(shù)不同→差速遷移→分離一、色譜過程、分離原理及特點㈠色譜過程以吸附色譜為例見圖示圖示分配系數(shù)的微小差異→吸附能力的微小差異微小差異積累→較大差異→吸附能力弱的組分先流出；吸附能力強的組分后流出back圖示分配系數(shù)的微小差異→吸附能力的微小差異續(xù)前㈡色譜分離原理色譜分離基于各組分在兩相之間平衡分配的差異平衡分配可以用分配系數(shù)和分配比來衡量㈢色譜分離特點

1．不同組分通過色譜柱時的遷移速度不等→提供了分離的可能性2．各組分沿柱子擴散分布→峰寬→不利于不同組分分離續(xù)前㈡色譜分離原理㈢色譜分離特點二、色譜流出曲線和有關(guān)概念㈠色譜流出曲線和色譜峰流出曲線(色譜圖)：電信號強度隨時間變化曲線基線：無樣品時的電信號，反映儀器噪音的情況色譜峰：流出曲線上突起部分圖17－2二、色譜流出曲線和有關(guān)概念㈠色譜流出曲線和色譜峰流出曲線(色續(xù)前對稱因子正常峰（對稱）非正常峰

前沿峰

拖尾峰色譜峰——fs=0.95~1.05——fs<0.95——fs>1.05續(xù)前對稱因子正常峰（對稱）色譜峰——fs=0.95~1.05（二）保留值：色譜定性參數(shù)1.保留時間（tR)：從進樣開始到組分出現(xiàn)濃度極大點時所需時間，即組分通過色譜柱所需要的時間2.死時間（t0）：不被固定相溶解或吸附的組分的保留時間。即，分配系數(shù)為零的組分。3.調(diào)整保留時間（tR’）：組分的保留時間與死時間之差值，即組分在固定相中滯留的時間（二）保留值：色譜定性參數(shù)1.保留時間（tR)：從進樣開始到圖片圖片4.保留體積（VR）：從進樣開始到組分出現(xiàn)濃度極大點時所消耗的流動相的體積5.死體積

(V0)

：由進樣器至檢測器的流路中未被固定相占有的空間。4.保留體積（VR）：從進樣開始到組分出現(xiàn)濃度極大點時所消耗6.調(diào)整保留體積VR'：保留體積與死體積之差，即組分停留在固定相時所消耗流動相的體積7.相對保留值ri,s(選擇性系數(shù))：調(diào)整保留值之比6.調(diào)整保留體積VR'：保留體積與死體積之差，即組分停留在固8.保留指數(shù)Ix指將待測物的保留行為換算成相當(dāng)于正構(gòu)烷烴的保留行為(已知范圍內(nèi)組分的定性參數(shù))Ix:待測組分的保留指數(shù)，z與z+n為一對正構(gòu)烷烴的含C數(shù)，一般n為1。t’R(X)應(yīng)介于t’R(Z)和

t’R(Z+n)之間8.保留指數(shù)Ix指將待測物的保留行為換算成相當(dāng)于正構(gòu)烷烴的保（三）色譜峰高和峰面積2.峰面積A：指色譜曲線與基線間包圍的面積1.峰高h：指組分在柱后出現(xiàn)濃度極大時的檢測信號，即色譜峰頂至基線的距離（三）色譜峰高和峰面積2.峰面積A：指色譜曲線與基線間包圍的（四）色譜峰區(qū)域?qū)挾龋荷V柱效參數(shù)3.峰寬W：正態(tài)分布色譜曲線兩拐點切線與基線相交的截距1.標準差σ：正態(tài)分布色譜曲線兩拐點距離的一半

σ→對應(yīng)0.607h處峰寬的一半

注：σ↓小，峰↓窄，柱效↑高2.半峰寬W1/2：峰高一半處所對應(yīng)的峰寬

注：除了用于衡量柱效，還可以計算峰面積（四）色譜峰區(qū)域?qū)挾龋荷V柱效參數(shù)3.峰寬W：正態(tài)分布色譜曲圖示圖示（五）分離度R(分辨率)相臨兩組分間峰頂間距離是峰底寬平均值的幾倍,衡量色譜分離條件優(yōu)劣的參數(shù)討論：（五）分離度R(分辨率)相臨兩組分間峰頂間距離是峰底寬平均值三、分配系數(shù)與色譜分離㈠分配系數(shù)和容量因子：相平衡參數(shù)1.分配系數(shù)K(平衡常數(shù))：指在一定溫度和壓力下，組分在色譜柱中達分配平衡后，在固定相與流動相中的濃度比（色譜過程的相平衡參數(shù)）注：K為熱力學(xué)常數(shù)與組分性質(zhì)、固定相性質(zhì)、流動相性質(zhì)及溫度有關(guān)實驗條件固定，K僅與組分性質(zhì)有關(guān)三、分配系數(shù)與色譜分離㈠分配系數(shù)和容量因子：相平衡參數(shù)1.分2.容量因子k(容量比，分配比)：指在一定溫度和壓力下，組分在色譜柱中達分配平衡時，在固定相與流動相中的質(zhì)量比3.分配系數(shù)與容量因子的關(guān)系2.容量因子k(容量比，分配比)：指在一定溫度和壓力下，組（二）分配系數(shù)和容量因子與保留時間的關(guān)系保留比R'：衡量溶質(zhì)分子在色譜柱上相對移行速度R'=組分在色譜柱中遷移速度流動相的線速度vu=（二）分配系數(shù)和容量因子與保留時間的關(guān)系保留比R'：衡量溶質(zhì)續(xù)前設(shè)R為單位時間內(nèi)一個分子在流動相中出現(xiàn)的幾率設(shè)1－R為單位時間內(nèi)一個分子在固動相中出現(xiàn)的幾率續(xù)前設(shè)R為單位時間內(nèi)一個分子在流動相中出現(xiàn)的幾率設(shè)1－R為單續(xù)前討論：色譜條件一定時，tR主要取決K的大?。ㄉV法基本的定性參數(shù)）

K↑，tR↑，組分后出柱K=0，組分不保留K→∞，組分完全保留續(xù)前討論：K↑，tR↑，組分后出柱（三）色譜分離前提結(jié)論：各組分分配系數(shù)K或容量因子k不等是分離的前提。選擇合適分離條件使得難分離的組分K不等而分離.組分一定時，改變流動相、固定相和溫度，可改變K。（三）色譜分離前提結(jié)論：各組分分配系數(shù)K或容量因子k不等是分第三節(jié)基本類型色譜法的分離機制根據(jù)色譜法的作用機制不同，有多種類型色譜方法，以下列四種為基本類型：一、分配色譜法二、吸附色譜法三、離子交換色譜法四、空間排阻色譜法第三節(jié)基本類型色譜法的分離機制根據(jù)色譜法的作用機制不同，一、分配色譜法1.分離原理：將液體均勻地涂漬在惰性物質(zhì)(載體)表面上作為固定相，利用被分離組分在固定相與流動相中的溶解度差別所造成的分配系數(shù)差別而被分離。見圖示狹義分配系數(shù)注：K與組分的性質(zhì)、流動相的性質(zhì)、固定相的性質(zhì)以及柱溫有關(guān)next一、分配色譜法1.分離原理：將液體均勻地涂漬在惰性物質(zhì)(載體圖示分離機制利用組分在流動相和固定相間溶解度差別實現(xiàn)分離連續(xù)萃取過程back圖示分離機制連續(xù)萃取過程back2.固定相和流動相要求：固定相→機械吸附在惰性載體上的液體,常用的固定液有水、稀硫酸、甲醇、甲酰胺等強極性溶劑載體→惰性物質(zhì)，無吸附性性質(zhì)穩(wěn)定，不與固定相和流動相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)常用的有吸水硅膠、纖維素、多孔硅藻土等。流動相→必須與固定相不為互溶石油醚、醇類、酮類、酯類、鹵代烷及苯等。2.固定相和流動相要求：流動相→必須與固定相不為互溶石油醚、3.洗脫順序正相色譜

固定相極性大于流動相極性,主要分離極性樣品.極性弱的組分先被洗脫，極性強的組分后被洗脫。反相色譜固定相極性小于流動相極性,主要分離非極性樣品和中等極性樣品.極性強的組分先出柱，極性弱的組分后出柱。3.洗脫順序正相色譜固定相極性大于流動相極性,主要分1.分離原理各組分與流動相分子爭奪吸附劑表面活性中心,利用吸附劑對不同組分的吸附能力差異而實現(xiàn)分離.經(jīng)過吸附、解吸、再吸附、再解吸……最后混合物得到分離.見圖示

吸附平衡Xm+nYa→Xa+nYm

吸附系數(shù)二、吸附色譜法注：Ka與組分的性質(zhì)、吸附劑的活性、流動相的性質(zhì)及溫度有關(guān)next（流動相的量很大，常數(shù)）1.分離原理各組分與流動相分子爭奪吸附劑表面活性圖示a:吸附劑m:流動相Xm:流動相中的組分分子Xa:固定相中組分的分子Ym:流動相分子Ya:固定相中溶劑分子吸附過程是試樣中組分分子與流動相分子爭奪吸附劑表面活性中心的過程。

backm圖示a:吸附劑m:流動相Xm:流動相2.固定相及其選擇

固定相是表面具有許多吸附中心的吸附劑，常用吸附劑硅膠表面的硅醇基為吸附中心。經(jīng)典液相柱色譜和薄層色譜使用一般硅膠，高效液相色譜常用球型或無定型全多孔硅膠和堆積硅珠。（1）對吸附劑的要求①有大的表面積和足夠的吸附能力；②對不同的化學(xué)成分有不同的吸附力，能較好地把混合物分開；③與流動相、溶劑及樣品中各成分不起化學(xué)反應(yīng)；④在所用的溶劑及流動相中不溶解；⑤顆粒均勻，操作過程中不會碎裂。2.固定相及其選擇固定相是表面具有許多（2）吸附劑的類別①有機類淀粉、葡萄糖、聚酰胺、纖維素等②無機類氧化鋁、硅膠、活性炭、碳酸鈣、硅藻土等（3）吸附劑的活度因含水使吸附劑活度，含水量，活性(活度)級別，活性（2）吸附劑的類別①有機類淀粉、葡萄糖、聚酰胺、纖維素等（4）吸附劑的選擇a硅膠：為首選吸附劑。本身具微酸性，適用于分離酸性及中性物質(zhì)，如有機酸、氨基酸、甾體等。nextb氧化鋁：氧化鋁具有分離能力強、活性可以控制等優(yōu)點。

堿性氧化鋁pH9～10適于分析堿性、中性物質(zhì)

中性氧化鋁pH7.5適于分析酸性堿性和中性物質(zhì)

酸性氧化鋁pH4～5適于分析酸性、中性物質(zhì)C聚酰胺:氫鍵作用,氫鍵能力↑強，組分越后出柱

分離極性小的物質(zhì)，一般選用活性大些的吸附劑；反之，分離極性大的物質(zhì)，選用活性小的吸附劑。next（4）吸附劑的選擇a硅膠：為首選吸附劑。本身具微酸性，適硅膠（SiO2·H2O）結(jié)構(gòu)：內(nèi)部——硅氧交聯(lián)結(jié)構(gòu)→多孔結(jié)構(gòu)表面——有硅醇基→氫鍵作用→吸附活性中心

特性：

1）與極性物質(zhì)或不飽和化合物形成氫鍵物質(zhì)極性↑，吸附能力↑→強極性吸附中心，不易洗脫吸附活性次序：活潑型>束縛型>游離型2）吸水→失活→105～110OC烘干30分鐘(可逆失水)→吸附力最大→500OC烘干(不可逆失水)→活性喪失，無吸附力適用：分析酸性或中性物質(zhì)

back硅膠（SiO2·H2O）結(jié)構(gòu)：內(nèi)部——硅氧交聯(lián)結(jié)構(gòu)→多孔結(jié)3.流動相及其選擇（1）要求

①應(yīng)使用較純試劑，含雜質(zhì)會影響洗脫能力②與樣品或吸附劑不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)③能溶解樣品中各成分，且各被分離組分有不同的K值④粘度小，易流動

（2）流動相

流動相的洗脫能力主要由其極性決定，極性強的流動相分子占據(jù)極性中心的能力強，洗脫能力就強。流動相的選擇要依據(jù)樣品的極性、吸附劑的活性而定。3.流動相及其選擇（1）要求（2）流動相（3）常用溶劑的極性

石油醚<環(huán)己烷<二硫化碳<四氯化碳<三氯乙烷<苯<甲苯<二氯甲烷<乙醚<氯仿<乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇<吡啶<酸<水（4）流動相的選擇用硅膠或氧化鋁作色譜分離時，如被測成分極性較大，用活性較低的吸附劑，極性較大的沖洗劑；被測成分極性較小，選用活性較強的吸附劑，極性較小的沖洗劑（3）常用溶劑的極性石油醚<環(huán)己烷<二硫化碳<四氯化碳<三4.洗脫順序

吸附弱的組分先被洗脫，吸附強的組分后被洗脫。吸附的強弱與組分的性質(zhì)(極性、取代基的類型和數(shù)目、構(gòu)型）有關(guān)。一般規(guī)律是：①非極性化合物，吸附弱。②基本母核相同，分子中取代基的極性越強，或極性基團越多，分子極性越強(但要考慮其他因素的影響)，吸附能力越強。③分子中雙鍵數(shù)越多，則吸附力越強。④能形成分子內(nèi)氫鍵的化合物，其吸附能力降低。4.洗脫順序吸附弱的組分先被洗脫，吸附強的組分后常見化合物的吸附能力的順序如下：

烷烴(-CH3、-CH2-)<烯烴(-CH=CH-)<醚類(-OCH3)<硝基化合物(-NO2)<二甲胺(-N(CH3)2)<酯類(-COOR)<酮類(>C=O)<醛類(-CHO)<硫醇(-SH)<胺類(-NH2)<酰胺(-NHCOCH3)<醇類(-OH)<酚類(Ar-OH)<羧酸類(-COOH)常見化合物的吸附能力的順序如下：烷烴(-CH3、-CH2三、離子交換色譜法要求：固定相→離子交換樹脂流動相→水為溶劑的緩沖溶液被分離組分→離子型的有機物或無機物1.分離原理見圖示選擇性系數(shù)

陽離子交換樹脂RSO3-H++X+→RSO3-X++H+

注：Ks與離子的電荷數(shù)、水合離子半徑、流動相性質(zhì)、離子交換樹脂性質(zhì)以及溫度有關(guān)next固定離子可交換離子待測離子三、離子交換色譜法要求：選擇性系數(shù)陽離子交換樹脂注：K圖示分離機制：

依據(jù)被測組分與離子交換劑交換能力（親和力）不同而實現(xiàn)分離backE離子交換劑流動相可交換離子固定離子圖示分離機制：E離子交換劑流動相可交換離子固定離子2.固定相和流動相

固定相是離子交換劑——常見的是離子交換樹脂，是具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)高分子的聚合物。如，苯乙烯和二乙烯苯聚合，其中二乙烯苯是交聯(lián)劑。交聯(lián)度(degreeofcrosslinking)——指交聯(lián)劑在原料中所占總重量的