抗體工程技術(shù)

關(guān)于抗體工程技術(shù)第一頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日2、抗體類型1、多克隆抗體(polyclonalantibody)

早期人工制備抗體的主要方法，以相應(yīng)抗原免疫動(dòng)物，由此產(chǎn)生的抗體是針對(duì)多種抗原決定簇（表位）的混合抗體，故稱之為多克隆抗體。

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第一節(jié)抗體制備第二頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日3優(yōu)點(diǎn)：來(lái)源廣泛、制備容易缺點(diǎn)：特異性不高、易發(fā)生交叉反應(yīng)第三頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日4多克隆抗體1890年Behring和Kitasato發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素，建立免疫療法，開(kāi)創(chuàng)了抗體制藥之先河。白喉外毒素→免疫動(dòng)物→抗毒素→治白喉Behring(德,1854～1917）第四頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日5目前治療性抗體產(chǎn)品：精制破傷風(fēng)毒素、精制白喉毒素、精制肉毒毒素。

綠膿免疫血漿抗體制劑第五頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日6多克隆抗體的制備根據(jù)不同的免疫原，選擇不同的免疫方案。免疫方案免疫途徑免疫程序動(dòng)物選擇第六頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日7

細(xì)胞融合，又稱體細(xì)胞雜交是指兩個(gè)或更多個(gè)相同或不同細(xì)胞通過(guò)膜融合形成單個(gè)細(xì)胞的過(guò)程。在適當(dāng)?shù)臈l件下，細(xì)胞融合在一起，產(chǎn)生具有原來(lái)兩個(gè)細(xì)胞基因信息的單個(gè)核細(xì)胞，稱為雜交細(xì)胞（hybridcell）。2、細(xì)胞融合技術(shù)和單克隆抗體第七頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日8顯微鏡下細(xì)胞融合過(guò)程第八頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日9Muller于1838年觀察到脊椎動(dòng)的腫瘤細(xì)胞能在體內(nèi)自發(fā)地融合產(chǎn)生多核的腫瘤細(xì)胞。Virchow于1858年描述了正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細(xì)胞現(xiàn)象。Luginbuhl于1873年觀察到天花病人的血液中也有多核的血細(xì)胞存在。Lange于1875年第一個(gè)觀察到脊椎動(dòng)物（蛙類）的血液細(xì)胞發(fā)生融合的過(guò)程。Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在無(wú)脊椎動(dòng)中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞合并現(xiàn)象。1958年日本學(xué)者岡田（Okada）發(fā)現(xiàn)仙臺(tái)病毒具有觸發(fā)動(dòng)物細(xì)胞融合的效應(yīng)。1974年華裔加拿大學(xué)者高國(guó)楠?jiǎng)?chuàng)立了聚乙二醇（PEG）化學(xué)融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞而產(chǎn)生能分泌預(yù)定單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。20世紀(jì)80年代出現(xiàn)了電融合技術(shù)。細(xì)胞融合研究進(jìn)展第九頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日101975年，Kohler和Milstein應(yīng)用小鼠骨髓瘤細(xì)胞和綿羊細(xì)胞致敏的小鼠脾細(xì)胞融合，得到的一部分融合雜交細(xì)胞既能繼續(xù)生長(zhǎng)，又能分泌抗羊紅細(xì)胞抗體，將這種雜交細(xì)胞系統(tǒng)稱為雜交瘤細(xì)胞，應(yīng)用這種方法可制備單一抗原決定簇的單克隆抗體。第十頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日11一、何謂單克隆抗體？第十一頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日12

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由一個(gè)識(shí)別一種抗原表位的B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的同源抗體，稱單克隆抗體第十二頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日13第十三頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日14第十四頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日15第十五頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日16單克隆抗體技術(shù)的核心是用骨髓瘤細(xì)胞(myelomacell)與經(jīng)特定抗源免疫刺激的B淋巴細(xì)胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合得到雜交瘤細(xì)胞(hybridomacell)，雜交瘤細(xì)胞既能象骨髓瘤細(xì)胞那樣在體外無(wú)限增殖，又具有B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的能力。因此，單克隆抗體技術(shù)又稱為雜交瘤技術(shù)(hybridomatechnology

）。第十六頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日17NielsK.Jerne

G.Kohler

C.Milstein

第十七頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日18雜交瘤技術(shù)的基本原理第十八頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日19

3、基因工程抗體基因工程抗體即將抗體的基因按不同需要進(jìn)行加工、改造和重新裝配，然后導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的抗體分子。

第十九頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日20基因工程抗體與單克隆抗體相比的優(yōu)點(diǎn)：

通過(guò)基因工程技術(shù)的改造，可以降低甚至消除人體對(duì)抗體的排斥反應(yīng)?；蚬こ炭贵w的分子量較小，可以部分降低抗體的鼠源性，更有利于穿透血管壁，進(jìn)入病灶的核心部位；根據(jù)治療的需要，制備新型抗體?？梢圆捎迷思?xì)胞、真核細(xì)胞和植物等多種表達(dá)方式，大量表達(dá)抗體分子，大大降低生產(chǎn)成本。第二十頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日21整體水平抗體生成技術(shù)細(xì)胞工程抗體生成技術(shù)

基因工程抗體生成技術(shù)多克隆抗體（抗血清）單克隆抗體嵌合抗體、改形抗體“小型化抗體”（單鏈抗體）組合抗體庫(kù)技術(shù)

噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)Ig基因轉(zhuǎn)基因小鼠抗體真核表達(dá)技術(shù)第二十一頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日22

經(jīng)過(guò)免疫的哺乳類動(dòng)物單一的B淋巴細(xì)胞，可以合成分泌單一性的抗體，我們稱這種具有特異性的、同質(zhì)性的抗體為單克隆抗體。二、McAb技術(shù)基本原理第二十二頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日23改變B淋巴細(xì)胞遺傳特性建立永久生長(zhǎng)和能分泌McAb細(xì)胞系的途徑

病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞雜交第二十三頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日24骨髓瘤細(xì)胞選擇骨髓瘤細(xì)胞本身不能分泌抗體選擇次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）第二十四頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日25*融合細(xì)胞的選擇原理

1964年Litterlefield首先發(fā)明HAT選擇性培養(yǎng)基。

H：Hypoanthine次黃嘌呤

A：Aminopterin氨基喋呤

T：Thymidine胸腺嘧啶脫氧核苷原理：正常細(xì)胞不但具有利用培養(yǎng)液中的谷酰胺和尿核苷單磷酸合成DNA的能力,且當(dāng)這條主要途徑被氨基喋呤（A）阻斷時(shí)，還具有利用培養(yǎng)液中現(xiàn)成的次黃嘌呤（H）和胸腺嘧啶脫氧核苷（T）在次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）的作用下，借此替代通路來(lái)合成DNA的能力。第二十五頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日26三、McAb技術(shù)的特點(diǎn)1、高度特異性2、高度穩(wěn)定性

3、高抗體活性

4、不可知性5、過(guò)于單一性第二十六頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日27★四、McA制備的基本方法

（一）抗原提純與動(dòng)物免疫第二十七頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日28（二）骨髓瘤細(xì)胞及飼養(yǎng)細(xì)胞的制備對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓瘤細(xì)胞SP2／0(HGPRT缺陷株)的準(zhǔn)備脾細(xì)胞的準(zhǔn)備第二十八頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日29融合前骨髓瘤細(xì)胞:細(xì)胞狀態(tài)渾圓透亮、大小均一、邊緣清晰、排列整齊、呈半致密分布第二十九頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日30（三）細(xì)胞融合融合過(guò)程須注意問(wèn)題1、細(xì)胞比例：骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞比例為1：42、反應(yīng)時(shí)間：混合細(xì)胞的離心管中30s內(nèi)加入1ml37℃預(yù)溫的50％PEG，邊加邊輕輕搖動(dòng)離心管，作用90s，然后加入預(yù)溫的37℃的DMEM不完全培養(yǎng)液終止PEG作用，800r/min離心6min，棄上清。3、培養(yǎng)液成分第三十頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日31（四）篩選和克隆有限稀釋法(稀釋至0.8個(gè)細(xì)胞/孔)（五）單克隆抗體的制備和凍存（六）單克隆抗體的純化（制備方法：體內(nèi)培養(yǎng)、體外培養(yǎng)）（鹽析、凝膠過(guò)濾、離子交換層析、

親和層析、酸沉淀）第三十一頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日32★四、McA制備的基本方法

第三十二頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日33★五、單克隆抗體的應(yīng)用1、作為親合層析的配體2、作為生物治療的導(dǎo)向武器3、作為免疫抑制劑

通過(guò)親和層析可從復(fù)雜的混合物中分離、純化某一特定成分McAb所帶藥物只作用于靶組織器官抗人的T淋巴細(xì)胞單抗用于臨床治療自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反應(yīng)第三十三頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日344、作為研究工作中的探針5、增強(qiáng)抗原的免疫原性6、作為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)試劑（1）診斷各類病原體（2）腫瘤特異性抗原和相關(guān)抗原檢測(cè)（3）檢測(cè)淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志（4）機(jī)體微量成分的測(cè)定第三十四頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日35CJPEB1重組蛋白的表達(dá)及

單克隆/多克隆抗體的制備鑒定第三十五頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日36課題的思路及目的誘導(dǎo)培養(yǎng)基因工程菌E.coliBL21(DE3)高效表達(dá)CJPEB1重組蛋白鎳瓊脂糖層析柱純化表達(dá)后的重組蛋白免疫BALB/C小鼠制備單抗免疫新西蘭兔制備多抗為建立血清學(xué)方法檢測(cè)CJ創(chuàng)造條件

第三十六頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日37一、SDS鑒定純化后的PEB1蛋白123456M78910圖1.SDS–PAGE鑒定純化后的PEB1蛋白

表達(dá)的蛋白通過(guò)鎳瓊脂糖凝膠層析柱純化后，經(jīng)SDS鑒定，蛋白質(zhì)分子量大小與預(yù)計(jì)的理論值相符，和本室前期的研究結(jié)果一致，PEB1重組蛋白純度高。1～2：咪唑濃度為50mmol/L時(shí)洗脫的蛋白3～4：咪唑濃度為100mmol/L時(shí)洗脫的蛋白5～6：咪唑濃度為200mmol/L時(shí)洗脫的蛋白M：蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量7～8:咪唑濃度為300mmol/L時(shí)洗脫的蛋白9～10:咪唑濃度為400mmol/L時(shí)洗脫的蛋白97.4kd66.2kd42.7kd31kd14.4kd第三十七頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日38PEB1蛋白單克隆抗體的制備及鑒定常規(guī)免疫BALB/C小鼠制備單克隆抗體第三十八頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日39-a-b-c-d

-a

-b

-c

-d抗原決定簇BALB/Cabbcd

脾臟產(chǎn)生各種

B細(xì)胞與佐劑乳化免疫采血收集血清作為篩選時(shí)陽(yáng)性對(duì)照無(wú)菌取脾臟收集B細(xì)胞抗原通常有多個(gè)抗原決定簇免疫后的脾臟約在兩月內(nèi)注射四次PEB1蛋白第三十九頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日40-d-a-b-c-dPEB1蛋白ELISAHATPEG細(xì)胞融合雜交瘤細(xì)胞（亞克?。?/p>

(確定只有單個(gè)細(xì)胞)-d-c-b-a-dSP2/0骨髓瘤細(xì)胞Bcell脾細(xì)胞培養(yǎng)篩選只識(shí)別一個(gè)抗原決定簇

abbcd合混胞細(xì)選篩抗單第四十頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日41單克隆抗體的獲得及鑒定細(xì)胞克隆的形成和雜交瘤細(xì)胞的篩選

圖2.融合后第二天骨髓瘤細(xì)胞對(duì)照孔圖3.融合后第二天細(xì)胞融合孔第四十一頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日42圖4.融合后第三天細(xì)胞融合孔圖5.融合后第八天細(xì)胞融合孔第四十二頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日43

圖6.間接ELISA篩選抗體陽(yáng)性孔

第四十三頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日44

通過(guò)有限稀釋法和ELISA法進(jìn)行連續(xù)克隆篩選后獲得兩株穩(wěn)定分泌單抗的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1D7A5株和5G2B3株。第四十四頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日45

圖8.1D7A5株分泌抗體的亞型圖9.5G2B3株分泌抗體的亞型第四十五頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日46

1D7A5株和5G2B3株雜交瘤細(xì)胞誘生的腹水經(jīng)間接ELISA法檢測(cè)，腹水中的抗體效價(jià)分別為1:8×104和1:5×104。

兩株雜交瘤細(xì)胞誘生的腹水經(jīng)雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)，腹水中的抗體效價(jià)均為1:8。第四十六頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日47運(yùn)用小鼠單抗分型試劑盒確定雜交瘤細(xì)胞所分泌的單抗的亞型。將建株的雜交瘤細(xì)胞注入小鼠腹腔誘生腹水。應(yīng)用間接ELISA法和雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)的腹水中單抗的效價(jià)。通過(guò)Western-blot和玻片凝集試驗(yàn)檢測(cè)單抗的特異性。第四十七頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日48免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果顯示：2株雜交瘤細(xì)胞分泌的單抗，可以與PEB1蛋白特異性結(jié)合。通過(guò)DAB顯色出現(xiàn)特異性條帶并且無(wú)雜帶出現(xiàn)。1234M

1～2：未經(jīng)純化的PEB1蛋白與單抗特異性結(jié)合3～

4：純化的PEB1蛋白與單抗特異性結(jié)合M：蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量圖10.western-blot檢測(cè)單抗特異性97.4kd66.2kd43kd31kd20kd14.4kd第四十八頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日49細(xì)菌名稱雜交瘤細(xì)胞誘生的腹水SP2/0細(xì)胞誘生的腹水空腸彎曲菌++－大腸桿菌－－痢疾桿菌－－傷寒桿菌－－產(chǎn)氣莢膜桿菌－－變形桿菌－－葡萄球菌－－表1.玻片凝集試驗(yàn)檢測(cè)單抗的特異性結(jié)果第四十九頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日50三、PEB1蛋白多克隆抗體的制備及鑒定免疫新西蘭兔制備多克隆抗體。第五十頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日51123412431234PEB1蛋白與佐劑完全乳化待血凝完全離心收集血清鹽析法粗提兔IgG抗體第五十一頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日52應(yīng)用間接ELISA法和雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)多克隆抗體抗體的效價(jià)。通過(guò)Western-blot和玻片凝集試驗(yàn)檢測(cè)多克隆抗體的特異性。第五十二頁(yè)，共五十七頁(yè)，2022年，8月28日53

多克隆抗體的效價(jià)檢測(cè)及鑒定動(dòng)物編號(hào)0W2W4W6W7W8W兔101:101:102

1:6×1031:8×1031:1.5×104兔201:101:5×102

1:8×1031:1×1041:2×104兔301:101:5×1021:8×1031:1.2×1041:2