牙本質(zhì)特異性蛋白與生物礦化課件

生物礦化

Biomineralization機(jī)體礦化組織在生物調(diào)控下由特殊細(xì)胞分泌有機(jī)基質(zhì)，基質(zhì)中蛋白質(zhì)誘導(dǎo)鈣、磷離子在基質(zhì)上并按特定空間結(jié)構(gòu)和時(shí)間順序形成晶體并生長，這個(gè)過程稱“生物礦化”。生物調(diào)控——基因調(diào)控、細(xì)胞因子介導(dǎo)生物礦化

Biomineraliz1牙齒硬組織、骨生物礦化發(fā)育規(guī)律發(fā)育缺陷修復(fù)機(jī)制牙齒再生活髓保存牙周組織損傷修復(fù)牙齒硬組織、骨發(fā)育規(guī)律發(fā)育缺陷修復(fù)機(jī)制牙齒再生活髓保存2牙本質(zhì)有機(jī)物蛋白質(zhì)蛋白多糖、脂類、枸櫞酸鹽等膠原—-I型為主（少量ⅢⅤⅠ型三聚體）Collagen……86%非膠原蛋白…………..10%（noncollagenousproteinsNCPs)牙本質(zhì)有機(jī)物蛋白質(zhì)蛋白多糖、脂類、枸櫞酸鹽等膠原—-I型3牙本質(zhì)非膠原蛋白NCPs牙本質(zhì)特異性蛋白礦化組織特異性蛋白多組織非特異性蛋白血清來源蛋白牙本質(zhì)磷蛋白（DPP）牙本質(zhì)涎蛋白（DSP）牙本質(zhì)涎磷蛋白（DSPP）牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白（DMP1）骨鈣素（OC）骨涎蛋白（BSP）骨橋素（OPN）纖維粘連蛋白（FN）糖蛋白（FG）IgG、白蛋白牙本質(zhì)非膠原蛋白NCPs牙本質(zhì)特異性蛋白礦化組織特異性蛋白多4牙本質(zhì)特異性蛋白與生物礦化課件5DPP的發(fā)現(xiàn)和定義Veis和Penny(1967)發(fā)現(xiàn)高度磷酸化的含絲氨酸（Ser)，天門冬氨酸（Asp)的酸性蛋白。占非膠原蛋白的50%。牙本質(zhì)磷蛋白

DentinPhosphoprotein,DPP

DentinPhosphophoryn,DPPDPP的發(fā)現(xiàn)和定義牙本質(zhì)磷蛋6

DPP的合成、分泌和分布Veinstock等用3H、33P標(biāo)記絲氨酸，磷酸根（小鼠）

Munksguard等在牙髓細(xì)胞的培養(yǎng)加入3H—絲氨酸、33P—磷酸根

Rabie等用膠體金抗體標(biāo)記前成釉細(xì)胞成牙本質(zhì)細(xì)胞礦化前沿前期牙本質(zhì)合成高爾基體運(yùn)輸膠原DPP分泌小泡內(nèi)質(zhì)網(wǎng)DPP的合成、分泌和分布前成釉細(xì)胞礦化前沿前期牙本質(zhì)合成7DPP提取DPP的生物學(xué)特性（1）親水性、強(qiáng)酸性、等電點(diǎn)1.1（2）含磷量高：5.9%（3）分子量：范圍大，種屬間有差異大鼠30-100KD，小鼠72KD牛35-158KD，人140KD左右DPP提取8（4）氨基酸組成人、牛、鼠的氨基酸組成（4）氨基酸組成人、牛、鼠的氨基酸組成9（5）氨基酸序列及分子結(jié)構(gòu)1996年Crossley等在IADR上報(bào)告，牛DPP氨基酸序列：Asp-Pse-Pro-Asn-Pse-Pse[Asp-(Pse)n]x,n=1-3,X為未知數(shù)最近George(1998)報(bào)告大鼠切牙DPPC末端有（DSS)n、(SD)m重復(fù)結(jié)構(gòu)，磷酸化有結(jié)合Ca2+能力，n≥3與Ca2+結(jié)合能力強(qiáng)

（5）氨基酸序列及分子結(jié)構(gòu)10目前已了解大鼠、小鼠、牛、人的氨基末端序列和功能片段。1998年Gu等用RT-PCR技術(shù)克隆了人DPPcDNA，經(jīng)分析與人牙根分離出的DPPN端序列相符。MacDougall等從小鼠牙本質(zhì)DNA克隆獲得DPP-DSP復(fù)合物。目前已了解大鼠、小鼠、牛、人的氨基末端序列和功能片段。11DPP的功能（1）DPP誘導(dǎo)和促進(jìn)生物礦化的作用DPP與Ca2+有強(qiáng)的結(jié)合能力具有與Ca2+結(jié)合的高親和力位點(diǎn)(Ser磷酸化）結(jié)合Ca2+的能力：一個(gè)PO43-結(jié)合1.5個(gè)Ca2+127和176molCa2+/molDPP結(jié)合Ca2+能力與DPP結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有關(guān)（George1998)(DSS)n和（SD）m磷酸根、羧酸根位置。牙本質(zhì)特異性蛋白與生物礦化課件12

DPP誘導(dǎo)調(diào)節(jié)HAP晶體形成DPP與膠原結(jié)合，改變立體化學(xué)結(jié)構(gòu)，HAP晶體成核作用。Lussi(1998)Hunter(1996)證明DPP結(jié)合到HAP晶體的特殊平面，調(diào)節(jié)晶體大小DPP對膠原的作用

DPP對牙本質(zhì)礦化作用DPP分布礦化前沿DPP種植誘導(dǎo)牙本質(zhì)形成Lussi和Linda(1993),VandenBos(1994)DPP誘導(dǎo)調(diào)節(jié)HAP晶體形成13(2)DPP抑制生物礦化作用Lussi等研究：DPP濃度>40ug/ml抑制HAP晶體形成，DPP濃度>160ug/ml晶體形成完全被抑制。Clarkson等：可溶性DPP有一定的抑制牙本質(zhì)再礦化作用。(2)DPP抑制生物礦化作用14人DPP提取人DPP生物學(xué)特性人DPP生物學(xué)作用人牙本質(zhì)磷蛋白的研究——北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目人DPP提取人牙本質(zhì)磷蛋白的研究——北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)15人DPP分離純化

-70℃,15%NaCL健康離體牙刮除軟組織粉碎

蛋白抑制劑(PI)（約50目）

2.56MNaCL+PI

SDS處理

清洗備用

4℃牙本質(zhì)粉沫的制備人DPP分離純化牙本質(zhì)粉沫的制備16

脫礦

2000ml0.6NHCl3周2天換一次

牙本質(zhì)粉+0.6NHCl(約1ml/g)濃縮離心取上清測鈣濃度至微量粗提DPP

裝入透析袋脫礦——粗提牙本質(zhì)粉濃縮離心取測鈣濃度至微量粗提DPP裝入17DEAE-SepharoseCL6B

離子交換層析粗提DPP

層析

4℃0～0.7MNaCl梯度洗脫

紫外檢測儀，230nm，檢測蛋白等離子發(fā)射光譜檢測磷含量純化DPP

樣品

分離純化DEAE-SepharoseC18

蛋白含量分析磷含量分析分子量測定氨基酸組成分析DPP的特性分析蛋白含量分析DPP的特性分析19蛋白含量分析圖1.DPP洗脫曲線圖蛋白含量分析圖1.DPP洗脫曲線圖20磷含量分析圖2.DPP磷含量曲線(ppm)磷含量分析圖2.DPP磷含量曲線(ppm)21

把蛋白質(zhì)吸光曲線和磷含量曲線繪于同一坐標(biāo)內(nèi)，可以得到如下曲線圖圖3.DPP蛋白含量與磷含量曲線分析圖252015105磷含量(ppm)把蛋白質(zhì)吸光曲線和磷含量曲線繪于同一坐標(biāo)內(nèi)，可以得22

DPP分子量測定141kD124kD108kDSDS電泳圖譜HCL脫礦：141KD、124KD、108KDDPP分子量測定141kD124kD108kDSDS電泳圖23

DPP氨基酸分析Met 8.1Ile 25.6Leu 25.8Tyr 8.9Phe 8.6Lys 36.4His 9.8Arg 26.9注：均為每1000個(gè)氨基酸殘基中的值氨基酸 AA數(shù)目Asp 238.1Thr 30.2Ser 191.5Glu 174.4Pro 41.2Gly 103.0Ala 36.9Val 34.6所提DPP樣品的氨基酸分析結(jié)果如下表：DPP氨基酸分析Met 8.1氨基酸 AA數(shù)目所提DPP樣24本研究結(jié)果與國外學(xué)者基本一致，說明富含天門冬氨酸、絲氨酸的人DPP，含磷量高，具有與鈣結(jié)合，誘導(dǎo)生物礦化的分子基礎(chǔ)。本研究結(jié)果與國外學(xué)者基本一致，說明富含天門冬氨酸、絲25DPPBSA空白EAH-Sepharose4B礦化液37℃48h[Ca2+]/[PO43-]=1.67DPP在體外誘導(dǎo)生物礦化作用DPPBSA空白EAH-Sepharose4B礦化液[Ca26BSADPP對照BSADPP對照27X衍射分析結(jié)果說明磷酸鈣HAPCa5(PO4)3OHCa3(PO4)2CaHPO4Ca8H2(PO4)6·5H2OX衍射分析結(jié)果說明磷酸鈣Ca5(PO4)3OH28鈣磷含量的測定

測定各150mg凝膠顆粒的表面Ca、P沉積量結(jié)論：人DPP與一定的支持物結(jié)合可啟動HAP成核誘導(dǎo)礦化。鈣磷含量的測定

測定各150mg凝膠顆粒的表面Ca、P沉積量29實(shí)驗(yàn)動物：小型豬一周齡14-20Kg，選實(shí)驗(yàn)牙—第一恒磨牙20顆，下頜切牙10顆,牙隨機(jī)分組，DPP蓋髓，觀察2周、1月、3月結(jié)果：處死動物，實(shí)驗(yàn)牙切片HE染色結(jié)論：DPP對牙髓損傷的修復(fù)過程比氫氧化鈣更快誘導(dǎo)修復(fù)性牙本質(zhì)形成。DPP對培養(yǎng)的人牙髓細(xì)胞的作用DPP促進(jìn)生物礦化的動物實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)動物：小型豬一周齡14-20Kg，選實(shí)驗(yàn)牙—第一恒磨30人牙本質(zhì)磷蛋白促進(jìn)牙髓創(chuàng)傷修復(fù)人牙本質(zhì)磷蛋白促進(jìn)牙髓創(chuàng)傷修復(fù)31人牙本質(zhì)粉制備乙酸脫礦上清液A上清液B離子交換層析可溶性DPP再礦化實(shí)驗(yàn)特性檢測測定P含量蛋白含量1MNaCL處理牙本質(zhì)磷蛋白對再礦化的抑制作用人牙本質(zhì)粉制備乙酸脫礦上清液A上清液B離子交換層析可溶性DP32結(jié)果上清液A、B中的總蛋白濃度結(jié)果上清液A、B中的總蛋白濃度33證明：1MNaCL提取可溶性DPP證明：1MNaCL提取可溶性DPP34再礦化實(shí)驗(yàn)牙根磨片實(shí)驗(yàn)組對照組再礦化液處理1MNaCL處理脫礦鈣離子測定SEM觀察MRG照片吸光度測定再礦化實(shí)驗(yàn)牙根磨片實(shí)驗(yàn)組對照組再礦化液處理1MNaCL處理35再礦化液中鈣含量測定T檢驗(yàn)P<0.01再礦化液中鈣含量測定T檢驗(yàn)P<0.0136掃描電鏡觀察實(shí)驗(yàn)組對照組掃描電鏡觀察實(shí)驗(yàn)組對照組37顯微放射照片的平均吸光度檢驗(yàn)

DPP抑制生物礦化的可能機(jī)制可溶性（游離性）DPP的作用顯微放射照片的平均吸光度檢驗(yàn)DPP抑制生物礦化的可能機(jī)制38目的：利用分子生物學(xué)技術(shù)克隆和表達(dá)包含功能區(qū)的人DPP片段，以便通過人DPP功能片段研究促進(jìn)牙齒生物礦化（發(fā)育和修復(fù)功能）作用的研究。人牙本質(zhì)磷蛋白基因片段的克隆和表達(dá)目的：人牙本質(zhì)磷蛋白基因片段的克隆和表達(dá)39人DPP基因全序列的亞克隆及其5’端序列的克隆分析通過酶切分析和DNA序列測定，證實(shí)DPP重組質(zhì)粒（pBlueBacHis2-DPP)帶有人DPP基因。通過基因亞克隆建立了帶有人DPP基因的穩(wěn)定克隆株。采用分子克隆技術(shù)構(gòu)建了含人DPP基因5’端序列的重組質(zhì)粒pT-DPP-N并進(jìn)行測序。pT-DPP-N質(zhì)粒（含DPPcDNA5’端序列）生化特性：168個(gè)氨基酸，富含天門冬氨酸和絲氨酸，含RGD序列和DSS重復(fù)序列，PI為3.115，分子量為16869.1D。人DPP基因全序列的亞克隆及其5’端序列的克隆分析4021564bp2027bp

pBluBacHis2-DPP的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（人DPP基因5’端序列）Lane1：λDNA/HindIIILane2:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物21564bp2027bppBluBac41504bpBamHⅠEcoRI504bpBamHⅠEcoRI42Ala(A):31.77Asx(B):00Cys(C):00Asp(D):4526.62Glu(E):42.38Phe(F):00Gly(G):105.91His(H):00Ile(I):00Lys(K):74.14Leu(L):00Met(M):00Asn(N):2011.83Pro(P):1.59Gln(Q):00Arg(R):1.59Ser(S):7443.78

Thr(T):21.18Val(V):00Trp(W):00Unk(X):00Tyr(Y):1.59Glx(Z):00Total:168100人DPP蛋白N端氨基酸組成人DPP蛋白Asp(D):26%Ser(S):58%Ala(A):31.77A43人DPP5’端序列的表達(dá)和純化構(gòu)建帶有人DPP基因5’端序列GST融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒（p5X-1-hDPP-N)，并在原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)純化。504bpBamHⅠEcoRILane1:DL2000Lane2:p5X-HDPP-N酶切電泳21100bp250bp500bp750bp1500bp2000bp人DPP5’端序列的表達(dá)和純化504bpBamHⅠEcoRI44構(gòu)建帶有人DPP基因5’端序列的桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒（pFASTBAC-hDPP-N)，并在真核（sf9細(xì)胞）中表達(dá)了人DPP基因5’端序列片段。

Lane1:超聲后的沉淀

Lane2:超聲后的上清

Lane3:中分子量Marker12396KDa66KDa43KDa

Lane1:蛋白復(fù)性時(shí)的析出沉淀

Lane2:GST-BSAMarkerLane3:蛋白純化帶12366KD26KD構(gòu)建帶有人DPP基因5’端序列的桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒（pFAST45504bp504bp真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建BamHⅠEcoRIBamHⅠEcoRI504bp504bp真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建BamHⅠEcoRIB46A上：正常sf9細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)A下：正常sf9細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)B上：病毒感染細(xì)胞24小時(shí)B下：病毒感染細(xì)胞48小時(shí)

AB

1:2代毒細(xì)胞總蛋白2：3代毒細(xì)胞總蛋白1220kD31kD14KDA上：正常sf9細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)A47Vies等（1994）篩選鼠切牙成牙本質(zhì)細(xì)胞和牙本質(zhì)cDNA文庫時(shí)發(fā)現(xiàn)一種與BSP的氨基酸組成相似的新蛋白稱DSP。鼠DSP占牙本質(zhì)非膠原蛋白的5%~8%，含糖30%，其中10%為涎酸。DSP主要氨基酸是天門冬、絲、甘、谷氨酸，有13個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，6個(gè)N-糖基化的位點(diǎn)。鼠DSP基因編碼383個(gè)氨基酸（17-信號肽，366—分泌DSP）

牙本質(zhì)涎蛋白

DentinSialoproteinDSPVies等（1994）篩選鼠切牙成牙本質(zhì)細(xì)胞和牙本質(zhì)cDNA48DSP生物學(xué)作用可能參與牙本質(zhì)生物礦化的啟動晶體形成。并促進(jìn)HAP晶體生長?？赡軈⑴c牙胚發(fā)育期上皮與間葉組織之間信號傳遞，互相調(diào)控。DSP生物學(xué)作用49MacDougall等（1997）發(fā)現(xiàn)：小鼠牙的DPP與DSP是一條目的基因編碼的蛋白質(zhì)。DSPPcDNA中信號肽及N端序列有75%與DSP一致，C端的489個(gè)氨基酸編碼與DPP一致。DSPP為酸性蛋白（PI=4.0），富含天門冬氨基酸（18.9%），絲氨酸（36.3%）DSPP基因位于人類染色體4q21~23.牙本質(zhì)涎磷蛋白

DentinSialophosphoprotein,DSPPMacDougall等（1997）發(fā)現(xiàn)：小鼠牙的DPP與DS50DSPP與DPP、DSP的關(guān)系信號肽——DSP-----------DPP基因堿基順序1-135136-12461439-2905氨基酸順序1-1718-387452-940（17）（370）（489）Gu.K等（2000）克隆了人DSPP基因，證實(shí)與小鼠有同源性。cDNA=4420kb,940個(gè)氨基酸。1-4外顯子編碼DSP5外顯子編碼DSP的C端和DPP全長。連接區(qū)MPLPDSPP與DPP、DSP的關(guān)系信號肽——DSP---51DSPP的生物學(xué)作用與牙齒發(fā)育中，上皮—間葉細(xì)胞的相互調(diào)控作用有關(guān)。促進(jìn)生物礦化及牙髓創(chuàng)傷的修復(fù)DSPP基因突變，影響DSPP基因功能，導(dǎo)致牙本質(zhì)發(fā)育不全（DGI-II）DSPP的生物學(xué)作用與牙齒發(fā)育中，上皮—間葉細(xì)胞的相互調(diào)52——牙本質(zhì)發(fā)育不全I(xiàn)I型（dentinogenesisimperfectaDGI-IIshieldstypeII)發(fā)病可能原因：DSPP基因外顯子2或3的DSP區(qū)出現(xiàn)突變點(diǎn)，核苷酸易位，導(dǎo)致跨膜氨基酸改變。部分DSP和DPP全部表達(dá)缺失礦化障礙。定位4q21.DSPP與遺傳性乳光牙本質(zhì)

Opalescentdentin——牙本質(zhì)發(fā)育不全I(xiàn)I型（dentinogenesisim53牙本質(zhì)形成和礦化是多因素參與的復(fù)雜過程。牙本質(zhì)特異性蛋白是誘導(dǎo)牙本質(zhì)礦化最重要的蛋白質(zhì)，也是成牙本質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物。目前研究的熱點(diǎn)。

牙本質(zhì)涎磷蛋白在小鼠牙胚發(fā)育中的表達(dá)。牙本質(zhì)涎磷蛋白反義核酸體外培養(yǎng)牙胚礦化的影響。小鼠牙本質(zhì)磷蛋白啟動子報(bào)告基因的構(gòu)建和分析。Cbfal對小鼠牙本質(zhì)涎磷蛋白基因啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的研究。遺傳性乳光牙本質(zhì)致病基因DSPP的突變分析。小結(jié)

牙本質(zhì)形成和礦化是多因素參與的復(fù)雜過程。小54GeorgeA等（1993）首發(fā)現(xiàn)的酸性磷酸蛋。分布：成牙本質(zhì)細(xì)胞，前期牙本質(zhì)，牙本質(zhì)。DMP1分子量61KD，富含絲氨酸、谷氨酸、天門冬氨酸，DMP1氨基酸序列中有RGD序列（精-甘-天門冬——黏附，調(diào)節(jié)細(xì)胞。牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1

DentinMatrixProteinDMP1GeorgeA等（1993）首發(fā)現(xiàn)的酸性磷酸蛋。55DMP1基因—人染色體4q21區(qū)，編碼389個(gè)氨基酸。Hirst(1997)MacDougall等（1997）發(fā)現(xiàn)DMP1分布骨和牙齒中，DMP1是礦化組織特異蛋白，不是牙本質(zhì)特異蛋白。DMP1基因—人染色體4q21區(qū)，編碼389個(gè)氨基酸。Hir56DMP1的生物學(xué)作用：介于BSP與DPP之間，誘導(dǎo)牙本質(zhì)細(xì)胞分化，刺激分泌，促進(jìn)礦化。動物實(shí)驗(yàn)：Smith等（1990、1992）樊明文（1996）與DGI-II型可能無關(guān)（Aplin等）DMP1的生物學(xué)作用：介于BSP與DPP之間，誘導(dǎo)牙本質(zhì)細(xì)胞57骨基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的小分子蛋白質(zhì)，再骨、牙中分布，是礦化組織特異性蛋白。骨鈣素基因—在染色體1上，由125個(gè)氨基酸編碼組成3個(gè)r-羥基谷氨酸殘基—吸附HAP晶體。生物學(xué)作用：調(diào)節(jié)HAP晶體生長速度和方向骨鈣素

Osteocalcin骨基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的小分子蛋白質(zhì)，再骨、牙中分布，是礦化組織特異性58從骨中發(fā)現(xiàn)，分布于骨、成牙本質(zhì)細(xì)胞，牙本質(zhì)小管中。高度糖基化蛋白，富含谷、天門冬氨酸等。氨基酸序列中，有RGD序列，能吸附至成骨，破骨細(xì)胞表面。有多個(gè)氨基酸構(gòu)成區(qū)，能吸附鈣和HAP促進(jìn)礦化晶體的生長。骨涎蛋白

bonesialoprotein,BSP從骨中發(fā)現(xiàn)，分布于骨、成牙本質(zhì)細(xì)胞，牙本質(zhì)小管中。59生物礦化

Biomineralization機(jī)體礦化組織在生物調(diào)控下由特殊細(xì)胞分泌有機(jī)基質(zhì)，基質(zhì)中蛋白質(zhì)誘導(dǎo)鈣、磷離子在基質(zhì)上并按特定空間結(jié)構(gòu)和時(shí)間順序形成晶體并生長，這個(gè)過程稱“生物礦化”。生物調(diào)控——基因調(diào)控、細(xì)胞因子介導(dǎo)生物礦化

Biomineraliz60牙齒硬組織、骨生物礦化發(fā)育規(guī)律發(fā)育缺陷修復(fù)機(jī)制牙齒再生活髓保存牙周組織損傷修復(fù)牙齒硬組織、骨發(fā)育規(guī)律發(fā)育缺陷修復(fù)機(jī)制牙齒再生活髓保存61牙本質(zhì)有機(jī)物蛋白質(zhì)蛋白多糖、脂類、枸櫞酸鹽等膠原—-I型為主（少量ⅢⅤⅠ型三聚體）Collagen……86%非膠原蛋白…………..10%（noncollagenousproteinsNCPs)牙本質(zhì)有機(jī)物蛋白質(zhì)蛋白多糖、脂類、枸櫞酸鹽等膠原—-I型62牙本質(zhì)非膠原蛋白NCPs牙本質(zhì)特異性蛋白礦化組織特異性蛋白多組織非特異性蛋白血清來源蛋白牙本質(zhì)磷蛋白（DPP）牙本質(zhì)涎蛋白（DSP）牙本質(zhì)涎磷蛋白（DSPP）牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白（DMP1）骨鈣素（OC）骨涎蛋白（BSP）骨橋素（OPN）纖維粘連蛋白（FN）糖蛋白（FG）IgG、白蛋白牙本質(zhì)非膠原蛋白NCPs牙本質(zhì)特異性蛋白礦化組織特異性蛋白多63牙本質(zhì)特異性蛋白與生物礦化課件64DPP的發(fā)現(xiàn)和定義Veis和Penny(1967)發(fā)現(xiàn)高度磷酸化的含絲氨酸（Ser)，天門冬氨酸（Asp)的酸性蛋白。占非膠原蛋白的50%。牙本質(zhì)磷蛋白

DentinPhosphoprotein,DPP

DentinPhosphophoryn,DPPDPP的發(fā)現(xiàn)和定義牙本質(zhì)磷蛋65

DPP的合成、分泌和分布Veinstock等用3H、33P標(biāo)記絲氨酸，磷酸根（小鼠）

Munksguard等在牙髓細(xì)胞的培養(yǎng)加入3H—絲氨酸、33P—磷酸根

Rabie等用膠體金抗體標(biāo)記前成釉細(xì)胞成牙本質(zhì)細(xì)胞礦化前沿前期牙本質(zhì)合成高爾基體運(yùn)輸膠原DPP分泌小泡內(nèi)質(zhì)網(wǎng)DPP的合成、分泌和分布前成釉細(xì)胞礦化前沿前期牙本質(zhì)合成66DPP提取DPP的生物學(xué)特性（1）親水性、強(qiáng)酸性、等電點(diǎn)1.1（2）含磷量高：5.9%（3）分子量：范圍大，種屬間有差異大鼠30-100KD，小鼠72KD牛35-158KD，人140KD左右DPP提取67（4）氨基酸組成人、牛、鼠的氨基酸組成（4）氨基酸組成人、牛、鼠的氨基酸組成68（5）氨基酸序列及分子結(jié)構(gòu)1996年Crossley等在IADR上報(bào)告，牛DPP氨基酸序列：Asp-Pse-Pro-Asn-Pse-Pse[Asp-(Pse)n]x,n=1-3,X為未知數(shù)最近George(1998)報(bào)告大鼠切牙DPPC末端有（DSS)n、(SD)m重復(fù)結(jié)構(gòu)，磷酸化有結(jié)合Ca2+能力，n≥3與Ca2+結(jié)合能力強(qiáng)

（5）氨基酸序列及分子結(jié)構(gòu)69目前已了解大鼠、小鼠、牛、人的氨基末端序列和功能片段。1998年Gu等用RT-PCR技術(shù)克隆了人DPPcDNA，經(jīng)分析與人牙根分離出的DPPN端序列相符。MacDougall等從小鼠牙本質(zhì)DNA克隆獲得DPP-DSP復(fù)合物。目前已了解大鼠、小鼠、牛、人的氨基末端序列和功能片段。70DPP的功能（1）DPP誘導(dǎo)和促進(jìn)生物礦化的作用DPP與Ca2+有強(qiáng)的結(jié)合能力具有與Ca2+結(jié)合的高親和力位點(diǎn)(Ser磷酸化）結(jié)合Ca2+的能力：一個(gè)PO43-結(jié)合1.5個(gè)Ca2+127和176molCa2+/molDPP結(jié)合Ca2+能力與DPP結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有關(guān)（George1998)(DSS)n和（SD）m磷酸根、羧酸根位置。牙本質(zhì)特異性蛋白與生物礦化課件71

DPP誘導(dǎo)調(diào)節(jié)HAP晶體形成DPP與膠原結(jié)合，改變立體化學(xué)結(jié)構(gòu)，HAP晶體成核作用。Lussi(1998)Hunter(1996)證明DPP結(jié)合到HAP晶體的特殊平面，調(diào)節(jié)晶體大小DPP對膠原的作用

DPP對牙本質(zhì)礦化作用DPP分布礦化前沿DPP種植誘導(dǎo)牙本質(zhì)形成Lussi和Linda(1993),VandenBos(1994)DPP誘導(dǎo)調(diào)節(jié)HAP晶體形成72(2)DPP抑制生物礦化作用Lussi等研究：DPP濃度>40ug/ml抑制HAP晶體形成，DPP濃度>160ug/ml晶體形成完全被抑制。Clarkson等：可溶性DPP有一定的抑制牙本質(zhì)再礦化作用。(2)DPP抑制生物礦化作用73人DPP提取人DPP生物學(xué)特性人DPP生物學(xué)作用人牙本質(zhì)磷蛋白的研究——北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目人DPP提取人牙本質(zhì)磷蛋白的研究——北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)74人DPP分離純化

-70℃,15%NaCL健康離體牙刮除軟組織粉碎

蛋白抑制劑(PI)（約50目）

2.56MNaCL+PI

SDS處理

清洗備用

4℃牙本質(zhì)粉沫的制備人DPP分離純化牙本質(zhì)粉沫的制備75

脫礦

2000ml0.6NHCl3周2天換一次

牙本質(zhì)粉+0.6NHCl(約1ml/g)濃縮離心取上清測鈣濃度至微量粗提DPP

裝入透析袋脫礦——粗提牙本質(zhì)粉濃縮離心取測鈣濃度至微量粗提DPP裝入76DEAE-SepharoseCL6B

離子交換層析粗提DPP

層析

4℃0～0.7MNaCl梯度洗脫

紫外檢測儀，230nm，檢測蛋白等離子發(fā)射光譜檢測磷含量純化DPP

樣品

分離純化DEAE-SepharoseC77

蛋白含量分析磷含量分析分子量測定氨基酸組成分析DPP的特性分析蛋白含量分析DPP的特性分析78蛋白含量分析圖1.DPP洗脫曲線圖蛋白含量分析圖1.DPP洗脫曲線圖79磷含量分析圖2.DPP磷含量曲線(ppm)磷含量分析圖2.DPP磷含量曲線(ppm)80

把蛋白質(zhì)吸光曲線和磷含量曲線繪于同一坐標(biāo)內(nèi)，可以得到如下曲線圖圖3.DPP蛋白含量與磷含量曲線分析圖252015105磷含量(ppm)把蛋白質(zhì)吸光曲線和磷含量曲線繪于同一坐標(biāo)內(nèi)，可以得81

DPP分子量測定141kD124kD108kDSDS電泳圖譜HCL脫礦：141KD、124KD、108KDDPP分子量測定141kD124kD108kDSDS電泳圖82

DPP氨基酸分析Met 8.1Ile 25.6Leu 25.8Tyr 8.9Phe 8.6Lys 36.4His 9.8Arg 26.9注：均為每1000個(gè)氨基酸殘基中的值氨基酸 AA數(shù)目Asp 238.1Thr 30.2Ser 191.5Glu 174.4Pro 41.2Gly 103.0Ala 36.9Val 34.6所提DPP樣品的氨基酸分析結(jié)果如下表：DPP氨基酸分析Met 8.1氨基酸 AA數(shù)目所提DPP樣83本研究結(jié)果與國外學(xué)者基本一致，說明富含天門冬氨酸、絲氨酸的人DPP，含磷量高，具有與鈣結(jié)合，誘導(dǎo)生物礦化的分子基礎(chǔ)。本研究結(jié)果與國外學(xué)者基本一致，說明富含天門冬氨酸、絲84DPPBSA空白EAH-Sepharose4B礦化液37℃48h[Ca2+]/[PO43-]=1.67DPP在體外誘導(dǎo)生物礦化作用DPPBSA空白EAH-Sepharose4B礦化液[Ca85BSADPP對照BSADPP對照86X衍射分析結(jié)果說明磷酸鈣HAPCa5(PO4)3OHCa3(PO4)2CaHPO4Ca8H2(PO4)6·5H2OX衍射分析結(jié)果說明磷酸鈣Ca5(PO4)3OH87鈣磷含量的測定

測定各150mg凝膠顆粒的表面Ca、P沉積量結(jié)論：人DPP與一定的支持物結(jié)合可啟動HAP成核誘導(dǎo)礦化。鈣磷含量的測定

測定各150mg凝膠顆粒的表面Ca、P沉積量88實(shí)驗(yàn)動物：小型豬一周齡14-20Kg，選實(shí)驗(yàn)牙—第一恒磨牙20顆，下頜切牙10顆,牙隨機(jī)分組，DPP蓋髓，觀察2周、1月、3月結(jié)果：處死動物，實(shí)驗(yàn)牙切片HE染色結(jié)論：DPP對牙髓損傷的修復(fù)過程比氫氧化鈣更快誘導(dǎo)修復(fù)性牙本質(zhì)形成。DPP對培養(yǎng)的人牙髓細(xì)胞的作用DPP促進(jìn)生物礦化的動物實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)動物：小型豬一周齡14-20Kg，選實(shí)驗(yàn)牙—第一恒磨89人牙本質(zhì)磷蛋白促進(jìn)牙髓創(chuàng)傷修復(fù)人牙本質(zhì)磷蛋白促進(jìn)牙髓創(chuàng)傷修復(fù)90人牙本質(zhì)粉制備乙酸脫礦上清液A上清液B離子交換層析可溶性DPP再礦化實(shí)驗(yàn)特性檢測測定P含量蛋白含量1MNaCL處理牙本質(zhì)磷蛋白對再礦化的抑制作用人牙本質(zhì)粉制備乙酸脫礦上清液A上清液B離子交換層析可溶性DP91結(jié)果上清液A、B中的總蛋白濃度結(jié)果上清液A、B中的總蛋白濃度92證明：1MNaCL提取可溶性DPP證明：1MNaCL提取可溶性DPP93再礦化實(shí)驗(yàn)牙根磨片實(shí)驗(yàn)組對照組再礦化液處理1MNaCL處理脫礦鈣離子測定SEM觀察MRG照片吸光度測定再礦化實(shí)驗(yàn)牙根磨片實(shí)驗(yàn)組對照組再礦化液處理1MNaCL處理94再礦化液中鈣含量測定T檢驗(yàn)P<0.01再礦化液中鈣含量測定T檢驗(yàn)P<0.0195掃描電鏡觀察實(shí)驗(yàn)組對照組掃描電鏡觀察實(shí)驗(yàn)組對照組96顯微放射照片的平均吸光度檢驗(yàn)

DPP抑制生物礦化的可能機(jī)制可溶性（游離性）DPP的作用顯微放射照片的平均吸光度檢驗(yàn)DPP抑制生物礦化的可能機(jī)制97目的：利用分子生物學(xué)技術(shù)克隆和表達(dá)包含功能區(qū)的人DPP片段，以便通過人DPP功能片段研究促進(jìn)牙齒生物礦化（發(fā)育和修復(fù)功能）作用的研究。人牙本質(zhì)磷蛋白基因片段的克隆和表達(dá)目的：人牙本質(zhì)磷蛋白基因片段的克隆和表達(dá)98人DPP基因全序列的亞克隆及其5’端序列的克隆分析通過酶切分析和DNA序列測定，證實(shí)DPP重組質(zhì)粒（pBlueBacHis2-DPP)帶有人DPP基因。通過基因亞克隆建立了帶有人DPP基因的穩(wěn)定克隆株。采用分子克隆技術(shù)構(gòu)建了含人DPP基因5’端序列的重組質(zhì)粒pT-DPP-N并進(jìn)行測序。pT-DPP-N質(zhì)粒（含DPPcDNA5’端序列）生化特性：168個(gè)氨基酸，富含天門冬氨酸和絲氨酸，含RGD序列和DSS重復(fù)序列，PI為3.115，分子量為16869.1D。人DPP基因全序列的亞克隆及其5’端序列的克隆分析9921564bp2027bp

pBluBacHis2-DPP的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（人DPP基因5’端序列）Lane1：λDNA/HindIIILane2:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物21564bp2027bppBluBac100504bpBamHⅠEcoRI504bpBamHⅠEcoRI101Ala(A):31.77Asx(B):00Cys(C):00Asp(D):4526.62Glu(E):42.38Phe(F):00Gly(G):105.91His(H):00Ile(I):00Lys(K):74.14Leu(L):00Met(M):00Asn(N):2011.83Pro(P):1.59Gln(Q):00Arg(R):1.59Ser(S):7443.78

Thr(T):21.18Val(V):00Trp(W):00Unk(X):00Tyr(Y):1.59Glx(Z):00Total:168100人DPP蛋白N端氨基酸組成人DPP蛋白Asp(D):26%Ser(S):58%Ala(A):31.77A102人DPP5’端序列的表達(dá)和純化構(gòu)建帶有人DPP基因5’端序列GST融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒（p5X-1-hDPP-N)，并在原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)純化。504bpBamHⅠEcoRILane1:DL2000Lane2:p5X-HDPP-N酶切電泳21100bp250bp500bp750bp1500bp2000bp人DPP5’端序列的表達(dá)和純化504bpBamHⅠEcoRI103構(gòu)建帶有人DPP基因5’端序列的桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒（pFASTBAC-hDPP-N)，并在真核（sf9細(xì)胞）中表達(dá)了人DPP基因5’端序列片段。

Lane1:超聲后的沉淀

Lane2:超聲后的上清

Lane3:中分子量Marker12396KDa66KDa43KDa

Lane1:蛋白復(fù)性時(shí)的析出沉淀

Lane2:GST-BSAMarkerLane3:蛋白純化帶12366KD26KD構(gòu)建帶有人DPP基因5’端序列的桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒（pFAST104504bp504bp真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建BamHⅠEcoRIBamHⅠEcoRI504bp504bp真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建BamHⅠEcoRIB105A上：正常sf9細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)A下：正常sf9細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)B上：病毒感染細(xì)胞24小時(shí)B下：病毒感染細(xì)胞48小時(shí)

AB

1:2代毒細(xì)胞總蛋白2：3代毒細(xì)胞總蛋白1220kD31kD14KDA上：正常sf9細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)A106Vies等（1994）篩選鼠切牙成牙本質(zhì)細(xì)胞和牙本質(zhì)cDNA文庫時(shí)發(fā)現(xiàn)一種與BSP的氨基酸組成相似的新蛋白稱DSP。鼠DSP占牙本質(zhì)非膠原蛋白的5%~8%，含糖30%，其中10%為涎酸。DSP主要氨基酸是天門冬、絲、甘、谷氨酸，有13個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，6個(gè)N-糖基化的位點(diǎn)。鼠DSP基因編碼383個(gè)氨基酸（17-信號肽，366—分泌DSP）

牙本質(zhì)涎蛋白

DentinSialoproteinDSPVies等（1994）篩選鼠切牙成牙本質(zhì)細(xì)胞和牙本質(zhì)cDNA107DSP生物學(xué)作用可能參與牙本質(zhì)生物礦化的啟動晶體形成。并促進(jìn)HAP晶體生長?？赡軈⑴c牙胚發(fā)育期上皮與間葉組織之間信號傳遞，互相調(diào)控。DSP生物學(xué)作用108MacDougall等（1997）發(fā)現(xiàn)：小鼠牙的DPP與DSP是一條目的基因編碼的蛋白質(zhì)。DSPPcDNA中信號肽及N端序列有75%與DSP一致，C端的489個(gè)氨基酸編碼與DPP一致。DSPP為酸性蛋白（PI=4.0），富含天門冬氨基酸（18.9%），絲氨酸（36.3%）DSPP基因位于人類染色體4q21~23.