菊花轉(zhuǎn)錄因子基因DgNAC1的過表達(dá)提高了菊花的耐鹽性

菊花轉(zhuǎn)錄因子基因DgNACl的過表達(dá)提高了菊花的耐鹽性摘要：NAC轉(zhuǎn)錄因子在抵抗不同的非生物脅迫中發(fā)揮有效作用，并且已經(jīng)證明擬南芥中NACTF的過量表達(dá)有助于改善耐鹽性。然而，菊花中NAC基因的功能仍然不甚了解。在這里，我們進(jìn)行生理學(xué)和分子實驗來評估DgNACl在菊花鹽脅迫反應(yīng)中的作用。在本研究中，DgNACl-過表達(dá)的菊花比WT（野生型）上顯然更耐鹽。具體來說，轉(zhuǎn)基因菊花在鹽脅迫下顯示出比WT更高的存活率和更低的EC（電解質(zhì)電導(dǎo)率）。轉(zhuǎn)基因菊花的MDA（丙二醛）和活性氧（H2O2和O2-）的積累量較少，SOD（超氧化物歧化酶），POD（過氧化物酶）和CAT（過氧化氫酶）活性更高，脯氨酸含量高于WT在鹽脅迫下。此外，轉(zhuǎn)基因菊花中的脅迫響應(yīng)基因在鹽脅迫下比WT更顯著上調(diào)。因此，所有結(jié)果表明，DgNACl作為鹽脅迫響應(yīng)的正調(diào)節(jié)因子，可能是耐鹽植物分子育種的必需基因。介紹：鹽度，干旱，寒冷和高溫是植物在其本土環(huán)境中生長時常常易受傷害的主要非生物脅迫。高鹽度是植物生長，發(fā)展，生產(chǎn)力和質(zhì)量的重要環(huán)境壓力。因此，為了對抗鹽度脅迫，植物已經(jīng)發(fā)展了許多策略，包括分子反應(yīng)和復(fù)雜的生理和生化反應(yīng)。一般來說，植物通過改變與生物化學(xué)，生理學(xué)和轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)的許多應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)來響應(yīng)和適應(yīng)非生物脅迫。到目前為止，已經(jīng)確定了許多鹽反應(yīng)基因。其中，AP2/EREBP，WRKY，NAC，bHLH和bZIP等轉(zhuǎn)錄因子（TFs）已被證明在保護(hù)植物免受各種非生物脅迫和通過調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)基因建立脅迫耐受力方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。NAC（矮牽牛NAM和擬南芥ATF1/2和CUC）轉(zhuǎn)錄因子（TFs）包含轉(zhuǎn)錄因子中最大的轉(zhuǎn)錄因子之一，其在N末端區(qū)共享高度保守的結(jié)構(gòu)域，被定義為NAC結(jié)構(gòu)域。在擬南芥和水稻中分別鑒定了約105和75個NAC基因。據(jù)報道，NACTF參與了大量的過程，如器官形成，植物生長，激素平衡，衰老和抗非生物或生物脅迫。例如，在小麥中，TaNAC2參與了對鹽，干旱和脫落酸處理的反應(yīng)，TaNAC2的過表達(dá)提高了擬南芥中鹽，干旱，凍害脅迫的耐受性。然而，NAC基因在菊花對環(huán)境脅迫反應(yīng)中的作用尚不清楚。菊花是世界上主要的觀賞植物之一，為其切割種植而成，其生產(chǎn)受到非生物脅迫的一系列威脅的極大影響。為了提高菊花耐鹽性，我們從菊花中分離出了一種名為DgNACl的NAC轉(zhuǎn)錄因子基因，其功能已經(jīng)在煙草中得到驗證。結(jié)果表明，DgNACl是由鹽，干旱，冷和ABA（脫落酸）處理誘導(dǎo)的，DgNACl過表達(dá)的煙草比WT具有更高的耐鹽性。本研究中屬于ATAF亞組蛋白質(zhì)的DgNACl在菊花品種“金巴”中過表達(dá)，以進(jìn)一步探討DgNACl對鹽脅迫的作用。從應(yīng)激測定，DgNACl的過表達(dá)提高了菊花的鹽度耐受性，通過正調(diào)節(jié)脅迫相關(guān)基因，賦予植物更好的滲透調(diào)節(jié)和膜保護(hù)機(jī)制。方法生成DgNACl轉(zhuǎn)基因株系先前分離了鹽脅迫響應(yīng)性NAC基因DgNACl。為了在菊花（品種“金巴”）中過表達(dá)DgNACl，通過置換gus基因，將DgNACl的全長cDNA插入到CaMV35S啟動子控制下的pBIl2l（Clotech）中。將獲得的載體通過根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化到菊花葉片中，通過qRT-PCR測定得到的ll條線中DgNACl的表達(dá)水平，然后選擇三條線（OE-3，OE-9和OE-ll），其后續(xù)實驗表現(xiàn)出相對較高的表達(dá)。植物材料和耐鹽性評估對于本實驗，三株轉(zhuǎn)基因株系和野生菊金巴種植在泥炭和珍珠巖l：l混合物的盆中，并在23±2°C，l2小時光周期，70%相對濕度的條件下在光培養(yǎng)箱中生長。在6-7葉階段對類似的一組幼苗進(jìn)行鹽脅迫耐受性，其中在4天保留水后，隨著NaCl濃度的增加，植物每隔一天灌溉至土壤容積：第1-5天100mM，第5-10天為200mM，在第10-15天為400mM。在特定的時間點，即在鹽處理后0,1,5,10,15天收獲的中等葉（來自植物的頂部的葉4-5）用于實驗測試。每次測定進(jìn)行三次重復(fù)，然后測量平均值。15天后，從土壤中除去轉(zhuǎn)基因株系和WT;將根用去離子水漂洗，然后重新放入新鮮土壤中回收2周。精確計算菊花的存活率。測量EC和MDA含量將菊花幼苗暴露于鹽脅迫條件下，收集中間葉（植物頂部4-5葉），以便在不同時間點進(jìn)行測量。按照Xing等人描述的方法測量菊花葉中的EC。將菊花葉用蒸餾去離子水沖洗，并置于10ml蒸餾水中，在室溫下?lián)u動（300rpm）4小時。初始電導(dǎo)率（C1）需要用電導(dǎo)率計來確定。將樣品煮沸20分鐘以誘發(fā)最大泄漏，然后在室溫下冷卻后測量電解質(zhì)電導(dǎo)率（C2）。最后，基于100%XC1/C2計算EC的百分比。張氏等方法測定菊花葉中的MDA含量。（2009年）。將0.5g葉子在5ml10%TCA（三氯乙酸）溶液中勻漿并離心。在10%TCA中將2ml葉提取物上清液加入到0.6%TBA（硫代巴比妥酸）中。將混合物在沸水中孵育15分鐘，然后在冰浴中冷卻。將樣品離心，并通過監(jiān)測450,532和600nm處的吸光度來測量MDA含量。測量GSH（谷胱甘肽），脯氨酸和抗氧化酶的活性在鹽脅迫下，在第0,1,5,10和15天，對對照和轉(zhuǎn)基因菊花的第四和第四葉進(jìn)行取樣，并用于生化分析。按照Zhang和Kirkham的方法測量GSH，并按照Irigoyen等人的方法測量脯氨酸含量。按照Beauchamp和Fridovich的方法測量SOD活性；按照Ranieri等人的方法測量POD活性。并按照Zhang等人的方法測定CAT活性。H2O2（過氧化氫）和02-（超氧陰離子）的原位組織化學(xué)定位使用相應(yīng)的檢測試劑盒對菊花葉片的H2O2和O2-含量進(jìn)行定量分析。0.5g葉片用0.1%TCA研磨，并在4°C以10,000g離心20分鐘。上清液用于測量H2O2。反應(yīng)混合物由0.5ml提取的上清液，0.5mlK2PO4Bu和2ml1MKI試劑組成。將反應(yīng)在黑暗中顯影1小時，并在390nm測量吸光度。對于O2測量，在4C下將0.5g葉子用2ml50mM磷酸鹽沉淀（pH7.8）研磨。勻漿通過四層干酪包布，并以5000g離心10分鐘?；旌?ml上清液，0.9ml磷酸鹽（pH7.8）和1ml10mM羥胺，并在25C溫育20分鐘。然后加入0.5ml17mM對氨基苯磺酸和0.5ml7mMa-將萘胺加入到上述培養(yǎng)溶液中，并將混合物在25C下孵育20分鐘。孵育后，液體變色，加入等體積的乙醚。將混合物攪拌并以1500g離心5分鐘，然后在530nm測量粉紅色層的吸光度。另外，根據(jù)Shi等人，分別根據(jù)DAB（二氨基聯(lián)苯胺）和NBT（硝基藍(lán)四唑）的組織化學(xué)染色檢測了H2O2和O2-的積累。（2010年）。對于H2O2檢測，將來自轉(zhuǎn)基因菊花和WT的葉子浸入在10mM磷酸鹽（pH7.8）中制備的1mgml-1新鮮DAB溶液（pH3.8）中，直到觀察到棕色斑點。對于O2-檢測，將樣品置于10mM磷酸鹽（pH7.8）中制備的1mgml-1新鮮NBT溶液中，并在淺色下直至出現(xiàn)藍(lán)點。然后將染色的葉子在濃縮的乙醇中漂白并保存在70%乙醇中，然后再拍照。用于分析基因表達(dá)的qRT-PCR并使用EF1a（伸長因子1a）基因作為參照結(jié)果DgNACl的表達(dá)在11個轉(zhuǎn)化體系中，使用三個獨立的轉(zhuǎn)基因株系（OE-3,OE-9和OE-11）和WT來通過qRT-PCR來確定DgNAC1的轉(zhuǎn)錄水平。qRT-PCR實驗顯示，在OE-3,OE-9和OE-11系中DgNAC1的表達(dá)顯著高于WT（P<0.05）。DgNACl的過表達(dá)增強(qiáng)了對鹽脅迫的耐受性在轉(zhuǎn)基因菊花和WT之間比較鹽脅迫耐受性，并且在溫室中培養(yǎng)兩種轉(zhuǎn)基因品系和WT。在正常條件下，在轉(zhuǎn)基因菊花和WT之間的所有生命周期中，表型沒有任何差異（圖2c）。對于耐鹽性測定，WT菊花的枯萎過程比轉(zhuǎn)基因菊花的萎縮過程快，NaCl溶液濃度逐漸增加（圖2a，c）。鹽脅迫恢復(fù)2周后，三株轉(zhuǎn)基因品系的存活率（OE-3，OE-9和OE-11）分別為95.07,92.60和88.90%，而WT僅為59.23%（圖2b）。這些結(jié)果表明，DgNAC1在營養(yǎng)生長過程中賦予轉(zhuǎn)基因菊花更高的耐鹽性。轉(zhuǎn)基因株系和WT在鹽脅迫下EC，MDA和脯氨酸的積累轉(zhuǎn)基因株系的EC在非脅迫條件下與WT的EC無明顯不同。隨著脅迫時間的延長，轉(zhuǎn)基因品系和WT均呈現(xiàn)緩慢增長的趨勢。然而，在鹽處理下，在第1天至第15天，OE-3，OE-9和OE-11比在WT中顯著降低（P<0.05）。例如，5天時，三只轉(zhuǎn)基因株系的EC分別比第0天增加了16.19%，9.54%和11.72%，而WT的EC增加了34.48%;15天時，轉(zhuǎn)基因株系的EC分別比第0天增加了22.27,18.32和19.92%，WT增加了55.94%（圖3a）。這些結(jié)果表明，三種轉(zhuǎn)基因株系均由較不嚴(yán)重的膜損傷引起，表現(xiàn)出較高的耐鹽性。在正常生長條件下，MDA含量在所有品系中相似。然而，在壓力發(fā)作的后期，MDA在相對于WT的轉(zhuǎn)基因品系中顯示出與EC相似的趨勢，顯著（P<0.05）更低（圖3b）。鹽處理15天，轉(zhuǎn)基因菊花中的MDA分別比第1天分別提高約1.94-1.93-和2.06倍，而WT中的MDA分別增加了2.4倍。這些結(jié)果表明，DgNAC1的過表達(dá)賦予了鹽脅迫誘發(fā)的氧化應(yīng)激的更大耐受性。在對照條件下，轉(zhuǎn)基因菊花和WT之間的脯氨酸含量沒有明顯的差異。然而，隨著鹽處理時間的延長，在整個處理期間，所有品系中的脯氨酸含量迅速增加，轉(zhuǎn)基因株系的脯氨酸含量高于WT植物（圖3c）。到第15天，三個轉(zhuǎn)基因品系中脯氨酸含量的累積分別比第0天增加了23.85倍，24.45倍和25.33倍，而WT僅增加了15.09倍。這些結(jié)果表明，DgNAC1可能在鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因菊花中的脯氨酸水平正相關(guān)。在鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因菊花和WT中H2O2和O2-的積累過量的ROS（活性氧）的積累是導(dǎo)致膜損傷的關(guān)鍵因素。轉(zhuǎn)基因菊花中MDA含量較低迫使我們檢查在鹽度脅迫下測試的線的H2O2和O2-，兩個主要的活性氧的積累。因此，使用檢測試劑盒在幾個不同的處理時間定量分析了所有品系葉中的H2O2和O2-的含量。鹽度處理后，三株轉(zhuǎn)基因株系的H2O2和O2-水平顯著高于對照（P<0.05）WT（圖4a，b）。更具體地說，鹽脅迫第十五天轉(zhuǎn)基因株系葉片的H2O2分別分別為WT的74.2%，75.6%和72.4%。在鹽脅迫第十五天，轉(zhuǎn)基因株系葉片的O2-水平分別為WT中的70.9%，71.1%，70.7%。為了進(jìn)一步確定定量測量，用鹽酸處理0,1,5,10,15天的轉(zhuǎn)基因和WT菊花葉用DAB和NBT染色，分別顯示H2O2和O2-的原位積累。隨著鹽脅迫處理時間的延長，所有葉子的染色不斷加深（圖4c，d）。組織化學(xué)染色顯示，在鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因和野菊花的ROS水平均明顯增加，而WT特異地比三個轉(zhuǎn)基因品系（OE-3，OE-9和OE-11）累積更多的H2O2和O2-，在后三種情況下觀察到較少的棕色或藍(lán)色產(chǎn)品。這表明轉(zhuǎn)基因菊花的氧化水平顯著低于WT,有助于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，提高轉(zhuǎn)基因菊花對鹽脅迫的抗性。分析抗氧化酶活性，GSH抗氧化水平和轉(zhuǎn)基因株系和WT脅迫響應(yīng)基因在鹽脅迫下的表達(dá)水平由于上述結(jié)果表明三個轉(zhuǎn)基因品系相對于WT含有較少的H2O2和O2-，因此在盆栽植物葉片中測定了三種主要的ROS清除酶（SOD，POD和CAT）的活性。在鹽脅迫之前，三種酶的活性沒有顯著差異（圖5a-c）。暴露在鹽脅迫下，SOD活性呈現(xiàn)出隨著鹽脅迫處理時間的延長而逐漸上升和下降的趨勢。CAT活動與SOD相似，但第15天略有上升。對于POD活性，其總體逐漸增加。然而，在整個治療期間，三種轉(zhuǎn)基因品系中三種酶的活性均顯著高于WT（P<0.05）。到第5天，轉(zhuǎn)基因菊花中的SOD和CAT活性達(dá)到最大值注0第15天，它們比WT高1.75和1.62倍（圖5a，c）。到第15天，轉(zhuǎn)基因菊花中POD的活性分別增加約2.83倍，2.76倍和2.77倍，而WT只比第0天高1.53倍（圖5b），此外，檢測基因DgCu/ZnSOD，DgCAT和DgP5CS顯示，轉(zhuǎn)基因株系中的這三個基因在正常條件下的表達(dá)水平高于WT（而不是顯著）。暴露于鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因菊花和WT的三個基因都被引入，而轉(zhuǎn)錄水平在前者中仍然較高（P<0.05）（圖6a-c）。這些數(shù)據(jù)表明，DgNAC1的過表達(dá)賦予較高的抗氧化酶活性和滲透壓，以抵消由鹽脅迫誘發(fā)的氧化和脫水應(yīng)激。在鹽脅迫前后對三個轉(zhuǎn)基因株系和WT中GSH的濃度進(jìn)行了相似的變化（圖5d）。GSH含量迅速增加至第1天，此后緩慢下降。到第1天，轉(zhuǎn)基因株系的GSH含量分別比第0天增加70.66,69.29和76.4%，而WT降低。值得一提的是，轉(zhuǎn)基因菊花中的GSH含量比WT低，而在第15天，GSH的濃度明顯高于WT（P<0.05）。討論菊花是中國十大著名傳統(tǒng)風(fēng)味之一，世界四大主要花卉是中國原產(chǎn)地，其中菊花占世界總砍伐量的30%左右，占世界流行業(yè)的重要地位。目前，隨著環(huán)境和氣候的嚴(yán)峻變化，植物生長發(fā)育，繁殖和生產(chǎn)受到限制高鹽，干旱等因素的綜合有害作用的嚴(yán)重影響（Chenetal。2012b）。只有更好地了解植物對環(huán)境脅迫的耐受機(jī)制才能幫助我們改善植物對非生物脅迫的耐受性的方法和策略。因此，本研究報道了一個NAC家族基因DgNAC1的過表達(dá)提高了菊花的耐鹽性。已經(jīng)鑒定并證明了許多NAC轉(zhuǎn)基因因子在植物對抗非生物脅迫（如冷，十旱，鹽和高溫）的耐受機(jī)制中起關(guān)鍵作用。以前的報告分離了DgNAC1，并證明DgNAC1被聚集成ATAF亞組并且與ATAF1和OsNAC6更密切相關(guān)。已經(jīng)注意到，ATAF亞家族的擬南芥中應(yīng)激反應(yīng)性NAC基因ATAF1的過表達(dá)改善了擬南芥耐旱性。在Oryzasativa中，OsNAC6的過表達(dá)賦予轉(zhuǎn)基因株系耐鹽性。此外，SNAC1的過表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因水稻品系中鹽度和干旱的耐受性。將ONAC063基因轉(zhuǎn)移到擬南芥中可以提高植物的鹽度和耐旱性。高鹽度環(huán)境將嚴(yán)重影響植物生長發(fā)育。在高鹽度條件下，WT植物的枯萎過程比轉(zhuǎn)基因株系的萌發(fā)過程更快（圖2a，c）。同時，DgNAC1在轉(zhuǎn)基因菊花中的表達(dá)水平顯著高于對照菊花（P<0.05）（圖1）。菊花表型和DgNAC1表達(dá)水平的一致性證實了DgNAC1參與減輕菊花鹽脅迫的機(jī)制。此外，鹽脅迫下植物恢復(fù)生長的分析表明，DgNAC1的表達(dá)與菊花的存活率呈正相關(guān)（圖2b）。因此，DgNAC1可能是提高菊花耐鹽性的優(yōu)良遺傳資源。為了減輕鹽脅迫的損害，植物通常會增加滲透液的濃度，如可溶性蛋白質(zhì)，可溶性糖和脯氨酸。其中脯氨酸是主要調(diào)節(jié)物質(zhì)，起著保護(hù)細(xì)胞大分子，保護(hù)細(xì)胞膜和酶結(jié)構(gòu)，清除羥基自由基的作用，提高植物抗壓力和耐受力。在本研究中，鹽脅迫前后的脯氨酸含量分析（圖3c）推測轉(zhuǎn)基因菊花可能具有比WT更強(qiáng)的滲透調(diào)節(jié)能力，表明DgNACl的過表達(dá)可能增強(qiáng)菊花在鹽脅迫下的滲透調(diào)節(jié)能力。同時，脯氨酸合成酶基因DgP5CS的表達(dá)水平與脯氨酸含量呈現(xiàn)相似的變化趨勢，轉(zhuǎn)基因菊花在鹽脅迫下顯著高于WT（圖6c）（P<0.05）。這表明DgNACl的較高表達(dá)水平導(dǎo)致鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因菊花中脯氨酸的積累較高。ROS的積累與生物學(xué)中的生理擾動有關(guān)，因此其增加可能會由高鹽度頻繁引起。我們專注于ROS積累的測量（圖4a，b），因為ROS水平可以直接反映細(xì)胞組分的損傷程度?；贒AB（H2O2）和NBT（O2-）染色的ROS的組織化學(xué)定位顯示轉(zhuǎn)基因菊花在鹽脅迫下，ROS比WT低（圖4c，d），這些結(jié)果表明，DgNAC1-過度表達(dá)的菊花中的氧化應(yīng)激不如WT，表明DgNAC1有利于ROS清除系統(tǒng)的更好的工作提高菊花耐鹽性。高水平的ROS