抗體工程技術(shù)

關(guān)于抗體工程技術(shù)第一頁，共五十七頁，2022年，8月28日2、抗體類型1、多克隆抗體(polyclonalantibody)

早期人工制備抗體的主要方法，以相應(yīng)抗原免疫動物，由此產(chǎn)生的抗體是針對多種抗原決定簇（表位）的混合抗體，故稱之為多克隆抗體。

★

第一節(jié)抗體制備第二頁，共五十七頁，2022年，8月28日3優(yōu)點：來源廣泛、制備容易缺點：特異性不高、易發(fā)生交叉反應(yīng)第三頁，共五十七頁，2022年，8月28日4多克隆抗體1890年Behring和Kitasato發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素，建立免疫療法，開創(chuàng)了抗體制藥之先河。白喉外毒素→免疫動物→抗毒素→治白喉Behring(德,1854～1917）第四頁，共五十七頁，2022年，8月28日5目前治療性抗體產(chǎn)品：精制破傷風(fēng)毒素、精制白喉毒素、精制肉毒毒素。

綠膿免疫血漿抗體制劑第五頁，共五十七頁，2022年，8月28日6多克隆抗體的制備根據(jù)不同的免疫原，選擇不同的免疫方案。免疫方案免疫途徑免疫程序動物選擇第六頁，共五十七頁，2022年，8月28日7

細(xì)胞融合，又稱體細(xì)胞雜交是指兩個或更多個相同或不同細(xì)胞通過膜融合形成單個細(xì)胞的過程。在適當(dāng)?shù)臈l件下，細(xì)胞融合在一起，產(chǎn)生具有原來兩個細(xì)胞基因信息的單個核細(xì)胞，稱為雜交細(xì)胞（hybridcell）。2、細(xì)胞融合技術(shù)和單克隆抗體第七頁，共五十七頁，2022年，8月28日8顯微鏡下細(xì)胞融合過程第八頁，共五十七頁，2022年，8月28日9Muller于1838年觀察到脊椎動的腫瘤細(xì)胞能在體內(nèi)自發(fā)地融合產(chǎn)生多核的腫瘤細(xì)胞。Virchow于1858年描述了正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細(xì)胞現(xiàn)象。Luginbuhl于1873年觀察到天花病人的血液中也有多核的血細(xì)胞存在。Lange于1875年第一個觀察到脊椎動物（蛙類）的血液細(xì)胞發(fā)生融合的過程。Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在無脊椎動中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞合并現(xiàn)象。1958年日本學(xué)者岡田（Okada）發(fā)現(xiàn)仙臺病毒具有觸發(fā)動物細(xì)胞融合的效應(yīng)。1974年華裔加拿大學(xué)者高國楠創(chuàng)立了聚乙二醇（PEG）化學(xué)融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞而產(chǎn)生能分泌預(yù)定單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。20世紀(jì)80年代出現(xiàn)了電融合技術(shù)。細(xì)胞融合研究進展第九頁，共五十七頁，2022年，8月28日101975年，Kohler和Milstein應(yīng)用小鼠骨髓瘤細(xì)胞和綿羊細(xì)胞致敏的小鼠脾細(xì)胞融合，得到的一部分融合雜交細(xì)胞既能繼續(xù)生長，又能分泌抗羊紅細(xì)胞抗體，將這種雜交細(xì)胞系統(tǒng)稱為雜交瘤細(xì)胞，應(yīng)用這種方法可制備單一抗原決定簇的單克隆抗體。第十頁，共五十七頁，2022年，8月28日11一、何謂單克隆抗體？第十一頁，共五十七頁，2022年，8月28日12

★

由一個識別一種抗原表位的B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的同源抗體，稱單克隆抗體第十二頁，共五十七頁，2022年，8月28日13第十三頁，共五十七頁，2022年，8月28日14第十四頁，共五十七頁，2022年，8月28日15第十五頁，共五十七頁，2022年，8月28日16單克隆抗體技術(shù)的核心是用骨髓瘤細(xì)胞(myelomacell)與經(jīng)特定抗源免疫刺激的B淋巴細(xì)胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合得到雜交瘤細(xì)胞(hybridomacell)，雜交瘤細(xì)胞既能象骨髓瘤細(xì)胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的能力。因此，單克隆抗體技術(shù)又稱為雜交瘤技術(shù)(hybridomatechnology

）。第十六頁，共五十七頁，2022年，8月28日17NielsK.Jerne

G.Kohler

C.Milstein

第十七頁，共五十七頁，2022年，8月28日18雜交瘤技術(shù)的基本原理第十八頁，共五十七頁，2022年，8月28日19

3、基因工程抗體基因工程抗體即將抗體的基因按不同需要進行加工、改造和重新裝配，然后導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中進行表達的抗體分子。

第十九頁，共五十七頁，2022年，8月28日20基因工程抗體與單克隆抗體相比的優(yōu)點：

通過基因工程技術(shù)的改造，可以降低甚至消除人體對抗體的排斥反應(yīng)?；蚬こ炭贵w的分子量較小，可以部分降低抗體的鼠源性，更有利于穿透血管壁，進入病灶的核心部位；根據(jù)治療的需要，制備新型抗體?？梢圆捎迷思?xì)胞、真核細(xì)胞和植物等多種表達方式，大量表達抗體分子，大大降低生產(chǎn)成本。第二十頁，共五十七頁，2022年，8月28日21整體水平抗體生成技術(shù)細(xì)胞工程抗體生成技術(shù)

基因工程抗體生成技術(shù)多克隆抗體（抗血清）單克隆抗體嵌合抗體、改形抗體“小型化抗體”（單鏈抗體）組合抗體庫技術(shù)

噬菌體抗體庫技術(shù)Ig基因轉(zhuǎn)基因小鼠抗體真核表達技術(shù)第二十一頁，共五十七頁，2022年，8月28日22

經(jīng)過免疫的哺乳類動物單一的B淋巴細(xì)胞，可以合成分泌單一性的抗體，我們稱這種具有特異性的、同質(zhì)性的抗體為單克隆抗體。二、McAb技術(shù)基本原理第二十二頁，共五十七頁，2022年，8月28日23改變B淋巴細(xì)胞遺傳特性建立永久生長和能分泌McAb細(xì)胞系的途徑

病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞雜交第二十三頁，共五十七頁，2022年，8月28日24骨髓瘤細(xì)胞選擇骨髓瘤細(xì)胞本身不能分泌抗體選擇次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）第二十四頁，共五十七頁，2022年，8月28日25*融合細(xì)胞的選擇原理

1964年Litterlefield首先發(fā)明HAT選擇性培養(yǎng)基。

H：Hypoanthine次黃嘌呤

A：Aminopterin氨基喋呤

T：Thymidine胸腺嘧啶脫氧核苷原理：正常細(xì)胞不但具有利用培養(yǎng)液中的谷酰胺和尿核苷單磷酸合成DNA的能力,且當(dāng)這條主要途徑被氨基喋呤（A）阻斷時，還具有利用培養(yǎng)液中現(xiàn)成的次黃嘌呤（H）和胸腺嘧啶脫氧核苷（T）在次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）的作用下，借此替代通路來合成DNA的能力。第二十五頁，共五十七頁，2022年，8月28日26三、McAb技術(shù)的特點1、高度特異性2、高度穩(wěn)定性

3、高抗體活性

4、不可知性5、過于單一性第二十六頁，共五十七頁，2022年，8月28日27★四、McA制備的基本方法

（一）抗原提純與動物免疫第二十七頁，共五十七頁，2022年，8月28日28（二）骨髓瘤細(xì)胞及飼養(yǎng)細(xì)胞的制備對數(shù)生長期的骨髓瘤細(xì)胞SP2／0(HGPRT缺陷株)的準(zhǔn)備脾細(xì)胞的準(zhǔn)備第二十八頁，共五十七頁，2022年，8月28日29融合前骨髓瘤細(xì)胞:細(xì)胞狀態(tài)渾圓透亮、大小均一、邊緣清晰、排列整齊、呈半致密分布第二十九頁，共五十七頁，2022年，8月28日30（三）細(xì)胞融合融合過程須注意問題1、細(xì)胞比例：骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞比例為1：42、反應(yīng)時間：混合細(xì)胞的離心管中30s內(nèi)加入1ml37℃預(yù)溫的50％PEG，邊加邊輕輕搖動離心管，作用90s，然后加入預(yù)溫的37℃的DMEM不完全培養(yǎng)液終止PEG作用，800r/min離心6min，棄上清。3、培養(yǎng)液成分第三十頁，共五十七頁，2022年，8月28日31（四）篩選和克隆有限稀釋法(稀釋至0.8個細(xì)胞/孔)（五）單克隆抗體的制備和凍存（六）單克隆抗體的純化（制備方法：體內(nèi)培養(yǎng)、體外培養(yǎng)）（鹽析、凝膠過濾、離子交換層析、

親和層析、酸沉淀）第三十一頁，共五十七頁，2022年，8月28日32★四、McA制備的基本方法

第三十二頁，共五十七頁，2022年，8月28日33★五、單克隆抗體的應(yīng)用1、作為親合層析的配體2、作為生物治療的導(dǎo)向武器3、作為免疫抑制劑

通過親和層析可從復(fù)雜的混合物中分離、純化某一特定成分McAb所帶藥物只作用于靶組織器官抗人的T淋巴細(xì)胞單抗用于臨床治療自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反應(yīng)第三十三頁，共五十七頁，2022年，8月28日344、作為研究工作中的探針5、增強抗原的免疫原性6、作為醫(yī)學(xué)檢驗試劑（1）診斷各類病原體（2）腫瘤特異性抗原和相關(guān)抗原檢測（3）檢測淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志（4）機體微量成分的測定第三十四頁，共五十七頁，2022年，8月28日35CJPEB1重組蛋白的表達及

單克隆/多克隆抗體的制備鑒定第三十五頁，共五十七頁，2022年，8月28日36課題的思路及目的誘導(dǎo)培養(yǎng)基因工程菌E.coliBL21(DE3)高效表達CJPEB1重組蛋白鎳瓊脂糖層析柱純化表達后的重組蛋白免疫BALB/C小鼠制備單抗免疫新西蘭兔制備多抗為建立血清學(xué)方法檢測CJ創(chuàng)造條件

第三十六頁，共五十七頁，2022年，8月28日37一、SDS鑒定純化后的PEB1蛋白123456M78910圖1.SDS–PAGE鑒定純化后的PEB1蛋白

表達的蛋白通過鎳瓊脂糖凝膠層析柱純化后，經(jīng)SDS鑒定，蛋白質(zhì)分子量大小與預(yù)計的理論值相符，和本室前期的研究結(jié)果一致，PEB1重組蛋白純度高。1～2：咪唑濃度為50mmol/L時洗脫的蛋白3～4：咪唑濃度為100mmol/L時洗脫的蛋白5～6：咪唑濃度為200mmol/L時洗脫的蛋白M：蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量7～8:咪唑濃度為300mmol/L時洗脫的蛋白9～10:咪唑濃度為400mmol/L時洗脫的蛋白97.4kd66.2kd42.7kd31kd14.4kd第三十七頁，共五十七頁，2022年，8月28日38PEB1蛋白單克隆抗體的制備及鑒定常規(guī)免疫BALB/C小鼠制備單克隆抗體第三十八頁，共五十七頁，2022年，8月28日39-a-b-c-d

-a

-b

-c

-d抗原決定簇BALB/Cabbcd

脾臟產(chǎn)生各種

B細(xì)胞與佐劑乳化免疫采血收集血清作為篩選時陽性對照無菌取脾臟收集B細(xì)胞抗原通常有多個抗原決定簇免疫后的脾臟約在兩月內(nèi)注射四次PEB1蛋白第三十九頁，共五十七頁，2022年，8月28日40-d-a-b-c-dPEB1蛋白ELISAHATPEG細(xì)胞融合雜交瘤細(xì)胞（亞克隆）

(確定只有單個細(xì)胞)-d-c-b-a-dSP2/0骨髓瘤細(xì)胞Bcell脾細(xì)胞培養(yǎng)篩選只識別一個抗原決定簇

abbcd合混胞細(xì)選篩抗單第四十頁，共五十七頁，2022年，8月28日41單克隆抗體的獲得及鑒定細(xì)胞克隆的形成和雜交瘤細(xì)胞的篩選

圖2.融合后第二天骨髓瘤細(xì)胞對照孔圖3.融合后第二天細(xì)胞融合孔第四十一頁，共五十七頁，2022年，8月28日42圖4.融合后第三天細(xì)胞融合孔圖5.融合后第八天細(xì)胞融合孔第四十二頁，共五十七頁，2022年，8月28日43

圖6.間接ELISA篩選抗體陽性孔

第四十三頁，共五十七頁，2022年，8月28日44

通過有限稀釋法和ELISA法進行連續(xù)克隆篩選后獲得兩株穩(wěn)定分泌單抗的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1D7A5株和5G2B3株。第四十四頁，共五十七頁，2022年，8月28日45

圖8.1D7A5株分泌抗體的亞型圖9.5G2B3株分泌抗體的亞型第四十五頁，共五十七頁，2022年，8月28日46

1D7A5株和5G2B3株雜交瘤細(xì)胞誘生的腹水經(jīng)間接ELISA法檢測，腹水中的抗體效價分別為1:8×104和1:5×104。

兩株雜交瘤細(xì)胞誘生的腹水經(jīng)雙向瓊脂擴散試驗檢測，腹水中的抗體效價均為1:8。第四十六頁，共五十七頁，2022年，8月28日47運用小鼠單抗分型試劑盒確定雜交瘤細(xì)胞所分泌的單抗的亞型。將建株的雜交瘤細(xì)胞注入小鼠腹腔誘生腹水。應(yīng)用間接ELISA法和雙向瓊脂擴散試驗檢測的腹水中單抗的效價。通過Western-blot和玻片凝集試驗檢測單抗的特異性。第四十七頁，共五十七頁，2022年，8月28日48免疫印跡試驗結(jié)果顯示：2株雜交瘤細(xì)胞分泌的單抗，可以與PEB1蛋白特異性結(jié)合。通過DAB顯色出現(xiàn)特異性條帶并且無雜帶出現(xiàn)。1234M

1～2：未經(jīng)純化的PEB1蛋白與單抗特異性結(jié)合3～

4：純化的PEB1蛋白與單抗特異性結(jié)合M：蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量圖10.western-blot檢測單抗特異性97.4kd66.2kd43kd31kd20kd14.4kd第四十八頁，共五十七頁，2022年，8月28日49細(xì)菌名稱雜交瘤細(xì)胞誘生的腹水SP2/0細(xì)胞誘生的腹水空腸彎曲菌++－大腸桿菌－－痢疾桿菌－－傷寒桿菌－－產(chǎn)氣莢膜桿菌－－變形桿菌－－葡萄球菌－－表1.玻片凝集試驗檢測單抗的特異性結(jié)果第四十九頁，共五十七頁，2022年，8月28日50三、PEB1蛋白多克隆抗體的制備及鑒定免疫新西蘭兔制備多克隆抗體。第五十頁，共五十七頁，2022年，8月28日51123412431234PEB1蛋白與佐劑完全乳化待血凝完全離心收集血清鹽析法粗提兔IgG抗體第五十一頁，共五十七頁，2022年，8月28日52應(yīng)用間接ELISA法和雙向瓊脂擴散試驗檢測多克隆抗體抗體的效價。通過Western-blot和玻片凝集試驗檢測多克隆抗體的特異性。第五十二頁，共五十七頁，2022年，8月28日53

多克隆抗體的效價檢測及鑒定動物編號0W2W4W6W7W8W兔101:101:102

1:6×1031:8×1031:1.5×104兔201:101:5×102

1:8×1031:1×1041:2×104兔301:101:5×1021:8×1031:1.2×1041:2