分子生物學(xué)技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中應(yīng)用

分子生物學(xué)技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用核酸的發(fā)現(xiàn)1869年，F(xiàn).Miescher從膿細(xì)胞中提取到一種富含磷元素的酸性化合物，因存在于細(xì)胞核中而將它命名為“核質(zhì)”(nuclein）。但核酸(nucleicacids）這一名詞在Miescher發(fā)現(xiàn)“核質(zhì)”20年后才被正式啟用，當(dāng)時(shí)已能提取不含蛋白質(zhì)的核酸制品。早期的研究?jī)H將核酸看成是細(xì)胞中的一般化學(xué)成分，沒(méi)有人注意到它在生物體內(nèi)有什么功能這樣的重要問(wèn)題。DNA遺傳物質(zhì)1944年，Avery等為了尋找導(dǎo)致細(xì)菌轉(zhuǎn)化的原因，他們發(fā)現(xiàn)從S型肺炎球菌中提取的DNA與R型肺炎球菌混合后，能使某些R型菌轉(zhuǎn)化為S型菌，且轉(zhuǎn)化率與DNA純度呈正相關(guān)，若將DNA預(yù)先用DNA酶降解，轉(zhuǎn)化就不發(fā)生。結(jié)論是：S型菌的DNA將其遺傳特性傳給了R型菌，DNA就是遺傳物質(zhì)。從此核酸是遺傳物質(zhì)的重要地位才被確立，人們把對(duì)遺傳物質(zhì)的注意力從蛋白質(zhì)移到了核酸上。DNA雙螺旋1952年，奧地利裔美國(guó)生物化學(xué)家查伽夫（E.chargaff，1905—

）測(cè)定了DNA中4種堿基的含量，

發(fā)現(xiàn)其中腺嘌呤與胸腺嘧啶的數(shù)量相等，鳥(niǎo)嘌呤與胞嘧啶的數(shù)量相等。這使沃森、克里克立即想到4種堿基之間存在著兩兩對(duì)應(yīng)的關(guān)系，形成了腺嘌呤與胸腺嘧啶配對(duì)、鳥(niǎo)嘌呤與胞嘧啶配對(duì)的概念。1953年2月，沃森、克里克通過(guò)維爾金斯看到了富蘭克琳在1951年11月拍攝的一張十分漂亮的DNA晶體X射線(xiàn)衍射照片，這一下激發(fā)了他們的靈感。他們不僅確認(rèn)了DNA一定是螺旋結(jié)構(gòu)，而且分析得出了螺旋參數(shù)。他們采用了富蘭克琳和威爾金斯的判斷，并加以補(bǔ)充：磷酸根在螺旋的外側(cè)構(gòu)成兩條多核苷酸鏈的骨架，方向相反；堿基在螺旋內(nèi)側(cè)，兩兩對(duì)應(yīng)。一連幾天，沃森、克里克在他們的辦公室里興高采烈地用鐵皮和鐵絲搭建著模型。1953年2月28日，第一個(gè)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的分子模型終于誕生了。雙螺旋模型的意義探明了DNA分子的結(jié)構(gòu)更重要的是它還提示了DNA的復(fù)制機(jī)制：由于腺膘呤(A)總是與胸腺嘧啶(T)配對(duì)、鳥(niǎo)膘呤(G)總是與胞嘧啶(C)配對(duì)，這說(shuō)明兩條鏈的堿基順序是彼此互補(bǔ)的，只要確定了其中一條鏈的堿基順序，另一條鏈的堿基順序也就確定了。DNA復(fù)制主要包括引發(fā)、延伸、終止三個(gè)階段。DNA的生物合成DNA復(fù)制的過(guò)程DNA雙螺旋的解旋岡崎片段與半不連續(xù)復(fù)制：因DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械模试趶?fù)制叉附近解開(kāi)的DNA鏈，一條是5’—〉3’方向，另一條是3’—〉5’方向，兩個(gè)模板極性不同。所有已知DNA聚合酶合成方向均是5’—〉3’方向，不是3’—〉5’方向，因而無(wú)法解釋DNA的兩條鏈同時(shí)進(jìn)行復(fù)制的問(wèn)題。為解釋DNA兩條鏈各自模板合成子鏈等速?gòu)?fù)制現(xiàn)象，日本學(xué)者岡崎等人提出了DNA的半連續(xù)復(fù)制模型。DNA復(fù)制所需的蛋白質(zhì)和酶：酶和蛋白質(zhì)作用拓?fù)洚悩?gòu)酶幫助解開(kāi)復(fù)制叉前后的超螺旋結(jié)構(gòu)DNA解旋酶揭開(kāi)螺旋Rep蛋白幫助揭開(kāi)雙螺旋結(jié)構(gòu)引物合成酶合成RNA引物單鏈結(jié)合蛋白穩(wěn)定單連區(qū)DNA聚合酶Ⅰ消除引物，填滿(mǎn)裂縫DNA聚合酶Ⅲ合成DNADNA連接酶連接DNA末端DNA復(fù)制是指DNA雙鏈在細(xì)胞分裂以前的分裂間期進(jìn)行的復(fù)制過(guò)程，復(fù)制的結(jié)果是一條雙鏈變成兩條一樣的雙鏈（如果復(fù)制過(guò)程正常的話(huà)），每條雙鏈都與原來(lái)的雙鏈一樣。這個(gè)過(guò)程通過(guò)邊解旋邊復(fù)制和半保留復(fù)制機(jī)制得以順利完成。DNA復(fù)制的特點(diǎn)

1．半保留復(fù)制：DNA在復(fù)制時(shí)，以親代DNA的每一股作模板，合成完全相同的兩個(gè)雙鏈子代DNA，每個(gè)子代DNA中都含有一股親代DNA鏈，這種現(xiàn)象稱(chēng)為DNA的半保留復(fù)制。2．有一定的復(fù)制起始點(diǎn)：DNA在復(fù)制時(shí)，需在特定的位點(diǎn)起始，這是一些具有特定核苷酸排列順序的片段，即復(fù)制起始點(diǎn)（復(fù)制子）。在原核生物中，復(fù)制起始點(diǎn)通常為一個(gè)，而在真核生物中則為多個(gè)。3．需要引物（primer)：DNA聚合酶必須以一段具有3'端自由羥基（3'-OH）的RNA作為引物，才能開(kāi)始聚合子代DNA鏈。RNA引物的大小，在原核生物中通常為50～100個(gè)核苷酸，而在真核生物中約為10個(gè)核苷酸。DNA復(fù)制的特點(diǎn)

4．雙向復(fù)制：DNA復(fù)制時(shí)，以復(fù)制起始點(diǎn)為中心，向兩個(gè)方向進(jìn)行復(fù)制。但在低等生物中，也可進(jìn)行單向復(fù)制。5．半不連續(xù)復(fù)制：由于DNA聚合酶只能以5'→3'方向聚合子代DNA鏈，因此兩條親代DNA鏈作為模板聚合子代DNA鏈時(shí)的方式是不同的。以3'→5'方向的親代DNA鏈作模板的子代鏈在聚合時(shí)基本上是連續(xù)進(jìn)行的，這一條鏈被稱(chēng)為領(lǐng)頭鏈（leadingstrand)。而以5'→3'方向的親代DNA鏈為模板的子代鏈在聚合時(shí)則是不連續(xù)的，這條鏈被稱(chēng)為隨從鏈（laggingstrand)。DNA在復(fù)制時(shí)，由隨從鏈所形成的一些子代DNA短鏈稱(chēng)為岡崎片段（Okazakifragment)。岡崎片段的大小，在原核生物中約為1000～2000個(gè)核苷酸，而在真核生物中約為100個(gè)核苷酸。RNA的生物合成轉(zhuǎn)錄（Transcription）是遺傳信息從DNA到RNA的轉(zhuǎn)移。即以雙鏈DNA中的一條鏈為模板，以腺三

轉(zhuǎn)錄磷（ATP）、胞三磷（CTP）、鳥(niǎo)三磷（GTP）和尿三磷（UTP）4種核苷三磷酸為原料，在RNA聚合酶催化下合成RNA的過(guò)程。在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，DNA模板被轉(zhuǎn)錄方向是從3′端向5′端；RNA鏈的合成方向是從5′端向3′端。RNA的合成一般分兩步，第一步合成原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（過(guò)程包括轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)、延伸和終止）；第二步轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工，使無(wú)生物活性的原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物轉(zhuǎn)變成有生物功能的成熟RNA。雙鏈DNA只有一條鏈?zhǔn)悄０?，稱(chēng)為模板鏈，又稱(chēng)為反意義鏈或負(fù)鏈（-）；另一則稱(chēng)為編碼鏈，又稱(chēng)有意義鏈或正鏈（+）。由于轉(zhuǎn)錄僅以DNA的某一個(gè)區(qū)段為模板，因而稱(chēng)為不對(duì)稱(chēng)轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄作用可分成三個(gè)階段：起始、延伸和終止。蛋白質(zhì)的生物合成蛋白質(zhì)生物合成亦稱(chēng)為翻譯，即把mRNA分子中堿基排列順序轉(zhuǎn)變?yōu)榈鞍踪|(zhì)或多肽鏈中的氨基酸排列順序過(guò)程。不同mRNA序列的分子大小和堿基排列順序各不相同，但都具有5ˊ-端非翻譯區(qū)、開(kāi)放閱讀框架區(qū)、和3ˊ-端非翻譯區(qū)；真核生物的mRNA的5ˊ-端還有帽子結(jié)構(gòu)、3ˊ-端有長(zhǎng)度不一的多聚腺苷酸(ployA)尾。在mRNA的開(kāi)放式閱讀框架區(qū)，以每3個(gè)相鄰的核苷酸為一組，代表一種氨基酸或其他信息，這種三聯(lián)體形勢(shì)稱(chēng)為密碼子（codon）。核糖體就像一個(gè)小的可移動(dòng)的工廠(chǎng)，沿著mRNA這一模板，不斷向前迅速合成肽鏈。

轉(zhuǎn)錄翻譯1、PCR技術(shù)PCR(PolymeraseChainReaction)技術(shù)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),也稱(chēng)無(wú)細(xì)胞克隆系統(tǒng),是1985年誕生的一項(xiàng)DNA體外擴(kuò)增技術(shù),該技術(shù)自問(wèn)世以來(lái),就以驚人的速度廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)的眾多領(lǐng)域。目前在食品工程領(lǐng)域中致病性微生物、轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)等方面的應(yīng)用也越來(lái)越受關(guān)注。1.1PCR技術(shù)的基本原理與方法PCR技術(shù)是一種利用DNA變性與復(fù)性原理,在體外利用DNA聚合酶活性,在引物的引導(dǎo)和脫氧核糖核苷酸(dNTP)等參與下將模板DNA在數(shù)小時(shí)內(nèi)進(jìn)行百萬(wàn)倍擴(kuò)增。該技術(shù)利用兩段寡核苷酸作為反應(yīng)的引物,以及四種脫氧核苷三磷酸dNTP、DNA聚合酶作為反應(yīng)物,將提取到的DNA(稱(chēng)為模板DNA)片段精確擴(kuò)增。該酶促反應(yīng)最基本的3個(gè)環(huán)節(jié)是:①模板DNA的變性,即在94℃下模板雙鏈DNA變?yōu)閱捂淒NA;②引物與模板鏈的特異性復(fù)性;③由TaqDNA聚合酶催化引物引導(dǎo)DNA鏈由5'向3'延伸,從而完成一個(gè)變性-復(fù)性-延伸的PCR循環(huán)。至此完成了PCR的第一輪反應(yīng),而后反復(fù)進(jìn)行變性、復(fù)性和延伸的循環(huán),從而使擴(kuò)增DNA產(chǎn)量呈指數(shù)上升。1.2PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)方面的應(yīng)用1.2.1單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌過(guò)去對(duì)食品中LM進(jìn)行檢測(cè)時(shí),克隆培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)方法需要3～4周的時(shí)間才能得出結(jié)果血清學(xué)檢測(cè)方法(如ELISA等)也存在著特異性、敏感性差等問(wèn)題PCR運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光PCR(Real-timePCR)技術(shù)建立對(duì)食品中單增李氏菌進(jìn)行檢測(cè)的快速方法,設(shè)計(jì)的引物和探針的序列特異性強(qiáng),省去凝膠電泳的繁瑣,降低了污染的可能性。對(duì)26種病原菌進(jìn)行的檢測(cè)結(jié)果表明,用實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)單核細(xì)胞增多李斯特氏菌,更快速、敏感、特異性更高。1.2.2金黃色葡萄球菌1.2.3沙門(mén)氏菌1.2.4腸毒素大腸桿菌1.3常見(jiàn)的基于PCR的食品致病菌檢測(cè)方法1.3.1常規(guī)PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR）1.3.2多重PCR（multiplexPCR）原理與PCR基本相同，

只是在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增多條目的DNA片段，采用這一技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)多種病原微生物。其由于具有高效性、系統(tǒng)性、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便性等特點(diǎn)，而在食品檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。Kawasaki等應(yīng)用多重PCR技術(shù)同時(shí)檢測(cè)肉制品中沙門(mén)氏菌、李斯特菌和大腸桿菌O157：H7，其檢測(cè)敏感度可以達(dá)到40CFU/kg。Hwang等建立了檢測(cè)19種金黃色葡萄球菌毒素基因的多重PCR方法，靈敏度為0.2pg，并用該方法檢測(cè)了143個(gè)從韓國(guó)雞肉和豬肉中分離的金黃色葡萄球菌品種，發(fā)現(xiàn)有72個(gè)品種至少含有一種毒素基因。多重PCR雖然是一種特異靈敏、簡(jiǎn)便快捷、高通量的檢測(cè)技術(shù)，但其在應(yīng)用中也存在一些不足，污染問(wèn)題就是其中之一。一旦有極少量外源性DNA污染，就有可能出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增，各種實(shí)驗(yàn)條件控制不當(dāng)，很容易導(dǎo)致擴(kuò)增失敗或非特異性產(chǎn)物；

引物的設(shè)計(jì)及靶序列的選擇不當(dāng)?shù)榷加锌赡芙档推潇`敏度和特異性。此外，對(duì)食品樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，

增菌培養(yǎng)基選擇不當(dāng)易使有些細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢或被抑制，導(dǎo)致假陰性結(jié)果。1.3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-timePCR）實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù)一般是通過(guò)對(duì)探針或引物進(jìn)行熒光標(biāo)記，并利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移來(lái)獲得熒光。該方法的出現(xiàn)使極微量的mRNA精確定量成為可能，

還可以在同一試管中同時(shí)定量多種靶基因。熒光定量PCR在生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用都非常廣泛，但仍然存在一些問(wèn)題，比如采用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量時(shí)，沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)品，實(shí)驗(yàn)結(jié)果缺乏可比性；其次，進(jìn)行相對(duì)定量時(shí)，內(nèi)源性參比基因有時(shí)會(huì)受到實(shí)驗(yàn)條件的影響，從而影響實(shí)驗(yàn)的可靠性；另外，實(shí)時(shí)定量試劑和染料價(jià)格昂貴，若是加上復(fù)孔和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，實(shí)驗(yàn)成本就更高，這也限制了它的應(yīng)用領(lǐng)域。2、基因探針技術(shù)基因探針技術(shù)又稱(chēng)核酸分子雜交技術(shù)，

該技術(shù)發(fā)明于1968年，由華盛頓卡內(nèi)基學(xué)院的Britten等共同創(chuàng)建。它是分子生物學(xué)中DNA分析方法的基礎(chǔ)，也是當(dāng)今分子生物學(xué)技術(shù)中應(yīng)用最為廣泛的一種。基因探針是帶有標(biāo)記的基因特異片段?；蛱结槞z測(cè)技術(shù)主要利用堿基配對(duì)原理，

使互補(bǔ)的2條核酸單鏈通過(guò)退火形成雙鏈。近年來(lái)基因探針技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于食品微生物的檢測(cè)中，可靈敏、快速、直接地檢測(cè)出致病性微生物，不受非致病性微生物的影響。每一種病原體都有獨(dú)特的核酸片段，

通過(guò)分離和標(biāo)記這些片段就可制備出探針，利用帶有標(biāo)記物的已知序列的核酸探針，與待測(cè)樣品進(jìn)行雜交，如樣品中含有特定病原體，探針將與目的核酸序列特異結(jié)合，最后使用特定的方法測(cè)定標(biāo)記物，便可確定樣品中有無(wú)特定病原體?；蛱结槞z測(cè)技術(shù)不僅具有特異性、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，而且兼?zhèn)浣M織化學(xué)染色的可見(jiàn)性和定位性。核酸探針技術(shù)主要用于食品中致病性病原菌的檢測(cè)。目前，

國(guó)內(nèi)外研究者已開(kāi)發(fā)出多種基因探針用于食品微生物的檢測(cè)。Moseley等以生物素標(biāo)記的沙門(mén)菌基因片段作為探針，對(duì)食品中的沙門(mén)菌進(jìn)行了檢測(cè)，效果良好效果。Kerdahi等使用自動(dòng)化酶連接的非放射性DNA探針，迅速準(zhǔn)確地檢測(cè)出了單核細(xì)胞增生李斯特菌。陳倩等使用針對(duì)ESIEC大腸桿菌HPI毒力島基因設(shè)計(jì)的rp－z探針，成功地鑒定出了ESIEC大腸桿菌。法國(guó)梅里埃公司研制的GENE－PROBE系統(tǒng)采用雜交保護(hù)分析法對(duì)食品中的金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測(cè)。其原理如下：帶有標(biāo)記物的基因探針與金黃色葡萄球菌的rRNA進(jìn)行雜交，形成有標(biāo)記的雜種基因，在選擇性試劑的作用下游離探針的發(fā)光標(biāo)記物溶解，雜種基因的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記受到保護(hù)，此后加入檢測(cè)試劑，化學(xué)發(fā)光分子被氧化或水化發(fā)出強(qiáng)光，用發(fā)光計(jì)量?jī)x可檢測(cè)光的強(qiáng)度，以確定金黃色葡萄球菌的數(shù)量。3、基因芯片基因芯片技術(shù)是鑒別微生物和轉(zhuǎn)基因成分最有效的手段之一,為全面、快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行食品安全檢測(cè)提供了一個(gè)嶄新的平臺(tái)?；蛐酒?DNA芯片、DNA微陣列)技術(shù)是近十幾年來(lái)在生命科學(xué)領(lǐng)域迅速發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)高新技術(shù),是一項(xiàng)基于基因表達(dá)和基因功能研究的革命性技術(shù),他綜合了分子生物學(xué)、半導(dǎo)體微電子、激光、化學(xué)染料等領(lǐng)域的最新科學(xué)技術(shù),在生命科學(xué)和信息科學(xué)之間架起了一道橋梁,是當(dāng)今世界上高度交叉、高度綜合的前沿學(xué)科和研究熱點(diǎn)。目前基因芯片正在成為食品和食品原料檢測(cè)中一種較新的方法,檢測(cè)食品的營(yíng)養(yǎng)成分,監(jiān)督食品的衛(wèi)生、安全和食品質(zhì)量,保證人類(lèi)健康,并且將對(duì)整個(gè)食品領(lǐng)域產(chǎn)生深刻的影響。3.1基因芯片技術(shù)的基本原理與先進(jìn)性將各種基因寡核苷酸點(diǎn)樣于芯片表面,微生物樣品DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后,制備熒光標(biāo)記探針,然后再與芯片上的寡核苷酸點(diǎn)雜交,最后通過(guò)掃描儀定量和分析熒光分布模式來(lái)確定檢測(cè)樣品是否存在某些特定微生物。該技術(shù)可檢測(cè)各種介質(zhì)中的微生物,研究復(fù)雜微生物群體的基因表達(dá)。與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法(細(xì)菌培養(yǎng)、生化鑒定、血清分型等)相比,基因芯片技術(shù)的先進(jìn)性主要體現(xiàn)在:①基因芯片可以實(shí)現(xiàn)微生物的高通量和并行檢測(cè),一次實(shí)驗(yàn)即可得出全部結(jié)果;②操作簡(jiǎn)便快速,整個(gè)檢測(cè)只需4h基本可以出結(jié)果(而傳統(tǒng)方法一般需4d~7d);③特異性強(qiáng),敏感性高。Microarray3.2探針的制備是基因芯片研究中最為關(guān)鍵的因素之一，目前常用的探針有寡核苷酸探針、cDNA探針和基因組DNA探針。寡核苷酸探針是根據(jù)待測(cè)靶基因特點(diǎn)，

設(shè)計(jì)多條特異性寡核苷酸片段，固定在芯片的特定位置上，與PCR擴(kuò)增、標(biāo)記的靶基因相應(yīng)區(qū)段雜交，

根據(jù)特定位置上雜交信號(hào)的有無(wú)來(lái)判定待測(cè)基因是否存在。cDNA探針是通過(guò)PCR擴(kuò)增cDNA文庫(kù)中的基因，點(diǎn)樣、固定于芯片上，與帶有不同熒光的對(duì)照樣品cDNA片段同時(shí)雜交，對(duì)比不同標(biāo)記雜交信號(hào)變化，并據(jù)此檢測(cè)樣品基因表達(dá)水平的變化。探針設(shè)計(jì)好后要在其末端連接上10～15bp的po1ydT作為連接分子臂，經(jīng)5＇端氨基修飾后，分子臂末端被連上氨基，便可與活化玻片表面上的功能基團(tuán)發(fā)生連接反應(yīng)而固定在玻片表面上。3.3基因芯片試驗(yàn)流程RNA

提取全RNA檢測(cè)RNA數(shù)量檢測(cè)RNA質(zhì)量純化RNA檢測(cè)RNA數(shù)量RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNAcDNA純化DNA全基因提取gDNA檢測(cè)gDNA數(shù)量檢測(cè)gDNA質(zhì)量消化gDNA純化gDNA檢測(cè)gDNA數(shù)量cDNA、gDNA熒光染色檢測(cè)cDNA、gDNA數(shù)量cDNA與gDNA雜交檢測(cè)雜交后數(shù)量芯片清洗、穩(wěn)定芯片掃描數(shù)據(jù)分析cDNAgDNA107接種量，750mlBMM，187.5乙醇苯酚80:20混合液（-80oC預(yù)冷過(guò)夜）30分鐘-1小時(shí)冰水中靜置，9krpm低溫離心，沉淀存放于-80oC保存。RNA電泳AgilentBioanalyserRNA6000Nanokit01234567891011RNA電泳TapeStationLab90112131415161718192021222324252627芯片掃描-GenePix讀圖Microarrayresults沙門(mén)氏菌SL1344全基因組圖譜（基因組4527，質(zhì)粒1-104，質(zhì)粒2-103，

質(zhì)粒3-14）紅色為正向調(diào)節(jié)，藍(lán)色為逆向調(diào)節(jié)，黃色為未變化。*GeneSpring讀圖3.4基因芯片技術(shù)在食品微生物檢測(cè)方面的應(yīng)用近年來(lái)，

許多學(xué)者利用基因芯片對(duì)常見(jiàn)致病菌進(jìn)行了分析檢測(cè)。Jin通過(guò)設(shè)計(jì)通用引物擴(kuò)增細(xì)菌核糖體16S及23SrRNA，并將擴(kuò)增產(chǎn)物與含有探針的芯片進(jìn)行雜交，從而在3h內(nèi)快速鑒定出了致病性腸道微生物。Chiang等使用通用引物擴(kuò)增出了細(xì)菌核糖體16SrRNA，并將擴(kuò)增產(chǎn)物與生物素標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，結(jié)果可在4h內(nèi)快速檢測(cè)出大腸桿菌、沙門(mén)菌及葡萄球菌，檢測(cè)準(zhǔn)確率高達(dá)98％。Wang等也采用該技術(shù)在4h內(nèi)快速檢測(cè)出了食物中的致病菌，準(zhǔn)確率為97.4％。Kim等采用比較基因組學(xué)技術(shù)，針對(duì)11種常見(jiàn)的食物源性致病微生物設(shè)計(jì)出了新型探針芯片，與全基因組芯片相比，可更加快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出食品中的微生物。3.5基因芯片技術(shù)存在的問(wèn)題與展望基因芯片技術(shù)的研究和應(yīng)用前景十分誘人,但作為一項(xiàng)新技術(shù),仍有一些問(wèn)題需要解決:①該技術(shù)需要大量的已測(cè)知的、準(zhǔn)確的DNA、cDNA片段的信息,他們使該技術(shù)成為大規(guī)模、集成化和整體獲取生物信息的有效手段;②由于芯片制作工藝復(fù)雜,信號(hào)檢測(cè)也需專(zhuān)門(mén)的儀器設(shè)備,一般實(shí)驗(yàn)室難以承擔(dān)其高昂的費(fèi)用;③樣品制備和標(biāo)記比較復(fù)雜,沒(méi)有一個(gè)統(tǒng)一的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn);④實(shí)驗(yàn)室不能共享數(shù)據(jù)和資料庫(kù)等。這些都在一定程度上限制了基因芯片技術(shù)在食品檢測(cè)中的應(yīng)用?；蛐酒夹g(shù)盡管存在一定的不足和局限,但該技術(shù)具有檢測(cè)系統(tǒng)微型化、檢測(cè)樣品微量化的特點(diǎn),同時(shí)兼具檢測(cè)效率高、能同時(shí)分析多種基因或診斷DNA序列的優(yōu)勢(shì),很適于食品中病原微生物和轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)及鑒定。隨著研究的不斷深入和技術(shù)的完善,基因芯片技術(shù)一定會(huì)在食品科學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。4、DNA指紋圖譜技術(shù)4.1以電泳為主導(dǎo)技術(shù)的DNA圖譜技術(shù)4.1.1變性梯度凝膠電泳標(biāo)記技術(shù)（denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE）DGGE技術(shù)檢測(cè)核酸序列是通過(guò)不同序列的DNA片段在各自相應(yīng)的變性劑濃度下變性，因解鏈行為不同，使不同序列的DNA片段滯留于凝膠的不同位置，經(jīng)過(guò)染色后可以在凝膠上呈現(xiàn)為分散的條帶。DGGE技術(shù)被廣泛應(yīng)用于分析食品中微生物分離和鑒定及其相關(guān)產(chǎn)品的微生物群落種群數(shù)量動(dòng)態(tài)變化。2004年J.Theunissen和T.J.Britz等人對(duì)南非益生菌食品進(jìn)行了抽樣檢查，他們用DGGE法確認(rèn)了食品中的微生物MilicaNikolic等人通過(guò)PCR-DGGE的方法成功鑒定了當(dāng)?shù)刈灾粕窖蚰谈衫抑械娜樗峋?.1.2溫度梯度凝膠電泳(TemperatureGradientGelElectrophoresis，TGGE)溫度梯度凝膠電泳是繼DGGE之后發(fā)展起來(lái)的DNA指紋圖譜技術(shù)，與DGGE不同的是凝膠中所采用的不是尿素和甲酰胺濃度梯度，而是溫度梯度以及在引物的5′端加入3050bp的GC片段。應(yīng)用此技術(shù)能快速地檢測(cè)單獨(dú)區(qū)系菌群的構(gòu)成，也可以發(fā)現(xiàn)存在的尚未被認(rèn)識(shí)的腸道細(xì)菌，Zoetendal等首次用TGGE技術(shù)研究了人糞樣微生物區(qū)系，但該技術(shù)在食品中應(yīng)用較少。4.2隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA技術(shù)（RandomAmplificationofPolymorphicDNA，RAPD）RAPD分析是一種利用隨機(jī)引物，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增靶細(xì)胞DNA，分析DNA片段大小和數(shù)量多態(tài)性，利用不同基因組DNA差異,進(jìn)行分子標(biāo)記研究。該技術(shù)以整個(gè)細(xì)菌DNA基因組為研究對(duì)象，具有很高的敏感性和特異性,特別適用于分子生物學(xué)研究甚少、分子生物學(xué)特征不明確或不了解基因組DNA序列的真菌和乳酸菌。G.Spano等從紅葡萄酒中分離出一株菌株，經(jīng)過(guò)RAPD-PCR技術(shù)鑒定為植物乳桿菌Walczak等通過(guò)RAPD分析鑒定出非生產(chǎn)用酵母菌株與標(biāo)準(zhǔn)清酒假絲酵母菌株的遺傳相似性除此之外，應(yīng)用該技術(shù)對(duì)食源性致病包括葡萄球菌、大腸埃希氏、沙門(mén)氏菌和志賀氏菌都有一定的研究。4.3擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)（Amplifiedfragmentlengthpolymorphism，AFLP）AFLP是對(duì)基因組DNA酶切片段進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，將獲得的擴(kuò)增片段通過(guò)瓊脂糖凝膠或變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離檢測(cè)，根據(jù)帶型中一些特征條帶的出現(xiàn)或消失，檢測(cè)出不同擴(kuò)增片段長(zhǎng)度的多態(tài)性。AFLP技術(shù)可以分析任何來(lái)源DNA指紋圖譜的一項(xiàng)通用技術(shù)，最早應(yīng)用于植物學(xué)，目前在食品微生物中主要應(yīng)用在遺傳多樣性及分類(lèi)研究、未知菌株鑒定、分析多種來(lái)源DNA指紋圖譜。李海星等人運(yùn)用AFLP技術(shù)對(duì)發(fā)酵酸面團(tuán)中乳酸菌多態(tài)性進(jìn)行了研究NairS等人研究了AFLP在對(duì)傷寒沙門(mén)菌的分型能力上比基因探針技術(shù)和脈沖場(chǎng)凝膠電泳更高4.4對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析和另處理的DNA圖譜技術(shù)4.4.1限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP）RFLP基本原理是利用特定的限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別并切割基因組特定片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，得到大小不等的DNA片段，通過(guò)凝膠電泳分析這些片段。對(duì)于RFLP技術(shù)，通常和PCR技術(shù)結(jié)合在真菌和乳酸菌的分型鑒定上有較廣泛的應(yīng)用，也叫PCR-RFLP技術(shù)。JohnW等應(yīng)用PCR-RFLP對(duì)擬南芥中的細(xì)菌群落進(jìn)行了菌群分析，并確定植物乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌群GiraffaG等人對(duì)分離自當(dāng)?shù)夭煌橹破分械?5株德式乳桿菌和保加利亞乳桿菌在亞種水平上進(jìn)行了鑒定。4.4對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析和另處理的DNA圖譜技術(shù)4.4.2單鏈構(gòu)象多態(tài)性（singlestrandconformationpolymorphism,SSCP）分析SSCP是一種以PCR為基礎(chǔ)，基于DNA構(gòu)象差別而進(jìn)行快速、靈敏、有效檢測(cè)基因點(diǎn)突變的方法。目前SSCP已被廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)研究，包括細(xì)菌的耐藥機(jī)制，流行病學(xué)的研究等，其中在微生物學(xué)的分類(lèi)鑒定及群落多態(tài)性分析中也有廣泛的應(yīng)用。Satheesh等用PCR-RFLP及PCR-SSCP分析了來(lái)自41株10種不同血清型沙門(mén)菌的基因，分別得到3種RFLP帶型和14種SSCP帶型王永等對(duì)食源性大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌進(jìn)行單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析，PCR-SSCP技術(shù)可以用來(lái)對(duì)以上致病菌進(jìn)行檢測(cè)。4.5核糖體RNA基因分型技術(shù)核糖體廣泛分布于現(xiàn)存的所有生物，且同種生物細(xì)胞中的rRNA序列完全一致或極少差異，使得不同微生物種間產(chǎn)生相應(yīng)的堿基差異，這些堿基差異可以通過(guò)相應(yīng)的技術(shù)方法來(lái)分析，從而進(jìn)行菌株的分類(lèi)鑒定。目前應(yīng)用較為廣泛的是自動(dòng)核糖體分型技術(shù)（