高中生物競賽 蛋白組學 第二章 第一節(jié)實驗原理部分課件

1第二章:蛋白質的電泳分離技術蛋白組學課程之第一節(jié)實驗原理部分23GenomeDNAWhatcouldhappen

TranscriptomemRNAWhatmightbehappening

ProteomeProteinWhatisactuallyhappening分子生物學的大規(guī)模篩選技術，目的在于歸類細胞中的蛋白質的整體分布，鑒定并分析感興趣的個別蛋白，最終闡明它們的關系與功能。蛋白質組學4圖像分析圖像獲取蛋白質斑點切取基于凝膠的工作流程SDS蛋白分離及鑒定的工作流程樣品制備等電聚焦MALDI點靶MS鑒定52.1蛋白樣品的提取2.2雙向凝膠電泳技術的原理2.3等電聚焦的原理2.4SDS的原理2.5樣品分離的策略2.雙向凝膠電泳技術62.1蛋白樣品的提?。ㄖ参铮㏕CA丙酮的方法酚結合乙酸銨的方法78樣品的制備原則應使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），且制備方法應具有可重現(xiàn)性。防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學修飾（如酶性或化學性降解等）。完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。盡量去除起干擾作用的高豐度或無關蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測性。9高鹽沉淀如，硫酸銨沉淀法。一般過程：在含有EDTA的緩沖液中（>50mM）處理蛋白質，最終蛋白濃度大于1mg/ml。慢慢地將硫酸銨加至需要的百分飽度，攪拌10-30min，離心收集蛋白質。

缺點：不能獲得所有蛋白質。殘留的硫酸銨會影響等電聚焦。有機溶劑沉淀如，TCA、丙酮、TCA和丙酮的混合物一般過程：樣品懸浮于含0.07%2-巰基乙醇的10%TCA溶液中。-20℃沉淀蛋白質至少45min，離心收集蛋白沉淀，用含有0.07%巰基乙醇的預冷丙酮溶液清洗。冷凍干燥除去殘留的丙酮。缺點：蛋白質很難再溶。長時間暴露于低pH值溶液中蛋白質會被降解和修飾。高鹽與有機溶劑結合（適合處理含有大量干擾物質的植物樣品）如，乙酸銨的甲醇溶液沉淀蛋白質并且用飽和酚抽提

一般過程：樣品中的蛋白被抽提進入酚中，酚相用含有0.1M的乙酸銨的甲醇溶液沉淀蛋白質，沉淀用含有乙酸銨的甲醇溶液清洗后用丙酮清洗，最后將殘留的丙酮蒸發(fā)掉。缺點：復雜且費時。蛋白沉淀方法10變性劑：通過改變溶液中的氫鍵結構使蛋白質充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。表面活性劑：經過變性劑處理而暴露蛋白質的疏水基團后，還常需至少一種表面活性劑來溶解疏水基團。常用的表面活性劑有離子去污劑SDS、非離子去污劑TritonX-100和NP-40、兩性離子去污劑CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。還原劑：在變性劑和表面活性劑聯(lián)用條件下，加用還原劑可使已變性的蛋白質展開更完全，溶解更徹底。常用含自由巰基的DTT或-巰基乙醇，以及不帶電荷的三丁基膦（TBP）進行還原。增加樣品溶解性的手段11蛋白質定量（Bradford方法）考馬斯亮藍G-250在不同的酸堿條件下，可呈現(xiàn)不同的顏色。在一定濃度的乙醇及酸性條件下，可配成茶色溶液，當與蛋白質結合后，產生藍色化合物，反應迅速而穩(wěn)定。反應化合物在465～595nm處有最大的光吸收值，化合物顏色的深淺與蛋白濃度的高低成正比關系，因此可檢測595nm的光吸收值的大小計算蛋白的含量。12第一向:

根據(jù)蛋白質的等電點分離第二向:

SDS聚丙烯酰胺電泳根據(jù)蛋白質的分子量分離一塊雙向電泳膠上可以分離幾千個蛋白點2.2雙向凝膠電泳的原理13等電聚焦技術是根據(jù)蛋白質的等電點（pI）的不同而將他們分離的一種電泳技術。蛋白質分子的帶電量取決于組成蛋白質的氨基酸的側鏈及氨基端和羧基端所有電荷總合。圖1蛋白質所在pH環(huán)境與帶電的關系2.3等電聚焦電泳142.3.1等電聚焦電泳圖2蛋白質的凈電荷與相對環(huán)境pH值關系的曲線圖15丙烯酰胺緩沖液:Immobilinebuffer,化學上確定的丙烯酰胺衍生物,共同結構:CH2=CH-CO-NH-R,R：弱酸性或弱堿性緩沖基團2.3.2固相pH梯度（ImmobilizedpHgradients,IPG）兩種形式：一種是含丙稀酰胺緩沖液的相對酸性的混合物，另一種含相對堿性緩沖液的混合物。不同濃度配比的酸性和堿性緩沖液決定pH梯度的范圍。16采用ImmobilineDryStrip凝膠進行第一向電泳分離。2.3.3ImmobilineDryStrip凝膠172.3.3ImmobilineDryStrip凝膠18linear(L)nonlinear(NL)2.3.3ImmobilineDryStrip凝膠19fromProf.AngelikaG?rg,TechnicalUniversityMunich小鼠肝臟蛋白的分離：IPG3-10linear(L)nonlinear(NL)標準型單根膠條槽采用氧化鋁陶瓷質地的膠條槽、可以保證充分的散熱和電場分離效果；膠條槽平整度好，長期使用不會變形，確保膠條泡漲厚度均勻。Manifold多功能膠條盤

適合高通量7-24cm任意長度的IPG膠條的等電聚焦和后續(xù)的平衡反應；膠條槽表面有疏水涂層，有效防止蛋白黏附到膠條槽內壁上，避免樣品交叉污染。2.3.4膠條槽的選擇21IPG膠條的溶漲溶漲的實質：是讓樣品能完全以可溶性的形式進入IPG內，從而能進行接下來的IEF。蛋白質的上樣量待分析的蛋白點的量應滿足隨后的質譜分析。電泳的目的：如果只是得到一張好的圖片，則無需考慮太多其它因素。待研究蛋白的豐度：防止高豐度蛋白遮蓋低豐度蛋白。樣品的復雜度：復雜度較高的樣品，為了盡可能的了解所包含的每種蛋白，需要反復實驗才能完成。如果將待檢樣品被富集以后則更易分析。一向等電聚焦22IPG中pH梯度的選擇常用方法：先寬后窄，先線性后非線性，先短后長，預試驗確定。聚焦時間的優(yōu)化理論上講，要獲得最好的圖譜質量和重復性所需最佳時間是IEF分離達到穩(wěn)定態(tài)所需的時間。聚焦時間太短，會導致水平和垂直條紋的出現(xiàn)。過度聚焦雖然不會導致蛋白質向陰極漂移，但會因為活性水轉運而導致過多水在IPG膠表面滲出（電滲）而造成蛋白圖譜變性，在膠條堿性端產生水平條紋以及蛋白丟失。最佳時間的確定需要根據(jù)不同蛋白樣品、上樣量、pH范圍和膠條長度通過經驗來確定。一向等電聚焦232.3.5EttanIPGphor3第一向等電聚焦系統(tǒng)內置電源

電壓：0-10000V,電流：0-2.4

mA,功率：最大12W同時運行1－12根IPG膠條242.3.6IPG膠條的平衡在IPG膠條等電聚焦之后，需要進行IPG膠條的平衡，使蛋白質被SDS充分飽和。試劑目的IPG膠條平衡SDSDTT碘乙酰胺與蛋白質結合破壞二硫鍵除去多余的DTT，烷基化巰基基團第一步，15min，緩沖液中含DTT第二步，15min，緩沖液中含碘乙酰胺（不含DTT）25Tris-HCl（pH8.8）→使IPG膠條pH值維持在適合電泳的范圍內。尿素（6M）→增加緩沖溶液的粘滯性來減小電內滲效應。電內滲是由于電場中在IPG膠條上存在固定電荷，干擾蛋白質從IPG膠條向第二向凝膠移動。甘油（30%）→與尿素一同減少電內滲并且促進蛋白質由IPG膠條向第二向凝膠移動。DTT→使變性的非烷基化的蛋白質處于還原狀態(tài)。SDS→使蛋白質變性并且形成帶負電的蛋白質-SDS復合物。與蛋白質結合的SDS數(shù)量以及由此而產生額外的負電荷直接與蛋白質的質量成比例。因此，蛋白質電泳將蛋白質通過含有SDS的膠篩，依靠蛋白質的分子量將蛋白分離。碘乙酰胺→在電泳過程中蛋白的氧化會產生拖尾。碘乙酰胺能使蛋白質巰基烷基化，防止它們在電泳過程中重新氧化。并能使殘留的DTT烷基化，從而防止產生點拖尾和其它銀染雜質。利用碘乙酰胺進行平衡也可以減少不希望的半胱胺酸殘留物的反應（當采用質譜來研究分離的蛋白時）。溴酚藍→示蹤染料，用來指示電泳。平衡緩沖液成分作用262.4SDS

瓊脂糖覆蓋密封放置IPGstrip272.4SDS的原理

SDS是一種陰離子表面活性劑，當它與蛋白質結合時，所帶的負電荷的量大大超過了蛋白質分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同種類蛋白質間原有的電荷差異。

SDS與蛋白質結合后，能斷裂分子內和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質分子的二級和三級結構。在樣品和凝膠中加入SDS和還原劑后，如β巰基乙醇和二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂。這樣，蛋白質SDS復合物在水溶液中的形狀，近似于長橢圓棒。不同蛋白質的SDS復合物的短軸長度都一樣，而長軸則隨蛋白質相對分子質量的大小成正比的變化。蛋白質-SDS復合物在凝膠中遷移率，不再受蛋白質原有電荷和形狀的影響，而只與蛋白質相對分子質量的相關。28聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠的主要參數(shù)T=(Acr的質量＋Bis的質量)/溶劑的終體積C=Bis的質量/(Acr的質量＋Bis的質量)聚丙烯酰胺凝膠的有效孔徑隨總濃度T％的增加而減小，隨交聯(lián)度C％的增加而減小。PAGE實驗原理29連續(xù)電泳系統(tǒng)與不連續(xù)電泳系統(tǒng)連續(xù)電泳系統(tǒng)中僅有分離膠，緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷及分子篩效應不連續(xù)電泳系統(tǒng)中有分離膠和濃縮膠，由于緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中流動不僅有電荷效應、分子篩效應、還具有濃縮效應，因而其分離條帶清晰度和分辨率均較前者佳。PAGE實驗原理30EttanDALTsix第二向電泳系統(tǒng)31EttanDALTtwelve

第二向電泳系統(tǒng)32放射自顯影、熒光成像－低到200fg蛋白銀染－低于1ng蛋白。銀染方法比較復雜，步驟較多，使用試劑也較多，而且試劑純度非常重要。最好采用專用的試劑盒。 在敏化步驟中不加戊二醛，以及在硝酸銀溶液中不加甲醛，雖然靈敏度有所降低，但更能與質譜分析兼容?？捡R斯亮藍－染色靈敏度比銀染低50到100倍方法簡單，比銀染定量準確?？捡R斯亮藍與蛋白質按化學計量結合，當有關的蛋白質要用密度計來測量時，這種方法比較適合。Hoefer自動化凝膠染色儀－低于1ng的蛋白檢測能自動完成多步的染色過程，操作非常簡單并能增加染色的重復性。鋅-咪唑負染法－檢測限是15ng與質譜兼容性很好，但定量不準確。SYPRO?染料的熒光標記和熒光染色－靈敏度介于膠體考馬斯亮藍和改良的銀染試劑盒之間需要熒光掃描儀，但是方法與質譜兼容很好，定量動力學范圍寬。凝膠染色33問題1:對于一個新的組織樣品，該如何進行IPG膠條選擇？問題2:對于低豐度的蛋白，該如何進行樣品分離？2.5樣品分離的策略34問題1:對于一個新的組織樣品，該如何進行IPG膠條選擇？

蛋白質主要分布在兩個區(qū)域，一部分為pI為4-6.5的蛋白質，另一部分為pI在8-12的蛋白質。大多數(shù)蛋白質的分子質量小于100kDa。采用寬范圍的IPG膠條進行分離，然后進一步用較窄的IPG膠條進行分離。pI311A舉例：羽衣甘藍柱頭組織蛋白質的二向電泳分離pI4B735pH3-11NLpH3-5.6NL

pH5.3-6.5pH7-11NLpH6.2-7.5舉例:小鼠肝臟蛋白的電泳分離36問題2:對于低豐度的蛋白，該如何進行樣品分離？舉例：在血清中，白蛋白占蛋白質總量的60%，免疫球蛋白占總蛋白質總量的15%，白蛋白的大斑點使得2-DE不能夠展示出其他蛋白質，同樣，在MS分析中，高濃度的白蛋白肽段也會掩飾其他肽段，使之無法得到檢測。去除高豐度的蛋白，如白蛋白和免疫球蛋白。（白蛋白可以通過免疫吸附去除，免疫球蛋白可以通過固定化的金黃色葡萄球菌蛋白A去除）去除高豐度蛋白后，可以上樣更多感興趣的蛋白，從而檢測到之前無法檢測的蛋白質（低豐度）。37

參考書：

蛋白質分析實驗技術指南，李玉花等編著，高等教育出版社，2010.蛋白質電泳實驗技術（第二版），郭堯君編著,科學出版社，2005.Guidetoproteinpurification(SecondEdition),RichardR.Burgess,科學出版社，2011.蛋白質組學中的蛋白質純化手冊，茹炳根主譯，化學工業(yè)出版社，2008.蛋白質組學研究-概念、技術及應用，張麗華等譯（原書第二版），科學出版社，2010.38實驗篇39實驗儀器－電泳設備IPGphorTMisoelectricfocusingsystemHoeferSE600(standardvertical)EPS601PowerSupply40IPG膠的材料是Immobilines，為擁有CH2=CH-CO-NH-R結構的8種丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基團，它們構成了分布在pH3~10不同值的緩沖體系。實驗儀器－膠條槽、干膠條41實驗儀器-其它設備紫外分光光度計離心機脫色搖床42蛋白質一向電泳試劑提取液：含10%TCA和0.07%的β-巰基乙醇的丙酮裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml滅菌的去離子水中（終體積為5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。平衡緩沖液：1.5MTris-Cl6.7ml(pH8.8)，尿素72.07g，87％的甘油69ml，SDS4g，溴酚藍少許。溶漲液：尿素12g，CHAPS0.5g，溴酚藍少許溶于無菌水中，總體積為25ml。使用之前再加入IPG緩沖液0.5ul/100ul，DTT1.5ul/100ul。實驗試劑43蛋白質二向電泳試劑

丙烯酰胺單體儲液：丙烯酰胺60g，甲叉雙丙烯酰胺1.6g，溶于無菌水中，總體積200ml

分離膠緩沖液：Trisbase181.5g，溶于750ml無菌水中，調PH8.8，總體積1000ml10％SDS：5gSDS溶于無菌水中，總體積50ml10％過硫酸銨：0.1g溶于無菌水中，總體積1mlSDS電泳緩沖液：Tris-base15.1g，甘氨酸72.1g，SDS5g，溶于無菌水中，總體積5000ml

封膠溶液：SDS電泳緩沖液100ml，瓊脂糖0.5g，溴酚藍少許實驗試劑44蛋白質定量（Bradford方法）試劑

Bradford儲存液：100ml95％乙醇；200ml88％磷酸；350mgServaG藍，室溫下長期保持穩(wěn)定。

Bradford工作液：425ml雙蒸水；15ml95％乙醇；30ml88％磷酸；30mlBradford儲存液濾紙過濾，棕色瓶中室溫保存，可保存數(shù)周，但在使用前需要過濾。

1mg/ml牛血清蛋白（BSA）實驗試劑45蛋白質樣品制備蛋白質定量（Bradford法）蛋白質分離獲得感興趣蛋白質組分雙向電泳實驗流程樣品的制備一向等電聚焦一向等電聚焦到二向電泳的平衡SDS電泳凝膠的染色凝膠的圖像處理分析46（1）取植物材料放入預冷研缽后，加入液氮，充分研磨至粉末狀。（2）于1.5mL離心管中加入3倍體積的提取緩沖液，將粉末加入到離心管中，混勻后在-20℃的條件下過夜。（3）4℃，40000g，離心1hr，棄上清。(4）使沉淀重懸浮于等體積的預冷丙酮（含0.07%的β-巰基乙醇）中，4℃，40000g，離心1hr（可重復一次）。（5）真空干燥沉淀。（6）將沉淀用最小體積的裂解液充分溶解，其間可漩渦振蕩助溶。（7）15℃，40000g，離心1hr，上清即為獲得的蛋白質樣品，可分裝放入-80℃?zhèn)溆茫R時保存可在4℃。（8）Brandford法蛋白定量。實驗步驟－蛋白質樣品制備471．上樣：一般采取加樣品溶漲法，取大約30-60μg的蛋白與溶脹液混合，總體積為250μL。蛋白與溶脹液混合物加入膠條槽從酸性端去掉膠條的保護膜放置膠條：膠條酸性端（尖端）朝膠條槽陽極（尖端）方向放入膠條槽，慢慢下壓，最后放下膠條堿性端（平端），使溶液浸濕整個膠條，避免生成氣泡。在膠條上覆蓋適量的覆蓋油，蓋上蓋子。將膠條槽平放于IPGphor儀器上，與水平方向垂直，如是多個膠條槽注意相互平行實驗步驟－一向等電聚焦482．第一向等電聚焦設置IPGphor儀器的運行參數(shù)。工作溫度20℃，每膠條最大電流50μA，以下為電壓設定情況：電壓（V）升壓模式電泳時間30Step-n-hold12hr200Step-n-hold1hr500Step-n-hold1hr1000Step-n-hold1hr8000Gradient3hr3．一向到二向膠條的平衡將膠條放入10mL平衡緩沖液Ⅰ中（含1%DTT）封口，在搖床上振蕩15min。將膠條取出放入10mL平衡緩沖液Ⅱ中（含2.5%碘乙酰胺）封口，在搖床上振蕩15min。去離子水潤洗膠條一秒鐘，將膠條的邊緣置于濾紙上幾min，以去除多余的液體。實驗步驟一向等電聚焦4950514．二向電泳（SDS）（1）灌膠模具的安裝：按儀器說明書裝好灌膠模具。（2）凝膠濃度確定：根據(jù)預分離蛋白質分子量范圍確定需配置的凝膠濃度，主要指分離膠濃度（表4-3-1）。一般實驗中多采用濃度10％或12.5%的分離膠及濃度為5％的濃縮膠，制膠參照下表。表分離膠和濃縮膠的配制藥品濃度10％12.5%5％單體儲液13.3mL16.7mL1.064mL分離膠緩沖液10mL10mL－濃縮膠緩沖液－－2mL10×SDS0.4mL0.4mL0.4mL無菌水16.1mL12.8mL4.8mL10％過硫酸銨200μL200μL80μLTEMED13.3μL13.3μL40μL實驗步驟－二向SDS5253（3）灌注分離膠：按配比配制分離膠，配制完成后即可加入到制作好的制膠模具中，該過程需均勻注入，防止產生氣泡，同時動作要迅速。灌注一定量的分離膠后迅速注入水覆蓋在凝膠溶液上層，將“三明治”充滿。（4）分離膠凝結后會形成清晰的膠平面，此時可參照濃縮膠配方配制濃縮膠。（5）灌注濃縮膠：倒掉覆蓋液，注入濃縮膠。（6）放入平衡好的膠條，并用瓊脂糖封頂。實驗步驟－二向SDS54（7）將固定制膠模具與底座的凸輪取下，用其將上層電