分子生物學研究方法課件

分子生物學研究方法分子生物學研究方法第一節(jié)基因操作的主要技術(shù)原理

1．核酸的凝膠電泳(Agarose&Polyacrylamide)

將某種分子放到特定的電場中，它就會以一定的速度向適當?shù)碾姌O移動。某物質(zhì)在電場作用下的遷移速度叫作電泳的速率，它與電場強度成正比，與該分子所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，而與分子的磨擦系數(shù)成反比（分子大小、極性、介質(zhì)的粘度系數(shù)等）。在生理條件下，核酸分子中的磷酸基團是離子化的，所以，DNA和RNA實際上呈多聚陰離子狀態(tài)（Polyanions）。將DNA、RNA放到電場中，它就會由負極→正極移動。第一節(jié)基因操作的主要技術(shù)原理1．核酸的凝膠電泳(A分子生物學研究方法課件2．核酸的分子雜交技術(shù)

在大多數(shù)核酸雜交反應(yīng)中，經(jīng)過凝膠電泳分離的DNA或RNA分子，都是在雜交之前，通過毛細管作用或電導(dǎo)作用按其在凝膠中的位置原封不動地“吸印”轉(zhuǎn)移到濾膜上的。常用的濾膜有尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜，疊氮苯氧甲基纖維素濾紙（DBM）和二乙氨基乙基纖維素濾膜（DEAE）2．核酸的分子雜交技術(shù)核酸分子雜交實驗包括如下兩個步驟：

1.將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上，這個過程特稱為核酸印跡(nucleicacidblotting)轉(zhuǎn)移，主要有電泳凝膠核酸印跡法、斑點和狹線印跡法(dotandslotblotting)、菌落和噬菌斑印跡法(colonyandplaqueblotting)；

2.將具有核酸印跡的濾膜同帶有放射性標記或其它標記的DNA或RNA探針進行雜交。所以有時也稱這類核酸雜交為印跡雜交。核酸分子雜交實驗包括如下兩個步驟：

1.將核酸樣品轉(zhuǎn)移分子生物學研究方法課件分子生物學研究方法課件3．細菌的轉(zhuǎn)化

所謂細菌轉(zhuǎn)化，是指一種細菌菌株由于捕獲了來自另一種細菌菌株的DNA，而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程。這種提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫做供體菌株，而接受轉(zhuǎn)化DNA的寄主菌株則稱做受體菌株。大腸桿菌是最廣泛使用的實驗菌株。在加入轉(zhuǎn)化DNA之前，必須預(yù)先用CaCl2處理大腸桿菌細胞，使之呈感受態(tài)（CompetentCells）。Mg2+對維持外源DNA的穩(wěn)定性起重要作用，質(zhì)粒DNA中的抗生素是篩選標記。

3．細菌的轉(zhuǎn)化4．DNA序列分析a.Sanger的雙脫氧鏈終止法

Cambridge的F.Sanger在1977年發(fā)明用雙脫氧鏈終止法測定單鏈DNA的序列，其基本原理如下：①DNA聚合酶能夠用單鏈DNA作為模板，合成準確的DNA互補鏈；DNA聚合酶常用Klenow大片段，無5'→3'外切酶活性。②該酶能夠用2'，3'--雙脫氧核苷三磷酸作底物并將其聚合到新生寡核苷酸鏈的3'-末端，從而終止其延伸反應(yīng)。在DNA測序反應(yīng)中，加入模板DNA，引物（特異性引物，如T7，T3，M13等），DNA聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTP和一種ddNTP。4．DNA序列分析分子生物學研究方法課件雙脫氧鏈末端終止法測序基本原理示意圖雙脫氧鏈末端終止法測序基本原理示意圖分子生物學研究方法課件b．DNA序列分析自動化(分析反應(yīng)\讀片過程

)

用四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)作為熒光劑標記DNA引物，帶有這種引物的DNA片段能在激光誘導(dǎo)下發(fā)出熒光。按照標準的雙脫氧終止法或化學終止法進行測序反應(yīng)，跑DNA凝膠后,用計算機檢測。b．DNA序列分析自動化(分析反應(yīng)\讀片過程)DNA測序的全過程(實際)DNA測序的全過程(實際)5．基因的定點誘變（site-directedmutagenesis）

使已克隆基因或DNA片段中的任何一個特定堿基發(fā)生取代、插入或缺失變化的過程叫作基因的定點誘變，是基因工程和蛋白質(zhì)工程的重要手段。如：盒式誘變(cassettemutagenesis)，包括盒式取代誘變和混合寡核苷酸誘變兩種方式。5．基因的定點誘變（site-directedmutag6．利用DNA與蛋白質(zhì)的相互作用進行核酸研究.a.凝膠滯緩實驗(Gelretardationassay)，又稱DNA遷移率變化試驗(DNAmobilityshiftassay--EMSA)。

6．利用DNA與蛋白質(zhì)的相互作用進行核酸研究.a.凝膠滯b．DNaseI印跡試驗（DNaseIfootprinting）主要步驟：

①用32P標記DNA雙鏈末端，并用RE切去一端；

②加入細胞特定周期蛋白質(zhì)提取物，溫育；

③加入適量DNaseI或硫酸二甲酯-六氫吡啶，使DNA鏈發(fā)生斷裂。

這一反應(yīng)中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常關(guān)鍵，要保證每一條DNA鏈只發(fā)生一次磷酸二酯斷裂！

④沉淀DNA（包括與DNA相結(jié)合的蛋白質(zhì)）；

⑤進行DNA凝膠分析。

如果某個蛋白質(zhì)已經(jīng)與DNA的特定區(qū)段相結(jié)合，那么，它就會保證該區(qū)段DNA免受消化或降解作用。在電泳凝膠的放射自顯影圖片上，相應(yīng)于蛋白質(zhì)結(jié)合的部位不產(chǎn)生放射性標記的條帶,而是出現(xiàn)了一個空白的區(qū)域,形象地稱為足跡。b．DNaseI印跡試驗（DNaseIfootp7聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）技術(shù)PCR（polymerasechainreaction）：聚合酶鏈式反應(yīng)。1983年由美國科學家KaryMullis提出，1993年因此而獲諾貝爾獎。PCR技術(shù)是指通過模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的方式，在體外選擇性地將DNA某個特殊區(qū)域擴增出來的技術(shù)，它包括變性、退火、延伸三個步驟。7聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）技術(shù)PCR（polymeraseKaryB.Mullis(1944-)，在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR。他原本是要合成DNA引物來進行測序工作，卻常為沒有足夠多的模板DNA而煩惱。1983年春夏之交的一個晚上，他開車去鄉(xiāng)下別墅的路上萌發(fā)了用兩個引物（而不是一個引物）去擴增模板DNA的想法…...KaryB.Mullis(1944-)，在CetusMullis開車的時候,瞬間感覺兩排路燈就是DNA的兩條鏈，自己的車和對面開來的車象是DNA聚合酶，面對面地合成.DNA，……Mullis開車的時候,瞬間感覺兩排路燈就是DNA的兩條鏈1983年9月中旬。Mullis在反應(yīng)體系中加入DNA聚合酶后在37℃一直保溫。結(jié)果第二天在瓊脂糖電泳上沒有看到任何條帶。于是他認識到有必要用加熱來解鏈，每次解鏈后再加入DNA聚合酶進行反應(yīng)，依次循環(huán)。1983年12月，他終于看到了被同位素標記的PCR條帶。Mullis的第一個PCR實驗1983年9月中旬。Mullis在反應(yīng)體系中加入DNA聚合酶PCR的基本原理

引物

dNTP

耐熱DNA聚合酶模板DNA

變性（denaturation）：90～98℃；退火（annealing）：37～

72℃；延伸（extension）：72℃?；疽財U增步驟PCR的基本原理引物變性（denaturation）：9分子生物學研究方法課件5’-GGTA……TCAT-3’3’-CCAT……AGTA-5’5’GGTA-OH（引物1）5’ATGA-OH（引物2）90~98℃3’-CCAT…………AGTA-5’5’-GGTA…………TCAT-3’37~72℃3’-CCAT…………AGTA-5’5’-GGTA…………TCAT-3’5’GGTA-OHOH-AGTA5’70~75℃5’-GGTA……TCAT-3’3’-CCAT……AGTA-5’5’-GGTA……TCAT-3’3’-CCAT……AGTA-5’90~98℃37~72℃3’-CCAT……AGTA-5’5’-GGTA……TCAT-3’5’GGTA-OHOH-AGTA5’70~75℃5’-GGTA……TCAT-3’3’-CCAT……AGTA-5’5’-GGTA……TCAT-3’3’-CCAT……AGTA-5’3’-CCAT……AGTA-5’5’-GGTA……TCAT-3’(略)(底物DNA)(略)(略)PCR擴增特異性DNA片段全過程5’-GGTA……TCAT-3’5’GGTA-OH（引物1分子生物學研究方法課件PCR反應(yīng)體系1、脫氧核苷三磷酸（dNTP）dATP、dGTP、dCTP、dTTP是PCR的原材料，通過PCR過程聚合成互補鏈DNA。貯存濃度：2.5mM使用濃度：200μM使用濃度不當會影響擴增的產(chǎn)量、特異性和保真度。PCR反應(yīng)體系1、脫氧核苷三磷酸（dNTP）dATP、dG2、緩沖液（buffer）標準10×：140mMTris-HCl（pH8.8）

4~8mMMgCl240mM(NH4)2SO430μg/mlBSA16mMDTT不同廠家生產(chǎn)的DNA聚合酶所用到的buffer不同。2、緩沖液（buffer）標準10×：140mMTris3、引物（primer）

最佳引物使用濃度為0.1μM~1.0μM之間。引物濃度太低，擴增產(chǎn)物太少；引物濃度太高，易出現(xiàn)非特異性擴增反應(yīng)。一般貯存濃度：10μM

使用濃度：0.4μM引物設(shè)計要求:

設(shè)計的引物的核苷酸序列必須與模板鏈3’端的一段核苷酸序列互補,且3’端必須有游離的-OH基團；引物一般由20~30個核苷酸組成，4種核苷酸盡可能隨機分布，GC含量應(yīng)達40~60%；引物中應(yīng)盡量避免回紋序列出現(xiàn)；引物中最好含有進一步操作中可利用的限制性核酸內(nèi)切酶識別序列。3、引物（primer）最佳引物使用濃度為0.Tm（解鏈溫度）值的計算公式：引物長度＜20nt時：Tm=4×（G+C）+2×（A+T）引物長度＞20nt時：Tm=81.5+0.41×（GC）%－600/LPCR過程中選擇退火溫度時，一般為（Tm－5）℃Tm（解鏈溫度）值的計算公式：引物長度＜20nt時：Tm=44、模板DNA作為PCR的靶DNA一般是一個待擴增的特定雙鏈DNA片段，應(yīng)知道其兩端20~30bp的核苷酸序列，供設(shè)計一對引物之用。PCR的模板是一條單鏈DNA片段，其3’端具有與引物雜交的序列。4、模板DNA作為PCR的靶DNA一般是一個待擴增的特定雙5、耐高溫DNA聚合酶TaqDNA聚合酶

來自嗜熱古細菌Thermusaquaticus。該菌1967年從溫泉中分離，最適生長溫度70℃?，F(xiàn)市場上銷售的是該基因在E.coli細胞中的表達產(chǎn)物。特征：相對分子質(zhì)量為94×103，為單分子酶，具較強的5’→3’DNA聚合酶活性和較弱的5’→3’外切酶活性，缺乏3’→5’外切酶活性。最適pH9.0，最適反應(yīng)溫度75℃。合成出錯幾率8.9×10-5～1.1×10-4。PwoDNA聚合酶

來自喜溫性古細菌Pyrococcuswoesei?，F(xiàn)市場上銷售的是該基因在E.coli細胞中的表達產(chǎn)物。特征：相對分子質(zhì)量為90×103，具較強的5’→3’DNA聚合酶活性，兼3’→5’外切酶活性。耐熱性更高，保真度比TaqDNA聚合酶高10倍。5、耐高溫DNA聚合酶TaqDNA聚合酶

TthDNA聚合酶來自喜溫性真細菌ThermusthermophilusHB8。具較強的5’→3’DNA聚合酶活性，缺乏3’→5’外切酶活性。最適pH9.0，最適反應(yīng)溫度75℃。Mg2+存在時，以DNA為模板合成DNA，Mn2+存在時，可以RNA為模板合成cDNA，用于RT-PCR系統(tǒng)。VentDNA聚合酶來自嗜熱高溫球菌Thermococcuslitoralis

。相對分子質(zhì)量85×103。100℃時該酶半衰期為1.8hr，具有3’→5’外切酶校對活性。合成的準確度比用TaqDNA聚合酶高5～

15倍。

PfuDNA聚合酶來自激烈熱球菌Pyrococcusfariosus。保真度較高。TthDNA聚合酶來自喜溫性真細菌Thermusth

KODDNA聚合酶特征：①具有強力的3’→5’核酸外切酶活性，與TaqDNA聚合酶相比，保真度比后者高50倍左右。②合成速度比TaqDNA聚合酶快2倍，比PfuDNA聚合酶快6倍。③耐熱性比TaqDNA聚合酶好，在100℃、1小時的熱處理后仍可保持約70％的活性，故根據(jù)需要可以將熱變性步驟的溫度設(shè)定值提得更高，這對處理GC含量高的模板等具有特異性高級結(jié)構(gòu)的樣品非常有利。KODDNA聚合酶特征：①具有強力的3’→5’核酸外PCR反應(yīng)程序1、常規(guī)程序90～98℃預(yù)熱30sec～5min；90～98℃變性15～30sec；40～60℃退火30sec；72℃延伸1min（1kb）；72℃延伸7～10min；4℃

保存。20～35循環(huán)PCR反應(yīng)程序1、常規(guī)程序90～98℃預(yù)熱30sec～5反應(yīng)底物和產(chǎn)物在DNA擴增中不斷發(fā)生變化，最終將會導(dǎo)致聚合反應(yīng)進入平臺期，平臺期出現(xiàn)的時間與聚合酶的特性有關(guān)。研究表明，利用Klenow片段進行20次擴增后進入平臺期，累積產(chǎn)物拷貝數(shù)為2×105，當采用TaqDNA聚合酶時，擴增25次后才進入平臺期，拷貝數(shù)可達4×106。出現(xiàn)平臺期的原因可能有：①后期循環(huán)酶濃度或聚合時間不足；②引物耗盡；③dNTP耗盡；④產(chǎn)物濃度過高，以致ds-DNA解鏈后又迅速退火，不能與引物結(jié)合。反應(yīng)底物和產(chǎn)物在DNA擴增中不斷發(fā)生變化，最終將會導(dǎo)致聚合反

一、基因工程概述

1.概念

基因工程：是指將外源基因經(jīng)過剪切加工，再插入到一個具有自我復(fù)制能力的載體DNA中，就得到重組DNA，再將重組DNA轉(zhuǎn)移到一個寄主細胞中，外源基因就可以隨著寄主細胞的分裂進行繁殖，寄主細胞也借此獲得外源基因所攜帶的新特性。

第二節(jié)基因工程

一、基因工程概述

1.概念

基因工程：是2.基因工程的基本程序及技術(shù)特點：

①基本程序：

分—切—接—轉(zhuǎn)—篩

2.基因工程的基本程序及技術(shù)特點：

①基本程序：

基因工程的基本程序基因工程的基本程序分子生物學研究方法課件②技術(shù)特點：

1.可在體外根據(jù)需要進行人工的、有目的的基因重組、表達、測序、誘變、修復(fù)；

2.方法簡便、快速、準確、特異，能保證研究與開發(fā)的需要。②技術(shù)特點：

1.可在體外根據(jù)需要進行人工3.基因工程的主要技術(shù)DNA、RNA的分離純化凝膠電泳技術(shù)PCR技術(shù)DNA合成技術(shù)DNA重組微生物的培養(yǎng)、保存酶切鑒定

DNA測序分子雜交3.基因工程的主要技術(shù)DNA、RNA的分離純化4.1概念4.基因克隆克隆的概念

⑴在多細胞的高等生物個體水平上，是指由具有相同基因型的同一物種的兩個或數(shù)個個體組成的群體。⑵在細胞水平上，是指由同一個祖細胞分裂而來的一群遺傳上同一的子細胞群體。⑶在分子生物學上，是指將外源DNA插入具有復(fù)制能力的載體DNA中，使之永久保存和復(fù)制的過程。4.1概念4.基因克隆克隆的概念

⑴在多細胞的高等生物個體水亞克隆的概念

是對已經(jīng)獲得的目的DNA片段進行重新克隆，其目的在于對目的DNA進行進一步分析，或者進行重組改造等。亞克隆的概念是對已經(jīng)獲得的目的DNA片段進行重新克隆，其目

基因克隆是指應(yīng)用酶學的方法，在體外將目的基因與載體DNA結(jié)合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子（重組體），繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細胞，再進行擴增、提取獲得大量相同的DNA分子拷貝?；蚩寺?.2基因克隆示意圖4.2基因克隆示意圖二.基因工程的要素及實施二.基因工程的要素及實施（一）、工具酶限制性核酸內(nèi)切酶識別并在特定位點切割DNADNA連接酶通過生成3′,5′-磷酸二酯鍵,把兩個或多個DNA片段連接成一個DNA分子DNA聚合酶Ⅰ探針標記、從3′-OH端補平雙鏈ＤＮＡ中的缺口反轉(zhuǎn)錄酶以RNA鏈為模板，進行cDNA合成多核苷酸激酶5′－ＯＨ磷酸化、探針標記末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈核酸的末端3′－ＯＨ加上多聚單核苷酸堿性磷酸酶切除5′末端磷酸基1.常用的工具酶的功能：酶類名稱功能（一）、工具酶限制性核酸內(nèi)切酶識別并在特定位點切割DNADN

阿爾伯(Arber)、史密斯(Smith)和內(nèi)森斯(Nathans)，獲1978年度諾貝爾生理學和醫(yī)學獎.2.一把特殊的剪刀

——限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)阿爾伯(Arber)、史密斯(Smith)和3.限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionenzyme)的分類、作用及命名作用：識別雙鏈DNA內(nèi)部特異位點并裂解磷酸二酯鍵分類：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型命名（舉例）EcoRⅠ(E：屬名；co：種名；R：株；Ⅰ：發(fā)現(xiàn)次序)3.限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionenzyme)3.限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionenzyme)的識別和切割識別和切割位點：回文結(jié)構(gòu)4～6bp出現(xiàn)兩種末端：粘性末端（粘端）

平頭末端（平端）

產(chǎn)生了平頭末端產(chǎn)生了粘性末端3.限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionenzyme)粘性末端與平頭末端粘性末端與平頭末端4.修飾與限制作用4.修飾與限制作用

活性：①5′→3′聚合酶活性：

②核酸外切酶活性：5′→3′外切酶活性3′→5′外切酶活性

DNApolⅠ經(jīng)枯草桿菌蛋白酶裂解可得大、小兩個片段大片段（Klenow片段）具有5′→3′聚合活性和3′→5′外切活性，是常用的工具酶。5.DNA聚合酶Ⅰ(polⅠ)

活性：①5′→3′聚合酶活性：5.DNA6.DNA連接酶6.DNA連接酶分子生物學研究方法課件7.同工異源酶：來源不同，但能識別和切割同一位點。8.同尾酶：識別序列不同，但產(chǎn)生相同的粘性末端。7.同工異源酶：來源不同，但能識別和切割同一位點。（二）、載體（vector）1.本質(zhì)：DNA，能在宿主細胞中進行自我復(fù)制和表達2.克隆載體的種類：原核載體：質(zhì)粒(pBR322,pUC…）噬菌體（λ，M13）等真核載體：動物病毒載體pLXSN等（二）、載體（vector）1.本質(zhì)：DNA，能在宿3.載體的基本要求：

①.復(fù)制單位;

②.克隆位點(多個單克隆位點);

③.篩選標記;

④.分子量盡可能小;

⑤.外源DNA插入后不影響載體本身的復(fù)制能力.

沒有一個天然的DNA完全符合載體條件,故使用時需進行改造.

3.載體的基本要求：

①.復(fù)制單位;

②.克隆位點(多

4.常用的克隆載體Ⅰ：質(zhì)粒質(zhì)粒(plasmid)—存在于細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。

4.常用的克隆載體Ⅰ：質(zhì)粒質(zhì)粒(plas從天然質(zhì)粒到質(zhì)粒載體從天然質(zhì)粒到質(zhì)粒載體*大小2~10kb；*優(yōu)點：易于操作、保存；*缺點：轉(zhuǎn)化效率較低；*轉(zhuǎn)化方法：化學法電轉(zhuǎn)移法*應(yīng)用：a.小基因組的克隆

b.單一序列的克隆(目的基因的克隆)（1）質(zhì)粒載體的一般特點：*大小2~10kb；（1）質(zhì)粒載體的一般特點：（2）理想的質(zhì)粒載體具有如下特點：

①拷貝數(shù)多;②兩三個遺傳標志，如抗藥性基因：抗氨芐青霉素基因(ampr)

、抗四環(huán)素基因(terr)；β-半乳糖苷酶基因(lacZ)——篩選標志③多個限制酶的單一切點，即多克隆位點(multiplecloningsites,MCS)（2）理想的質(zhì)粒載體具有如下特點：①pBR系列

來源于Psc101、colE1和RSF2124三個天然質(zhì)粒改造重組而成。pBR322是應(yīng)用最多的大腸桿菌質(zhì)粒載體，用氯霉素擴增法可使質(zhì)粒DNA占細胞DNA總量的50%，這對制備大量質(zhì)粒DNA極為有利。（3）質(zhì)粒載體舉例①pBR系列

來源于Psc101、colE1和R分子生物學研究方法課件分子生物學研究方法課件②pUC系列

pUC系列質(zhì)粒（pUC8、9、12、13、18、19）具有pBR和M13的許多特性，一般2.7kb.含有Ampr基因和LacZ基因的一部分。

②pUC系列

pUC系列質(zhì)粒（pUC8、9分子生物學研究方法課件5.常用的克隆載體Ⅱ——噬菌體載體5.常用的克隆載體Ⅱ——噬菌體載體（1）λ噬菌體(λphage)的特點：①.一種能感染大腸桿菌的病毒，野生型含有雙鏈線狀DNA分子（λDNA），長度48.5kb,分子兩端各有一個12bp組成的粘性末端,感染大腸桿菌后,線狀DNA通過粘性末端互補連接成環(huán),連接處稱COS位點。②.本身有復(fù)制體系;③.感染大腸桿菌后要進行環(huán)化（1）λ噬菌體(λphage)的特點：λDNA感染大腸桿菌后的環(huán)化過程λDNA感染大腸桿菌后的環(huán)化過程④.λDNA在體外可包裝成病毒顆粒,感染效率高;⑤.載體容量大,可裝入大片段外源DNA(20kb);⑥.可人工加入多克隆位點;⑦.篩選容易——噬菌斑篩選;⑧.主要用于DNA文庫的構(gòu)建.④.λDNA在體外可包裝成病毒顆粒,感染（2）M13噬菌體

特點：一種絲狀單鏈噬菌體，閉環(huán)正鏈ssDNA，全長6.5kb,感染大腸桿菌后,ssDNA轉(zhuǎn)變?yōu)閐sDNA,可用作克隆載體。

最大優(yōu)點：產(chǎn)生單鏈DNA,可制備單鏈DNA探針。

（2）M13噬菌體

特點：一種絲狀單鏈噬菌體，閉

柯斯質(zhì)粒(cosmid)粘性質(zhì)粒

基本結(jié)構(gòu)特征:是一種人工改造的載體,雙鏈環(huán)狀DNA

組成:λDNA的cos區(qū)+質(zhì)粒+控制包裝作用的序列

克隆容量：31~45kb

常用的克隆載體Ⅲ——柯斯質(zhì)粒

柯斯質(zhì)粒(cosmid)粘性質(zhì)粒

基本結(jié)4.cosmid較小,約4–6kb.

5.cosmid重組體可象噬菌體一樣進行外殼裝配,形成噬菌體顆粒,感染大腸桿菌效率比質(zhì)粒高得多,進入宿主細胞后,只能象質(zhì)粒一樣擴增,并依賴抗藥性被篩選.1.具有λ-DNA的COS位點;

2.具有質(zhì)粒的復(fù)制起點和抗藥性標記(Ampr);

3.具有多種單一的酶切位點.

柯斯質(zhì)粒(cosmid)的特點:

4.cosmid較小,約4–6kb.

5.cosm柯斯質(zhì)粒的優(yōu)缺點:

1.克隆效率高;

2.可利用質(zhì)粒DNA的方式擴增;

3.可克隆較大DNA片段;

主要用于真核基因的克隆,基因組文庫構(gòu)建

4.缺點:產(chǎn)生串聯(lián)現(xiàn)象。

柯斯質(zhì)粒的優(yōu)缺點:

1.克隆效率高;

2.可利用質(zhì)粒YAC載體

酵母人工染色體，可容納外源基因片段長達200kb-1000kb，含有酵母第4號染色體的著絲粒和自主復(fù)制序列CEN4、ARS1，作為端粒的Tel序列，選擇性標志URA3、TRP1和SUP4，能在酵母中穩(wěn)定的復(fù)制，常用于大的染色體基因組DNA文庫構(gòu)建。其他克隆載體：YAC載體其他克隆載體：

插入型載體——含單一的限制性酶切位點，可接受10kb以下的外源片段，可用于cDNA文庫構(gòu)建；

取代型載體——含某一限制性酶的兩個切點，可接受20kb左右的外源片段，可用于基因組DNA文庫構(gòu)建。經(jīng)人工改造生成的基因克隆載體類型

插入型載體——含單一的限制性酶切位點，可接受1目的基因(targetDNA)的制備目的基因（外源基因）制備基因組DNA基因文庫(genomiclibrary)—存在于轉(zhuǎn)化細菌中、克隆載體攜帶的所有基因組DNA的集合制備cDNAcDNA文庫(cDNAlibrary)制備用于表達的基因片段：PCR技術(shù)、化學合成目的基因(targetDNA)的制備目的基因（外源基因）文庫構(gòu)建

基因組文庫\cDNA文庫

區(qū)別：材料

基因結(jié)構(gòu)不同

文庫內(nèi)容

載體

使用范圍文庫構(gòu)建

基因組文庫\cDNA文庫

區(qū)別：材料

構(gòu)建基因文庫的克隆載體粘粒(Cosmid)細菌人工染色體(BAC)酵母人工染色體(YAC)P1噬菌體人工染色體(PAC)構(gòu)建基因文庫的克隆載體粘粒(Cosmid)基因文庫的構(gòu)建的步驟:①載體DNA的分離②真核生物DNA的分離③部分酶解④片段回收(9-23kb)⑤載體與插入片段的連接⑥包裝⑦文庫的效價測定⑧文庫的擴增⑨文庫的保存⑩重組克隆鑒定基因文庫的構(gòu)建的步驟:①載體DNA的分離cDNA文庫的構(gòu)建：基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA高豐度中豐度低豐度cDNA文庫的構(gòu)建：基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA高豐度中

cDNA文庫的構(gòu)建cDNA文庫能否構(gòu)建成功的關(guān)鍵是:

高質(zhì)量的mRNA的獲得一個好的cDNA文庫的特征:①包含有足夠大量的獨立克隆，代表最初的mRNA樣品中的所有轉(zhuǎn)錄本②克隆中包含接近全長的mRNAcDNA文庫的構(gòu)建cDNA文庫能cDNAlibraryconstructionAAAAA5’3’mRNA(allmRNAsincell)annealoligo(dT)primersof12-18basesinlengthAAAAATTTTT5’3’5’addreversetranscriptaseanddNTPsAAAAATTTTT5’3’3’5’cDNAaddRNaseH(specificfortheRNAstrandofanRNA-DNAhybrid)andcarryoutapartialdigestionAATTTTT5’shortRNAfragmentsserveasprimersforsecondstrandsynthesisusingDNApolymeraseI3’3’cDNAlibraryconstructionAAAAAAAAATTTTT5’3’shortRNAfragmentsserveasprimersforsecondstrandsynthesisusingDNApolymeraseIAAATTTTT5’3’DNApolymeraseIremovestheremainingRNAwithits5’to3’exonucleaseactivityandcontinuessynthesisDNAligasesealsthegapsAAATTTTT5’3’AAAAATTTTT5’3’double-strandedcDNAAAAAA5’shortRNAfragmentsserAAAAATTTTT5’3’NNNNNNNNGNNNNNNNNCTTAAEcoRIlinkersareligatedtobothends usingDNAligaseAAAAANNNNNNNNGTTTTTNNNNNNNNCTTAAdouble-strandedcDNAcopiesofmRNAwithEcoRIcohesiveendsarenowreadytoligateintoabacteriophagelambdavectorcutwithEcoRI5’3’AATTCNNNNNNNNGNNNNNNNNAAAAA5’NNNNNNNNGEcoRIlinkers分子生物學研究方法課件CIP:牛小腸堿性磷酸酶粘性末端連接法（連接效率高）和去５’磷酸連接法載體與目的基因的連接方法CIP:牛小腸堿性磷酸酶粘性末端連接法（連接效率高）載體與目人工接頭法：人工接頭法：同聚物接尾法同聚物接尾法重組DNA技術(shù)的基本過程小結(jié)目的基因的制備載體的選擇和制備DNA分子的體外連接將外源DNA導(dǎo)入宿主細胞目的基因的篩選和鑒定重組DNA技術(shù)的基本過程小結(jié)目的基因的制備基因工程的基本操作步驟及其應(yīng)用意義基因工程的基本操作步驟：①獲取外源目的基因；②尋找基因載體(通常為質(zhì)粒、噬菌體等)使用限制性內(nèi)切酶，使目的基因與載體產(chǎn)生相同粘性末端，兩個末端互補連接，形成重組DNA；③通過轉(zhuǎn)化(或感染)將重組DNA引入寄主細胞；④從大量的寄主細胞中篩選出帶有重組DNA的細胞進行培養(yǎng)。基因工程的基本操作步驟及其應(yīng)用意義基因工程的基本操作步驟：意義：①利用基因工程技術(shù)，可以大量生產(chǎn)在一些正常細胞中產(chǎn)量很低的多肽物質(zhì)，用于醫(yī)藥等工業(yè)生產(chǎn)中；②定向改造生物基因結(jié)構(gòu)，生產(chǎn)抗病強、品質(zhì)優(yōu)的各種農(nóng)副產(chǎn)品，以提高經(jīng)濟價值；③用于生命科學的基礎(chǔ)研究；④值得注意的是，基因工程技術(shù)若使用不當、管理不善，也會給人類帶來災(zāi)難。意義：分子生物學研究方法分子生物學研究方法第一節(jié)基因操作的主要技術(shù)原理

1．核酸的凝膠電泳(Agarose&Polyacrylamide)

將某種分子放到特定的電場中，它就會以一定的速度向適當?shù)碾姌O移動。某物質(zhì)在電場作用下的遷移速度叫作電泳的速率，它與電場強度成正比，與該分子所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，而與分子的磨擦系數(shù)成反比（分子大小、極性、介質(zhì)的粘度系數(shù)等）。在生理條件下，核酸分子中的磷酸基團是離子化的，所以，DNA和RNA實際上呈多聚陰離子狀態(tài)（Polyanions）。將DNA、RNA放到電場中，它就會由負極→正極移動。第一節(jié)基因操作的主要技術(shù)原理1．核酸的凝膠電泳(A分子生物學研究方法課件2．核酸的分子雜交技術(shù)

在大多數(shù)核酸雜交反應(yīng)中，經(jīng)過凝膠電泳分離的DNA或RNA分子，都是在雜交之前，通過毛細管作用或電導(dǎo)作用按其在凝膠中的位置原封不動地“吸印”轉(zhuǎn)移到濾膜上的。常用的濾膜有尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜，疊氮苯氧甲基纖維素濾紙（DBM）和二乙氨基乙基纖維素濾膜（DEAE）2．核酸的分子雜交技術(shù)核酸分子雜交實驗包括如下兩個步驟：

1.將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上，這個過程特稱為核酸印跡(nucleicacidblotting)轉(zhuǎn)移，主要有電泳凝膠核酸印跡法、斑點和狹線印跡法(dotandslotblotting)、菌落和噬菌斑印跡法(colonyandplaqueblotting)；

2.將具有核酸印跡的濾膜同帶有放射性標記或其它標記的DNA或RNA探針進行雜交。所以有時也稱這類核酸雜交為印跡雜交。核酸分子雜交實驗包括如下兩個步驟：

1.將核酸樣品轉(zhuǎn)移分子生物學研究方法課件分子生物學研究方法課件3．細菌的轉(zhuǎn)化

所謂細菌轉(zhuǎn)化，是指一種細菌菌株由于捕獲了來自另一種細菌菌株的DNA，而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程。這種提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫做供體菌株，而接受轉(zhuǎn)化DNA的寄主菌株則稱做受體菌株。大腸桿菌是最廣泛使用的實驗菌株。在加入轉(zhuǎn)化DNA之前，必須預(yù)先用CaCl2處理大腸桿菌細胞，使之呈感受態(tài)（CompetentCells）。Mg2+對維持外源DNA的穩(wěn)定性起重要作用，質(zhì)粒DNA中的抗生素是篩選標記。

3．細菌的轉(zhuǎn)化4．DNA序列分析a.Sanger的雙脫氧鏈終止法

Cambridge的F.Sanger在1977年發(fā)明用雙脫氧鏈終止法測定單鏈DNA的序列，其基本原理如下：①DNA聚合酶能夠用單鏈DNA作為模板，合成準確的DNA互補鏈；DNA聚合酶常用Klenow大片段，無5'→3'外切酶活性。②該酶能夠用2'，3'--雙脫氧核苷三磷酸作底物并將其聚合到新生寡核苷酸鏈的3'-末端，從而終止其延伸反應(yīng)。在DNA測序反應(yīng)中，加入模板DNA，引物（特異性引物，如T7，T3，M13等），DNA聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTP和一種ddNTP。4．DNA序列分析分子生物學研究方法課件雙脫氧鏈末端終止法測序基本原理示意圖雙脫氧鏈末端終止法測序基本原理示意圖分子生物學研究方法課件b．DNA序列分析自動化(分析反應(yīng)\讀片過程

)

用四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)作為熒光劑標記DNA引物，帶有這種引物的DNA片段能在激光誘導(dǎo)下發(fā)出熒光。按照標準的雙脫氧終止法或化學終止法進行測序反應(yīng)，跑DNA凝膠后,用計算機檢測。b．DNA序列分析自動化(分析反應(yīng)\讀片過程)DNA測序的全過程(實際)DNA測序的全過程(實際)5．基因的定點誘變（site-directedmutagenesis）

使已克隆基因或DNA片段中的任何一個特定堿基發(fā)生取代、插入或缺失變化的過程叫作基因的定點誘變，是基因工程和蛋白質(zhì)工程的重要手段。如：盒式誘變(cassettemutagenesis)，包括盒式取代誘變和混合寡核苷酸誘變兩種方式。5．基因的定點誘變（site-directedmutag6．利用DNA與蛋白質(zhì)的相互作用進行核酸研究.a.凝膠滯緩實驗(Gelretardationassay)，又稱DNA遷移率變化試驗(DNAmobilityshiftassay--EMSA)。

6．利用DNA與蛋白質(zhì)的相互作用進行核酸研究.a.凝膠滯b．DNaseI印跡試驗（DNaseIfootprinting）主要步驟：

①用32P標記DNA雙鏈末端，并用RE切去一端；

②加入細胞特定周期蛋白質(zhì)提取物，溫育；

③加入適量DNaseI或硫酸二甲酯-六氫吡啶，使DNA鏈發(fā)生斷裂。

這一反應(yīng)中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常關(guān)鍵，要保證每一條DNA鏈只發(fā)生一次磷酸二酯斷裂！

④沉淀DNA（包括與DNA相結(jié)合的蛋白質(zhì)）；

⑤進行DNA凝膠分析。

如果某個蛋白質(zhì)已經(jīng)與DNA的特定區(qū)段相結(jié)合，那么，它就會保證該區(qū)段DNA免受消化或降解作用。在電泳凝膠的放射自顯影圖片上，相應(yīng)于蛋白質(zhì)結(jié)合的部位不產(chǎn)生放射性標記的條帶,而是出現(xiàn)了一個空白的區(qū)域,形象地稱為足跡。b．DNaseI印跡試驗（DNaseIfootp7聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）技術(shù)PCR（polymerasechainreaction）：聚合酶鏈式反應(yīng)。1983年由美國科學家KaryMullis提出，1993年因此而獲諾貝爾獎。PCR技術(shù)是指通過模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的方式，在體外選擇性地將DNA某個特殊區(qū)域擴增出來的技術(shù)，它包括變性、退火、延伸三個步驟。7聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）技術(shù)PCR（polymeraseKaryB.Mullis(1944-)，在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR。他原本是要合成DNA引物來進行測序工作，卻常為沒有足夠多的模板DNA而煩惱。1983年春夏之交的一個晚上，他開車去鄉(xiāng)下別墅的路上萌發(fā)了用兩個引物（而不是一個引物）去擴增模板DNA的想法…...KaryB.Mullis(1944-)，在CetusMullis開車的時候,瞬間感覺兩排路燈就是DNA的兩條鏈，自己的車和對面開來的車象是DNA聚合酶，面對面地合成.DNA，……Mullis開車的時候,瞬間感覺兩排路燈就是DNA的兩條鏈1983年9月中旬。Mullis在反應(yīng)體系中加入DNA聚合酶后在37℃一直保溫。結(jié)果第二天在瓊脂糖電泳上沒有看到任何條帶。于是他認識到有必要用加熱來解鏈，每次解鏈后再加入DNA聚合酶進行反應(yīng)，依次循環(huán)。1983年12月，他終于看到了被同位素標記的PCR條帶。Mullis的第一個PCR實驗1983年9月中旬。Mullis在反應(yīng)體系中加入DNA聚合酶PCR的基本原理

引物

dNTP

耐熱DNA聚合酶模板DNA

變性（denaturation）：90～98℃；退火（annealing）：37～

72℃；延伸（extension）：72℃?；疽財U增步驟PCR的基本原理引物變性（denaturation）：9分子生物學研究方法課件5’-GGTA……TCAT-3’3’-CCAT……AGTA-5’5’GGTA-OH（引物1）5’ATGA-OH（引物2）90~98℃3’-CCAT…………AGTA-5’5’-GGTA…………TCAT-3’37~72℃3’-CCAT…………AGTA-5’5’-GGTA…………TCAT-3’5’GGTA-OHOH-AGTA5’70~75℃5’-GGTA……TCAT-3’3’-CCAT……AGTA-5’5’-GGTA……TCAT-3’3’-CCAT……AGTA-5’90~98℃37~72℃3’-CCAT……AGTA-5’5’-GGTA……TCAT-3’5’GGTA-OHOH-AGTA5’70~75℃5’-GGTA……TCAT-3’3’-CCAT……AGTA-5’5’-GGTA……TCAT-3’3’-CCAT……AGTA-5’3’-CCAT……AGTA-5’5’-GGTA……TCAT-3’(略)(底物DNA)(略)(略)PCR擴增特異性DNA片段全過程5’-GGTA……TCAT-3’5’GGTA-OH（引物1分子生物學研究方法課件PCR反應(yīng)體系1、脫氧核苷三磷酸（dNTP）dATP、dGTP、dCTP、dTTP是PCR的原材料，通過PCR過程聚合成互補鏈DNA。貯存濃度：2.5mM使用濃度：200μM使用濃度不當會影響擴增的產(chǎn)量、特異性和保真度。PCR反應(yīng)體系1、脫氧核苷三磷酸（dNTP）dATP、dG2、緩沖液（buffer）標準10×：140mMTris-HCl（pH8.8）

4~8mMMgCl240mM(NH4)2SO430μg/mlBSA16mMDTT不同廠家生產(chǎn)的DNA聚合酶所用到的buffer不同。2、緩沖液（buffer）標準10×：140mMTris3、引物（primer）

最佳引物使用濃度為0.1μM~1.0μM之間。引物濃度太低，擴增產(chǎn)物太少；引物濃度太高，易出現(xiàn)非特異性擴增反應(yīng)。一般貯存濃度：10μM

使用濃度：0.4μM引物設(shè)計要求:

設(shè)計的引物的核苷酸序列必須與模板鏈3’端的一段核苷酸序列互補,且3’端必須有游離的-OH基團；引物一般由20~30個核苷酸組成，4種核苷酸盡可能隨機分布，GC含量應(yīng)達40~60%；引物中應(yīng)盡量避免回紋序列出現(xiàn)；引物中最好含有進一步操作中可利用的限制性核酸內(nèi)切酶識別序列。3、引物（primer）最佳引物使用濃度為0.Tm（解鏈溫度）值的計算公式：引物長度＜20nt時：Tm=4×（G+C）+2×（A+T）引物長度＞20nt時：Tm=81.5+0.41×（GC）%－600/LPCR過程中選擇退火溫度時，一般為（Tm－5）℃Tm（解鏈溫度）值的計算公式：引物長度＜20nt時：Tm=44、模板DNA作為PCR的靶DNA一般是一個待擴增的特定雙鏈DNA片段，應(yīng)知道其兩端20~30bp的核苷酸序列，供設(shè)計一對引物之用。PCR的模板是一條單鏈DNA片段，其3’端具有與引物雜交的序列。4、模板DNA作為PCR的靶DNA一般是一個待擴增的特定雙5、耐高溫DNA聚合酶TaqDNA聚合酶

來自嗜熱古細菌Thermusaquaticus。該菌1967年從溫泉中分離，最適生長溫度70℃。現(xiàn)市場上銷售的是該基因在E.coli細胞中的表達產(chǎn)物。特征：相對分子質(zhì)量為94×103，為單分子酶，具較強的5’→3’DNA聚合酶活性和較弱的5’→3’外切酶活性，缺乏3’→5’外切酶活性。最適pH9.0，最適反應(yīng)溫度75℃。合成出錯幾率8.9×10-5～1.1×10-4。PwoDNA聚合酶

來自喜溫性古細菌Pyrococcuswoesei。現(xiàn)市場上銷售的是該基因在E.coli細胞中的表達產(chǎn)物。特征：相對分子質(zhì)量為90×103，具較強的5’→3’DNA聚合酶活性，兼3’→5’外切酶活性。耐熱性更高，保真度比TaqDNA聚合酶高10倍。5、耐高溫DNA聚合酶TaqDNA聚合酶

TthDNA聚合酶來自喜溫性真細菌ThermusthermophilusHB8。具較強的5’→3’DNA聚合酶活性，缺乏3’→5’外切酶活性。最適pH9.0，最適反應(yīng)溫度75℃。Mg2+存在時，以DNA為模板合成DNA，Mn2+存在時，可以RNA為模板合成cDNA，用于RT-PCR系統(tǒng)。VentDNA聚合酶來自嗜熱高溫球菌Thermococcuslitoralis

。相對分子質(zhì)量85×103。100℃時該酶半衰期為1.8hr，具有3’→5’外切酶校對活性。合成的準確度比用TaqDNA聚合酶高5～

15倍。

PfuDNA聚合酶來自激烈熱球菌Pyrococcusfariosus。保真度較高。TthDNA聚合酶來自喜溫性真細菌Thermusth

KODDNA聚合酶特征：①具有強力的3’→5’核酸外切酶活性，與TaqDNA聚合酶相比，保真度比后者高50倍左右。②合成速度比TaqDNA聚合酶快2倍，比PfuDNA聚合酶快6倍。③耐熱性比TaqDNA聚合酶好，在100℃、1小時的熱處理后仍可保持約70％的活性，故根據(jù)需要可以將熱變性步驟的溫度設(shè)定值提得更高，這對處理GC含量高的模板等具有特異性高級結(jié)構(gòu)的樣品非常有利。KODDNA聚合酶特征：①具有強力的3’→5’核酸外PCR反應(yīng)程序1、常規(guī)程序90～98℃預(yù)熱30sec～5min；90～98℃變性15～30sec；40～60℃退火30sec；72℃延伸1min（1kb）；72℃延伸7～10min；4℃

保存。20～35循環(huán)PCR反應(yīng)程序1、常規(guī)程序90～98℃預(yù)熱30sec～5反應(yīng)底物和產(chǎn)物在DNA擴增中不斷發(fā)生變化，最終將會導(dǎo)致聚合反應(yīng)進入平臺期，平臺期出現(xiàn)的時間與聚合酶的特性有關(guān)。研究表明，利用Klenow片段進行20次擴增后進入平臺期，累積產(chǎn)物拷貝數(shù)為2×105，當采用TaqDNA聚合酶時，擴增25次后才進入平臺期，拷貝數(shù)可達4×106。出現(xiàn)平臺期的原因可能有：①后期循環(huán)酶濃度或聚合時間不足；②引物耗盡；③dNTP耗盡；④產(chǎn)物濃度過高，以致ds-DNA解鏈后又迅速退火，不能與引物結(jié)合。反應(yīng)底物和產(chǎn)物在DNA擴增中不斷發(fā)生變化，最終將會導(dǎo)致聚合反

一、基因工程概述

1.概念

基因工程：是指將外源基因經(jīng)過剪切加工，再插入到一個具有自我復(fù)制能力的載體DNA中，就得到重組DNA，再將重組DNA轉(zhuǎn)移到一個寄主細胞中，外源基因就可以隨著寄主細胞的分裂進行繁殖，寄主細胞也借此獲得外源基因所攜帶的新特性。

第二節(jié)基因工程

一、基因工程概述

1.概念

基因工程：是2.基因工程的基本程序及技術(shù)特點：

①基本程序：

分—切—接—轉(zhuǎn)—篩

2.基因工程的基本程序及技術(shù)特點：

①基本程序：

基因工程的基本程序基因工程的基本程序分子生物學研究方法課件②技術(shù)特點：

1.可在體外根據(jù)需要進行人工的、有目的的基因重組、表達、測序、誘變、修復(fù)；

2.方法簡便、快速、準確、特異，能保證研究與開發(fā)的需要。②技術(shù)特點：

1.可在體外根據(jù)需要進行人工3.基因工程的主要技術(shù)DNA、RNA的分離純化凝膠電泳技術(shù)PCR技術(shù)DNA合成技術(shù)DNA重組微生物的培養(yǎng)、保存酶切鑒定

DNA測序分子雜交3.基因工程的主要技術(shù)DNA、RNA的分離純化4.1概念4.基因克隆克隆的概念

⑴在多細胞的高等生物個體水平上，是指由具有相同基因型的同一物種的兩個或數(shù)個個體組成的群體。⑵在細胞水平上，是指由同一個祖細胞分裂而來的一群遺傳上同一的子細胞群體。⑶在分子生物學上，是指將外源DNA插入具有復(fù)制能力的載體DNA中，使之永久保存和復(fù)制的過程。4.1概念4.基因克隆克隆的概念

⑴在多細胞的高等生物個體水亞克隆的概念

是對已經(jīng)獲得的目的DNA片段進行重新克隆，其目的在于對目的DNA進行進一步分析，或者進行重組改造等。亞克隆的概念是對已經(jīng)獲得的目的DNA片段進行重新克隆，其目

基因克隆是指應(yīng)用酶學的方法，在體外將目的基因與載體DNA結(jié)合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子（重組體），繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細胞，再進行擴增、提取獲得大量相同的DNA分子拷貝?；蚩寺?.2基因克隆示意圖4.2基因克隆示意圖二.基因工程的要素及實施二.基因工程的要素及實施（一）、工具酶限制性核酸內(nèi)切酶識別并在特定位點切割DNADNA連接酶通過生成3′,5′-磷酸二酯鍵,把兩個或多個DNA片段連接成一個DNA分子DNA聚合酶Ⅰ探針標記、從3′-OH端補平雙鏈ＤＮＡ中的缺口反轉(zhuǎn)錄酶以RNA鏈為模板，進行cDNA合成多核苷酸激酶5′－ＯＨ磷酸化、探針標記末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈核酸的末端3′－ＯＨ加上多聚單核苷酸堿性磷酸酶切除5′末端磷酸基1.常用的工具酶的功能：酶類名稱功能（一）、工具酶限制性核酸內(nèi)切酶識別并在特定位點切割DNADN

阿爾伯(Arber)、史密斯(Smith)和內(nèi)森斯(Nathans)，獲1978年度諾貝爾生理學和醫(yī)學獎.2.一把特殊的剪刀

——限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)阿爾伯(Arber)、史密斯(Smith)和3.限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionenzyme)的分類、作用及命名作用：識別雙鏈DNA內(nèi)部特異位點并裂解磷酸二酯鍵分類：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型命名（舉例）EcoRⅠ(E：屬名；co：種名；R：株；Ⅰ：發(fā)現(xiàn)次序)3.限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionenzyme)3.限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionenzyme)的識別和切割識別和切割位點：回文結(jié)構(gòu)4～6bp出現(xiàn)兩種末端：粘性末端（粘端）

平頭末端（平端）

產(chǎn)生了平頭末端產(chǎn)生了粘性末端3.限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionenzyme)粘性末端與平頭末端粘性末端與平頭末端4.修飾與限制作用4.修飾與限制作用

活性：①5′→3′聚合酶活性：

②核酸外切酶活性：5′→3′外切酶活性3′→5′外切酶活性

DNApolⅠ經(jīng)枯草桿菌蛋白酶裂解可得大、小兩個片段大片段（Klenow片段）具有5′→3′聚合活性和3′→5′外切活性，是常用的工具酶。5.DNA聚合酶Ⅰ(polⅠ)

活性：①5′→3′聚合酶活性：5.DNA6.DNA連接酶6.DNA連接酶分子生物學研究方法課件7.同工異源酶：來源不同，但能識別和切割同一位點。8.同尾酶：識別序列不同，但產(chǎn)生相同的粘性末端。7.同工異源酶：來源不同，但能識別和切割同一位點。（二）、載體（vector）1.本質(zhì)：DNA，能在宿主細胞中進行自我復(fù)制和表達2.克隆載體的種類：原核載體：質(zhì)粒(pBR322,pUC…）噬菌體（λ，M13）等真核載體：動物病毒載體pLXSN等（二）、載體（vector）1.本質(zhì)：DNA，能在宿3.載體的基本要求：

①.復(fù)制單位;

②.克隆位點(多個單克隆位點);

③.篩選標記;

④.分子量盡可能小;

⑤.外源DNA插入后不影響載體本身的復(fù)制能力.

沒有一個天然的DNA完全符合載體條件,故使用時需進行改造.

3.載體的基本要求：

①.復(fù)制單位;

②.克隆位點(多

4.常用的克隆載體Ⅰ：質(zhì)粒質(zhì)粒(plasmid)—存在于細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。

4.常用的克隆載體Ⅰ：質(zhì)粒質(zhì)粒(plas從天然質(zhì)粒到質(zhì)粒載體從天然質(zhì)粒到質(zhì)粒載體*大小2~10kb；*優(yōu)點：易于操作、保存；*缺點：轉(zhuǎn)化效率較低；*轉(zhuǎn)化方法：化學法電轉(zhuǎn)移法*應(yīng)用：a.小基因組的克隆

b.單一序列的克隆(目的基因的克隆)（1）質(zhì)粒載體的一般特點：*大小2~10kb；（1）質(zhì)粒載體的一般特點：（2）理想的質(zhì)粒載體具有如下特點：

①拷貝數(shù)多;②兩三個遺傳標志，如抗藥性基因：抗氨芐青霉素基因(ampr)

、抗四環(huán)素基因(terr)；β-半乳糖苷酶基因(lacZ)——篩選標志③多個限制酶的單一切點，即多克隆位點(multiplecloningsites,MCS)（2）理想的質(zhì)粒載體具有如下特點：①pBR系列

來源于Psc101、colE1和RSF2124三個天然質(zhì)粒改造重組而成。pBR322是應(yīng)用最多的大腸桿菌質(zhì)粒載體，用氯霉素擴增法可使質(zhì)粒DNA占細胞DNA總量的50%，這對制備大量質(zhì)粒DNA極為有利。（3）質(zhì)粒載體舉例①pBR系列

來源于Psc101、colE1和R分子生物學研究方法課件分子生物學研究方法課件②pUC系列

pUC系列質(zhì)粒（pUC8、9、12、13、18、19）具有pBR和M13的許多特性，一般2.7kb.含有Ampr基因和LacZ基因的一部分。

②pUC系列

pUC系列質(zhì)粒（pUC8、9分子生物學研究方法課件5.常用的克隆載體Ⅱ——噬菌體載體5.常用的克隆載體Ⅱ——噬菌體載體（1）λ噬菌體(λphage)的特點：①.一種能感染大腸桿菌的病毒，野生型含有雙鏈線狀DNA分子（λDNA），長度48.5kb,分子兩端各有一個12bp組成的粘性末端,感染大腸桿菌后,線狀DNA通過粘性末端互補連接成環(huán),連接處稱COS位點。②.本身有復(fù)制體系;③.感染大腸桿菌后要進行環(huán)化（1）λ噬菌體(λphage)的特點：λDNA感染大腸桿菌后的環(huán)化過程λDNA感染大腸桿菌后的環(huán)化過程④.λDNA在體外可包裝成病毒顆粒,感染效率高;⑤.載體容量大,可裝入大片段外源DNA(20kb);⑥.可人工加入多克隆位點;⑦.篩選容易——噬菌斑篩選;⑧.主要用于DNA文庫的構(gòu)建.④.λDNA在體外可包裝成病毒顆粒,感染（2）M13噬菌體

特點：一種絲狀單鏈噬菌體，閉環(huán)正鏈ssDNA，全長6.5kb,感染大腸桿菌后,ssDNA轉(zhuǎn)變?yōu)閐sDNA,可用作克隆載體。

最大優(yōu)點：產(chǎn)生單鏈DNA,可制備單鏈DNA探針。

（2）M13噬菌體

特點：一種絲狀單鏈噬菌體，閉

柯斯質(zhì)粒(cosmid)粘性質(zhì)粒

基本結(jié)構(gòu)特征:是一種人工改造的載體,雙鏈環(huán)狀DNA

組成:λDNA的cos區(qū)+質(zhì)粒+控制包裝作用的序列

克隆容量：31~45kb

常用的克隆載體Ⅲ——柯斯質(zhì)粒

柯斯質(zhì)粒(cosmid)粘性質(zhì)粒

基本結(jié)4.cosmid較小,約4–6kb.

5.cosmid重組體可象噬菌體一樣進行外殼裝配,形成噬菌體顆粒,感染大腸桿菌效率比質(zhì)粒高得多,進入宿主細胞后,只能象質(zhì)粒一樣擴增,并依賴抗藥性被篩選.1.具有λ-DNA的COS位點;

2.具有質(zhì)粒的復(fù)制起點和抗藥性標記(Ampr);

3.具有多種單一的酶切位點.

柯斯質(zhì)粒(cosmid)的特點:

4.cosmid較小,約4–6kb.

5.cosm柯斯質(zhì)粒的優(yōu)缺點:

1.克隆效率高;

2.可利用質(zhì)粒DNA的方式擴增;

3.可克隆較大DNA片段;

主要用于真核基因的克隆,基因組文庫構(gòu)建

4.缺點:產(chǎn)生串聯(lián)現(xiàn)象。

柯斯質(zhì)粒的優(yōu)缺點:

1.克隆效率高;

2.可利用質(zhì)粒YAC載體

酵母人工染色體，可容納外源基因片段長達200kb-1000kb，含有酵母第4號染色體的著絲粒和自主復(fù)制序列CEN4、ARS1，作為端粒的Tel