實時熒光定量pcr原理及應(yīng)用課件

實時熒光定量PCR原理及應(yīng)用上海吉泰生物科技有限公司張達(dá)威實時熒光定量PCR原理及應(yīng)用上海吉泰生物科技有限公司張達(dá)威1主要內(nèi)容熒光定量PCR原理熒光定量PCR方法與應(yīng)用主要內(nèi)容熒光定量PCR原理2熒光定量PCR定義

在PCR反應(yīng)體系中，加入熒光集團(tuán)，利用熒光信號的累積對PCR反應(yīng)過程實時監(jiān)控，最終對初始模板進(jìn)行定量。熒光定量PCR定義3傳統(tǒng)PCR定量與實時定量PCR

傳統(tǒng)的PCR定量是一種終點法的檢測：

動態(tài)范圍受限檢測重現(xiàn)性極差

實時定量PCR依靠熒光信號的擴(kuò)增進(jìn)行檢測：

靈敏度高重復(fù)性好動態(tài)范圍寬高通量傳統(tǒng)PCR定量與實時定量PCR傳統(tǒng)的PCR定量是一種終點法4Gel-basedquantification11,500counts/5200counts=2.2folddifferenceGel-basedquantification11,5005Real-timequantificationCt18andCt22,2^(4Ctshift)=16folddifferenceReal-timequantificationCt186Ct終點檢測重復(fù)性好精確度高誤差小傳統(tǒng)PCR與實時定量PCRCt終點檢測重復(fù)性好傳統(tǒng)PCR與實時定量PCR7閾值threshold：在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段，在擴(kuò)增曲線任意位置上人為設(shè)定的一個值，一般我們將熒光閾值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。CT=cyclethreshold即閾值循環(huán)數(shù)：熒光信號達(dá)到閾值設(shè)定值時PCR所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。閾值與CT值閾值threshold：在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段，在擴(kuò)增曲線8檢測極限[DNA]CycleCtCtCt閾值thresholdC(t)值與閾值檢測極限[DNA]CycleCtCtCt閾值thresho9熒光定量PCR原理

起始模板濃度的對數(shù)與C(t)值成反比熒光定量PCR原理

起始模板濃度的對數(shù)與C(t)值成反比10如何定量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線所測樣本C(t)值定量如何定量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線11標(biāo)準(zhǔn)曲線通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的Ct值，依據(jù)Log起始拷貝量與Ct的線性關(guān)系，就可以計算出樣品中所含的模板量標(biāo)準(zhǔn)曲線12熒光定量PCR方法熒光染料法熒光探針法熒光定量PCR方法熒光染料法13SYBRGreenI?

TaqMan?MolecularBeaconsDNAbindingProbebaseddetectionTaqTaq染料和探針SYBRGreenI?

DNAbindingProbe14SYBRGreen:最大吸收波長約為497nm，發(fā)射波長最大約為520nm

染料只與雙鏈DNA小溝結(jié)合，單鏈不結(jié)合游離時熒光信號非常低，結(jié)合后熒光信號強度增強1000倍

不能區(qū)分引物二聚體，單鏈二級結(jié)構(gòu)，非特異性產(chǎn)物需要做熔解曲線分析產(chǎn)物的單一性SYBRgreen是一個很好的初級化學(xué)試劑，價格上存在優(yōu)勢，在試驗驗證和問題分析上非常有用。SYBRGreen法作用機理SYBRGreen:SYBRgreen是一個很好的初級15熔解曲線分析單一峰，無非特異性產(chǎn)物，定量準(zhǔn)確有雜峰，有非特異性產(chǎn)物，定量不準(zhǔn)確熔解曲線分析單一峰，無非特異性產(chǎn)物，定量準(zhǔn)確有雜峰，有非特異16unboundprobe

freeinsolutionLightemissionLightenergytransferTaqReporterdyeAcceptordye(Quencher)TaqLightemissionLight特點：

特異性高：只有引物和探針都和同一模板結(jié)合時才能檢測完全實時監(jiān)測：一分子熒光信號對應(yīng)一條DNA鏈的產(chǎn)生多通道檢測：可以在一次反應(yīng)中同時檢測多個不同目的基因序列Taqman探針法Taqman探針：是與目的序列互補的寡聚核苷酸，5‘端標(biāo)記熒光報告集團(tuán)，3’端標(biāo)記熒光淬滅集團(tuán)，探針完整時不發(fā)出熒光，水解后發(fā)出熒光。unboundprobe

freeinsolution17HCV(FAM)RNAvirus65bpampliconHIV-1(HEX)RNAVirus74bpampliconHBV(CY5)DNAvirus81bpampliconTaqman三通道實驗DanielCandotti-Cambridge,UKHCV(FAM)HIV-1(HEX)HBV(CY518絕對定量相對定量SNP分析實時定量PCR應(yīng)用絕對定量實時定量PCR應(yīng)用19應(yīng)用之一：病原體檢測與定量絕對定量（檢測起始模板數(shù)的精確拷貝數(shù)－病原體的多少）標(biāo)準(zhǔn)品（如質(zhì)粒）：做系列梯度稀釋待測樣本陰性對照（NTC）應(yīng)用之一：病原體檢測與定量絕對定量（檢測起始模板數(shù)的精確拷貝20應(yīng)用之一：病原體檢測與定量1432應(yīng)用之一：病原體檢測與定量143221應(yīng)用之一：病原體檢測與定量應(yīng)用之一：病原體檢測與定量22應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析相對定量：基因表達(dá)量上升或者表達(dá)被抑止的倍數(shù)兩種樣品：Calibrator（對照，如正常組織）與Sample（待測樣品）兩個基因：目的基因與看家基因應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析相對定量：基因表達(dá)量上升或者表達(dá)被23Normalizer看家基因應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析CalibratorSampleGeneofInterest目的基因CtCtCtCtCt1Ct2Normalizer應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析Calibra24應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析基因表達(dá)差異＝2

/2Ct1Ct2＝2Ct1-Ct2應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析基因表達(dá)差異＝2/225應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析RNA抽提RT定量PCRcDNA產(chǎn)物系列稀釋兩個基因的擴(kuò)增效率應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析RNA抽提RT定量PCRcDNA產(chǎn)26應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析1234應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析123427

應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析28兩條探針分別針對不同等位基因ACGTACGT應(yīng)用之三：SNP分析兩條探針分別針對不同等位基因ACGTACGT應(yīng)用之三：SNP29應(yīng)用之三：SNP分析FAMTETFAMTET12應(yīng)用之三：SNP分析FAMTETFAMTET1230應(yīng)用之三：SNP分析21應(yīng)用之三：SNP分析2131Thankyou！選擇吉泰，選擇成功！Thankyou！選擇吉泰，選擇成功！32試驗設(shè)計與優(yōu)化PCR是精確性很高的實驗，實驗前我們需要完整的實驗設(shè)計方案，而且實驗條件對結(jié)果影響也很大。PCR擴(kuò)增效率：保證實驗的精確性和重復(fù)性。影響擴(kuò)增效率的因素：擴(kuò)增子長度；擴(kuò)增子GC含量；擴(kuò)增子、引物、探針二級結(jié)構(gòu)；PCR各組分反應(yīng)濃度；模板濃度。試驗設(shè)計與優(yōu)化PCR是精確性很高的實驗，實驗前我們需要完整的33引物設(shè)計原則擴(kuò)增片段100-200bp引物長度18-30bp，Tm在58-62℃之間，上下游引物Tm值不超過2℃GC含量在30-80%，避免出現(xiàn)多個重復(fù)堿基，3’端不為G或C。避免引物內(nèi)二級結(jié)構(gòu)，引物間二聚體出現(xiàn)。跨外顯子設(shè)計引物，消除基因組DNA擴(kuò)增引物設(shè)計原則擴(kuò)增片段100-200bp34探針設(shè)計原則Taqman探針長度25-32bp，Tm在68-72℃之間，確保比引物的Tm值大5-10℃GC含量在30-80%，避免出現(xiàn)多個重復(fù)堿基5’端不能為G，G能淬滅熒光信號Taqman探針要靠近上游引物，最好只有一個堿基距離。避免探針與引物間形成二級結(jié)構(gòu)SNP位點應(yīng)設(shè)計在探針中間位置探針設(shè)計原則Taqman探針長度25-32bp，Tm在68-35實時PCR體系優(yōu)化基本參數(shù)的優(yōu)化MgCl2的濃度，DNA：2-5mM;mRNA：4-8mM。模板濃度，系列稀釋梯度模板，CP在15-30之間。而CP值的確定經(jīng)驗上是SYBRGreen熒光信號是本底的2倍，雜交探針熒光強度是本底的0.3倍。實時PCR體系優(yōu)化基本參數(shù)的優(yōu)化36使用SYBRGreen測定DNA的優(yōu)化MgCl2的濃度，2-4mM模板濃度，DNA：50ng-5pg；質(zhì)粒：106拷貝引物濃度，0.3uM退火濃度，比計算出的Tm小5℃使用SYBRGreen測定DNA的優(yōu)化37使用SYBRGreen進(jìn)行一步法RT-PCR的條件優(yōu)化MgCl2的濃度，4-8mM模板濃度，總RNA或mRNA：1pg-1ug使用SYBRGreen進(jìn)行一步法RT-PCR的條件優(yōu)化38雜交探針測定DNAMgCl2的濃度，不要超過2mM探針濃度，0.2uM雜交探針測定DNA39雜交探針進(jìn)行實施定量RT-PCRMgCl2的濃度，4-8mM之間探針濃度，0.2uM模板濃度設(shè)置，1pg-1ug的總RNA或是mRNA雜交探針進(jìn)行實施定量RT-PCR40熒光定量PCR儀的硬件條件激發(fā)光源熱循環(huán)－加熱、制冷樣品檢測設(shè)備熒光定量PCR儀的硬件條件激發(fā)光源熱循環(huán)－加熱、制冷樣41熒光定量PCR儀應(yīng)滿足的要求光源的光譜范圍寬廣，能激發(fā)不同的熒光染料能分開不同熒光素的激發(fā)光與發(fā)射光波長能檢測的靈敏度與動態(tài)檢測范圍準(zhǔn)確的溫度控制和良好的孔間溫度均一性.熒光定量PCR儀應(yīng)滿足的要求光源的光譜范圍寬廣，能激發(fā)不同的42

Stratagene公司成立于1984年,致力于發(fā)展生命科學(xué)領(lǐng)域的創(chuàng)新產(chǎn)品與科技.總部位于美國LaJolla,California.在歐洲與日本設(shè)有分公司.2007年被Agilent公司收購，成為Agilent公司旗下品牌。Stratagene公司簡介Stratagene公司成立于1984年,致力43Mx3000P整體設(shè)計熱蓋熱循環(huán)系統(tǒng)石英鹵鎢燈發(fā)射光濾鏡輪激發(fā)光濾鏡輪光纖掃描臂Mx3000P整體設(shè)計熱蓋熱循環(huán)系統(tǒng)石英鹵鎢燈發(fā)射光濾鏡輪44儀器優(yōu)勢石英鹵鎢燈的激發(fā)光源：超長的激發(fā)光范圍350-750nm多通道設(shè)計，濾光片可靈活定制卓越的孔間均一性和溫度控制，72℃時+0.25℃光學(xué)掃描設(shè)計:避免邊緣效應(yīng)；光電倍增管增加檢測的靈敏度內(nèi)置芯片，具有斷電保護(hù)功能人性化的軟件，實時監(jiān)測，直觀易用，功能強大儀器優(yōu)勢石英鹵鎢燈的激發(fā)光源：超長的激發(fā)光范圍350-7545開放的平臺，選擇你心儀的試劑與耗材完善的售后支持，您的滿意是我們最大的目標(biāo)開放的平臺，選擇你心儀的試劑與耗材46本文觀看結(jié)束?。。”疚挠^看結(jié)束?。?！47謝謝欣賞！謝謝48實時熒光定量pcr原理及應(yīng)用課件49實時熒光定量PCR原理及應(yīng)用上海吉泰生物科技有限公司張達(dá)威實時熒光定量PCR原理及應(yīng)用上海吉泰生物科技有限公司張達(dá)威50主要內(nèi)容熒光定量PCR原理熒光定量PCR方法與應(yīng)用主要內(nèi)容熒光定量PCR原理51熒光定量PCR定義

在PCR反應(yīng)體系中，加入熒光集團(tuán)，利用熒光信號的累積對PCR反應(yīng)過程實時監(jiān)控，最終對初始模板進(jìn)行定量。熒光定量PCR定義52傳統(tǒng)PCR定量與實時定量PCR

傳統(tǒng)的PCR定量是一種終點法的檢測：

動態(tài)范圍受限檢測重現(xiàn)性極差

實時定量PCR依靠熒光信號的擴(kuò)增進(jìn)行檢測：

靈敏度高重復(fù)性好動態(tài)范圍寬高通量傳統(tǒng)PCR定量與實時定量PCR傳統(tǒng)的PCR定量是一種終點法53Gel-basedquantification11,500counts/5200counts=2.2folddifferenceGel-basedquantification11,50054Real-timequantificationCt18andCt22,2^(4Ctshift)=16folddifferenceReal-timequantificationCt1855Ct終點檢測重復(fù)性好精確度高誤差小傳統(tǒng)PCR與實時定量PCRCt終點檢測重復(fù)性好傳統(tǒng)PCR與實時定量PCR56閾值threshold：在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段，在擴(kuò)增曲線任意位置上人為設(shè)定的一個值，一般我們將熒光閾值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。CT=cyclethreshold即閾值循環(huán)數(shù)：熒光信號達(dá)到閾值設(shè)定值時PCR所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。閾值與CT值閾值threshold：在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段，在擴(kuò)增曲線57檢測極限[DNA]CycleCtCtCt閾值thresholdC(t)值與閾值檢測極限[DNA]CycleCtCtCt閾值thresho58熒光定量PCR原理

起始模板濃度的對數(shù)與C(t)值成反比熒光定量PCR原理

起始模板濃度的對數(shù)與C(t)值成反比59如何定量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線所測樣本C(t)值定量如何定量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線60標(biāo)準(zhǔn)曲線通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的Ct值，依據(jù)Log起始拷貝量與Ct的線性關(guān)系，就可以計算出樣品中所含的模板量標(biāo)準(zhǔn)曲線61熒光定量PCR方法熒光染料法熒光探針法熒光定量PCR方法熒光染料法62SYBRGreenI?

TaqMan?MolecularBeaconsDNAbindingProbebaseddetectionTaqTaq染料和探針SYBRGreenI?

DNAbindingProbe63SYBRGreen:最大吸收波長約為497nm，發(fā)射波長最大約為520nm

染料只與雙鏈DNA小溝結(jié)合，單鏈不結(jié)合游離時熒光信號非常低，結(jié)合后熒光信號強度增強1000倍

不能區(qū)分引物二聚體，單鏈二級結(jié)構(gòu)，非特異性產(chǎn)物需要做熔解曲線分析產(chǎn)物的單一性SYBRgreen是一個很好的初級化學(xué)試劑，價格上存在優(yōu)勢，在試驗驗證和問題分析上非常有用。SYBRGreen法作用機理SYBRGreen:SYBRgreen是一個很好的初級64熔解曲線分析單一峰，無非特異性產(chǎn)物，定量準(zhǔn)確有雜峰，有非特異性產(chǎn)物，定量不準(zhǔn)確熔解曲線分析單一峰，無非特異性產(chǎn)物，定量準(zhǔn)確有雜峰，有非特異65unboundprobe

freeinsolutionLightemissionLightenergytransferTaqReporterdyeAcceptordye(Quencher)TaqLightemissionLight特點：

特異性高：只有引物和探針都和同一模板結(jié)合時才能檢測完全實時監(jiān)測：一分子熒光信號對應(yīng)一條DNA鏈的產(chǎn)生多通道檢測：可以在一次反應(yīng)中同時檢測多個不同目的基因序列Taqman探針法Taqman探針：是與目的序列互補的寡聚核苷酸，5‘端標(biāo)記熒光報告集團(tuán)，3’端標(biāo)記熒光淬滅集團(tuán)，探針完整時不發(fā)出熒光，水解后發(fā)出熒光。unboundprobe

freeinsolution66HCV(FAM)RNAvirus65bpampliconHIV-1(HEX)RNAVirus74bpampliconHBV(CY5)DNAvirus81bpampliconTaqman三通道實驗DanielCandotti-Cambridge,UKHCV(FAM)HIV-1(HEX)HBV(CY567絕對定量相對定量SNP分析實時定量PCR應(yīng)用絕對定量實時定量PCR應(yīng)用68應(yīng)用之一：病原體檢測與定量絕對定量（檢測起始模板數(shù)的精確拷貝數(shù)－病原體的多少）標(biāo)準(zhǔn)品（如質(zhì)粒）：做系列梯度稀釋待測樣本陰性對照（NTC）應(yīng)用之一：病原體檢測與定量絕對定量（檢測起始模板數(shù)的精確拷貝69應(yīng)用之一：病原體檢測與定量1432應(yīng)用之一：病原體檢測與定量143270應(yīng)用之一：病原體檢測與定量應(yīng)用之一：病原體檢測與定量71應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析相對定量：基因表達(dá)量上升或者表達(dá)被抑止的倍數(shù)兩種樣品：Calibrator（對照，如正常組織）與Sample（待測樣品）兩個基因：目的基因與看家基因應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析相對定量：基因表達(dá)量上升或者表達(dá)被72Normalizer看家基因應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析CalibratorSampleGeneofInterest目的基因CtCtCtCtCt1Ct2Normalizer應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析Calibra73應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析基因表達(dá)差異＝2

/2Ct1Ct2＝2Ct1-Ct2應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析基因表達(dá)差異＝2/274應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析RNA抽提RT定量PCRcDNA產(chǎn)物系列稀釋兩個基因的擴(kuò)增效率應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析RNA抽提RT定量PCRcDNA產(chǎn)75應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析1234應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析123476

應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析應(yīng)用之二：基因表達(dá)差異分析77兩條探針分別針對不同等位基因ACGTACGT應(yīng)用之三：SNP分析兩條探針分別針對不同等位基因ACGTACGT應(yīng)用之三：SNP78應(yīng)用之三：SNP分析FAMTETFAMTET12應(yīng)用之三：SNP分析FAMTETFAMTET1279應(yīng)用之三：SNP分析21應(yīng)用之三：SNP分析2180Thankyou！選擇吉泰，選擇成功！Thankyou！選擇吉泰，選擇成功！81試驗設(shè)計與優(yōu)化PCR是精確性很高的實驗，實驗前我們需要完整的實驗設(shè)計方案，而且實驗條件對結(jié)果影響也很大。PCR擴(kuò)增效率：保證實驗的精確性和重復(fù)性。影響擴(kuò)增效率的因素：擴(kuò)增子長度；擴(kuò)增子GC含量；擴(kuò)增子、引物、探針二級結(jié)構(gòu)；PCR各組分反應(yīng)濃度；模板濃度。試驗設(shè)計與優(yōu)化PCR是精確性很高的實驗，實驗前我們需要完整的82引物設(shè)計原則擴(kuò)增片段100-200bp引物長度18-30bp，Tm在58-62℃之間，上下游引物Tm值不超過2℃GC含量在30-80%，避免出現(xiàn)多個重復(fù)堿基，3’端不為G或C。避免引物內(nèi)二級結(jié)構(gòu)，引物間二聚體出現(xiàn)?？缤怙@子設(shè)計引物，消除基因組DNA擴(kuò)增引物設(shè)計原則擴(kuò)增片段100-200bp83探針設(shè)計原則Taqman探針長度25-32bp，Tm在68-72℃之間，確保比引物的Tm值大5-10℃GC含量在30-80%，避免出現(xiàn)多個重復(fù)堿基5’端不能為G，G能淬滅熒光信號Taqman探針要靠近上游引物，最好只有一個堿基距離。避免探針與引物間形成二級結(jié)構(gòu)SNP位點應(yīng)設(shè)計在探針中間位置探針設(shè)計原則Taqman探針長度25-32bp，Tm在68-84實時PCR體系優(yōu)化基本參數(shù)的優(yōu)化MgCl2的濃度，DNA：2-5mM;mRNA：4-8mM。模板濃度，系列稀釋梯度模板，CP在15-30之間。而CP值的確定經(jīng)驗上是SYBRGreen熒光信號是本底的2倍，雜交探針熒光強度是本底的0.3倍。實時PCR體系優(yōu)化基本參數(shù)的優(yōu)化85使用SYBRGreen測定DNA的優(yōu)化MgCl2的濃度，2-4mM模板濃度，DNA：50ng-5pg；質(zhì)粒：106拷貝引物濃度，0.3uM退火濃度，比計算出的Tm小5℃使用SYBRGreen測定DNA的優(yōu)化86使用SYBRGreen進(jìn)行一步法RT-PCR的條件優(yōu)化MgCl2的濃度，4-8mM模板濃度，