色譜分離過程最終版課件

色譜分離.色譜分離.1概述色譜分離過程的基本原理色譜的分類色譜分離過程基礎(chǔ)理論色譜技術(shù)的應(yīng)用.概述.2

1.概述-發(fā)展關(guān)于色譜分離方法的研究始于1901年，俄國植物學(xué)家Tswett（茨維特）在研究植物葉子的組成時(shí)，用碳酸鈣填充豎立的玻璃管，以石油醚洗脫植物色素的提取液，經(jīng)過一段時(shí)間洗脫之后，植物色素在碳酸鈣柱中實(shí)現(xiàn)分離，由一條色帶分散成三種顏色的6個(gè)色帶。兩年后他發(fā)表了他的研究成果“一種新型吸附現(xiàn)象及其在生化分析上的應(yīng)用”，提出了應(yīng)用吸附原理分離植物色素的新方法，在這一方法中把玻璃管叫做“色譜柱”，碳酸鈣叫做“固定相”，石油醚叫做“流動(dòng)相”。三年后，他將這種方法命名為色譜法（Chromatography）。.1.概述-發(fā)展關(guān)于色譜分離方法的研究始于1901年，俄國植3色譜法于二十世紀(jì)五十年代之后飛速發(fā)展，并發(fā)展出一個(gè)獨(dú)立的三級(jí)學(xué)科-色譜學(xué)。1952年英國科學(xué)家阿切爾·馬丁、理查德·辛格因發(fā)明了分配色譜法而共同獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，此外色譜分析方法還在12項(xiàng)獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的研究工作中起到關(guān)鍵作用。.色譜法于二十世紀(jì)五十年代之后飛速發(fā)展，并發(fā)展出一個(gè)獨(dú)立的三級(jí)4

1.概述-色譜分離的特點(diǎn)應(yīng)用范圍廣復(fù)雜混合物，有機(jī)同系物，異構(gòu)體，手性異構(gòu)體。氣相色譜：沸點(diǎn)低于400℃的各種有機(jī)或無機(jī)試樣的分析。液相色譜：高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析。分離效率高若用塔板理論數(shù)來表示色譜柱的效率，每米柱長可達(dá)幾千至幾十萬的塔板數(shù)，特別適用于極復(fù)雜混合物的分離，且通常收率、產(chǎn)率、和純度都較高。操作模式多樣可通過選擇不同的操作模式，以適應(yīng)不同樣品的分離。靈敏度高可以檢測出μg.g-1(10-6)級(jí)甚至ng.g-1(10-9)級(jí)的物質(zhì)量。.1.概述-色譜分離的特點(diǎn)應(yīng)用范圍廣.52.色譜分離過程的基本原理

色譜分離的幾個(gè)概念所有的色譜分離操作均分為：裝柱、上樣、層析、洗脫。其中的固定不動(dòng)的相，稱為固定相；攜帶試樣混合物流過此固定相的流體，稱為流動(dòng)相；作為流動(dòng)相的液體或氣體，稱為洗脫劑；洗脫時(shí)從柱中流出的溶液，稱為洗脫液；加入洗脫劑使各組分分層的操作，叫層析，也叫展開。.2.色譜分離過程的基本原理色譜分離的幾個(gè)概念.6分離原理

色譜過程的本質(zhì)是待分離物質(zhì)分子在固定相和流動(dòng)相之間分配平衡的過程，不同的物質(zhì)在兩相之間的分配會(huì)不同，這使其隨流動(dòng)相運(yùn)動(dòng)速度各不相同，隨著流動(dòng)相的運(yùn)動(dòng)，混合物中的不同組分在固定相上相互分離。不同組分在色譜分離過程中分離情況取決于各組分在兩相間的分配系數(shù)、吸附能力、親和力等的差異。.分離原理色譜過程的本質(zhì)是待分離物質(zhì)分子在固定相和流7常用的固定相（色譜柱填料）硅膠活性炭離子交換樹脂大孔吸附樹脂氧化鋁凝膠纖維素衍生物環(huán)糊精聚丙烯酰胺.常用的固定相（色譜柱填料）硅膠凝膠.8硅膠：應(yīng)用廣泛，適合各類成分氧化鋁：主要用于堿性或中性親脂性成分，如生物堿、甾體、萜類等活性炭:用于水溶性氨基酸、糖類及苷類聚酰胺：主用于酚類、醌類如黃酮類、蒽醌類及鞣質(zhì)等成分.硅膠：應(yīng)用廣泛，適合各類成分.93.色譜的分類按兩相狀態(tài)氣固色譜、氣液色譜、液固色譜、液液色譜按固定相幾何形式柱色譜、紙色譜、薄層色譜按分離原理吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、凝膠色譜、排阻色譜、親和色譜.3.色譜的分類按兩相狀態(tài).10吸附色譜凝膠過濾色譜離子交換色譜大孔樹脂色譜分配色譜色譜分離法.吸附色譜凝膠過濾色譜離子交換色譜大孔樹脂色譜分配色譜色譜分離11吸附色譜物理吸附：硅膠、氧化鋁、活性炭為吸附劑進(jìn)行的吸附色譜；化學(xué)吸附：黃酮等酚酸性物質(zhì)被氧化鋁吸附、生物堿被酸性硅膠吸附等；半化學(xué)吸附：聚酰胺與黃酮類、醌類等酚性化合物之間的氫鍵吸附，吸附力較弱，介于物理吸附與化學(xué)吸附之間。常用的極性吸附劑：硅膠、氧化鋁。常用的非極性吸附劑：活性炭。.吸附色譜物理吸附：硅膠、氧化鋁、活性炭為吸附劑進(jìn)行的吸附色譜12凝膠過濾色譜（凝膠滲透色譜、分子篩濾過色譜、排阻色譜）原理：分子篩作用葡聚糖凝膠（sephadexG）羥丙基葡聚糖凝膠(sephadexLH-20)凝膠過濾色譜.凝膠過濾色譜（凝膠滲透色譜、分子篩濾過色譜、排阻色譜）凝膠過13..14離子交換樹脂法原理：可交換離子與樹脂上的交換基團(tuán)進(jìn)行離子交換，并被吸附，用適當(dāng)?shù)娜軇闹舷疵撓聛?，?shí)現(xiàn)物質(zhì)的分離。吸附規(guī)律陽離子交換樹脂—分離堿性成分陰離子交換樹脂—分離酸性成分.離子交換樹脂法原理：可交換離子與樹脂上的交換基團(tuán)進(jìn).15大孔吸附樹脂吸附性和分子篩原理相結(jié)合以苯乙烯為母體，二乙烯苯為交聯(lián)劑（非極性）吸附力：范德華力或氫鍵工藝流程：樹脂預(yù)處理→樹脂上柱→藥液上柱→樹脂的解吸→樹脂的清洗、再生。.大孔吸附樹脂吸附性和分子篩原理相結(jié)合以苯乙烯為母體，二乙烯苯16..17分配色譜原理：被分離成分在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)不同。正相分配色譜：流動(dòng)相極性<固定相極性反相分配色譜：流動(dòng)相極性>固定相極性HPLC、MPLC、LPLC.分配色譜原理：被分離成分在固定相和流動(dòng)相之間的.184.色譜分離過程理論基礎(chǔ)隨著色譜技術(shù)的發(fā)展，為了解釋色譜分離現(xiàn)象，指導(dǎo)色譜技術(shù)的發(fā)展，許多研究者對(duì)色譜基礎(chǔ)理論進(jìn)行了不懈的研究，提出了多種色譜過程的理論。主要有速率方程理論、平衡色譜理論、

塔板理論、軸向擴(kuò)散理論。.4.色譜分離過程理論基礎(chǔ)隨著色譜技術(shù)的發(fā)展，為了解釋色194.色譜分離過程理論基礎(chǔ)塔板理論由馬?。∕artin）和欣革（Synge）最早提出將色譜柱比作蒸餾塔，把一根連續(xù)的色譜柱設(shè)想成由許多小段組成。在每一小段內(nèi)，一部分空間被固定相占據(jù)，而另一部分空間充滿流動(dòng)相。組分隨流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱后，就在兩相間進(jìn)行分配。在每一個(gè)塔板內(nèi)組分分子在固定相和流動(dòng)相之間形成平衡，隨著流動(dòng)相的流動(dòng)，組分分子不斷從一個(gè)塔板移動(dòng)到下一個(gè)塔板，并不斷形成新的平衡。一個(gè)色譜柱的塔板數(shù)越多，其分離效果就越好。.4.色譜分離過程理論基礎(chǔ)塔板理論.204.色譜分離過程理論基礎(chǔ)-保留值保留時(shí)間（tR）：從進(jìn)樣到某個(gè)組分的色譜峰頂點(diǎn)之間的時(shí)間間隔死時(shí)間（tM）：不被固定相滯留的組分從進(jìn)樣開始、通過色譜柱、到出現(xiàn)峰最大值所需要的時(shí)間。調(diào)整保留時(shí)間（tR＇）：tR＇=tR－tM保留值是色譜過程的基本熱力學(xué)參數(shù)之一。在相同的操作條件下，不同的物質(zhì)有各自固有的保留時(shí)間，因此它也是色譜定性的基本依據(jù)。.4.色譜分離過程理論基礎(chǔ)-保留值保留時(shí)間（tR）：從進(jìn)樣到21峰寬Wb：色譜峰拐點(diǎn)處的兩條切線與基線的兩個(gè)交點(diǎn)之間的距離；半峰寬Y1/2：峰高一半處對(duì)應(yīng)的峰寬，為2.35

；相鄰色譜峰峰頂之間的距離除以此二色譜峰的平均寬度。用R表示：分離度.峰寬Wb：色譜峰拐點(diǎn)處的兩條切線與基線的兩個(gè)交點(diǎn)之間的距離；22定性時(shí)要求：R=1.0（相鄰兩峰分離程度98%）定量時(shí)要求：R=1.5（相鄰兩峰分離程度99.7%，基線分離，作為完全分離的標(biāo)準(zhǔn)）。一般將R≥1作為色譜能較好分離的判據(jù)。.定性時(shí)要求：R=1.0（相鄰兩峰分離程度98%）.23柱效率實(shí)際工作中，塔板數(shù)的計(jì)算用下列公式：

而理論塔板數(shù)的計(jì)算公式為：

n=L/H

其中L為色譜柱的柱長；H為理論板高度。.柱效率.24

考慮到組分在死時(shí)間內(nèi)不參與柱內(nèi)分配，用調(diào)整保留時(shí)間代替保留時(shí)間，得有效塔板數(shù)和有效塔板高度：.考慮到組分在死時(shí)間內(nèi)不參與柱內(nèi)分配，用調(diào)整保留時(shí)間代255.色譜分離的應(yīng)用色譜法的應(yīng)用可以根據(jù)目的分為分析性色譜和制備性色譜兩大類。分析性色譜的目的是定量或者定性測定混合物中各組分的性質(zhì)和含量。定性的分析性色譜有薄層色譜、紙色譜等，定量的分析性色譜有氣相色譜、高效液相色譜等。制備性色譜的目的是分離混合物，獲得一定數(shù)量的純凈組分。.5.色譜分離的應(yīng)用色譜法的應(yīng)用可以根據(jù)目的分為分析性色譜和制265.色譜分離的應(yīng)用薄層色譜（TLC）氣相色譜法（GC）高效液相色譜（HPLC）典型制備色譜.5.色譜分離的應(yīng)用薄層色譜（TLC）.271938年俄國人首先實(shí)現(xiàn)了在氧化鋁薄層上分離一種天然藥物。1965年德國化學(xué)家Stahl出版了“薄層色譜法”一書，推動(dòng)了這一技術(shù)的發(fā)展。因TLC法設(shè)備簡單，分析速度快，分離效率高，結(jié)果直觀，很快被用作定性和半定量的方法。70年代中后期發(fā)展了高效薄層色譜。80年代以后發(fā)展了薄層色譜光密度掃描儀，和各步操作的儀器化，并實(shí)現(xiàn)了計(jì)算機(jī)化。薄層層析流動(dòng)相的移動(dòng)是依靠毛細(xì)作用。薄層色譜（TLC）.1938年俄國人首先實(shí)現(xiàn)了在氧化鋁薄層上分離一種天然藥物。128..29比移值（Rf值）:用來表征斑點(diǎn)位置的基本參數(shù)是保留因子，通常稱作比移值，用Rf表示。.比移值（Rf值）:用來表征斑點(diǎn)位置的基本參數(shù)是保.30顯色方法日光下觀察,劃出有色物質(zhì)的斑點(diǎn)位置在紫外燈下(254nm或365nm),觀察有無熒光的產(chǎn)生,用硅膠G板熒光淬滅法,適用于有紫外吸收的物質(zhì)，用GF254板顯色劑顯色,破壞性檢出方法.顯色方法日光下觀察,劃出有色物質(zhì)的斑點(diǎn)位置.31常用顯色劑硫酸硫酸-水；硫酸-甲醇/乙醇；0.5%碘的氯仿溶液對(duì)很多化合物顯黃棕色中性0.05%高錳酸鉀溶液易還原性化合物在淡紅色背景上顯黃色堿性高錳酸鉀試劑還原性化合物在淡紅色背景上顯黃色.常用顯色劑硫酸硫酸-水；硫酸-甲醇/乙醇；.32優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡單、操作方便、運(yùn)行費(fèi)用低；分離時(shí)間短，工作效率高；展開劑選擇范圍廣，展開方式多樣；顯色方便，檢測手段豐富；既可分析，又可制備；試樣一般不需要經(jīng)過嚴(yán)格預(yù)處理即可分離。

缺點(diǎn)：

分離效率較低；不適用揮發(fā)性試樣分離；定性定量不便。.優(yōu)點(diǎn)：.33

TLC的應(yīng)用1.用于柱層析后相同組分的合并2.有機(jī)合成監(jiān)控反應(yīng)，摸索最佳條件3.制備有機(jī)化合物4.中藥材的鑒定在中華人民共和國藥典中，共有超過約600種化學(xué)合成藥和超過約400種中藥的質(zhì)量控制應(yīng)用了高效液相色譜的方法。

.TLC的應(yīng)用1.用于柱層析后相同組分的合并.345.色譜分離的應(yīng)用薄層色譜（TLC）氣相色譜法（GC）高效液相色譜（HPLC）典型制備色譜.5.色譜分離的應(yīng)用薄層色譜（TLC）.351953年阿切爾·馬丁和A.T.詹姆斯發(fā)明了氣相色譜法。.1953年阿切爾·馬丁和A.T.詹姆斯發(fā)明了氣相色譜法。.36GC：以氣體（即載氣）為流動(dòng)相的柱色譜分離技術(shù)。GC中常用作的載氣的氣體有N2、He、H2、Ar，均為惰性氣體。GC載氣的功能僅僅是攜帶試樣、洗脫組分。GC的選擇性主要取決于固定相和組分分子間的作用，所以可通過改變固定相來改變GC的選擇性。氣相色譜儀-GC.GC：以氣體（即載氣）為流動(dòng)相的柱色譜氣相色譜儀-GC.37氣相色譜儀流程（圖）氣路系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)（色譜柱系統(tǒng)）檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理和控制系統(tǒng)（含溫控系統(tǒng)）.氣相色譜儀流程（圖）氣路系統(tǒng).38樣品進(jìn)樣汽化色譜柱分離檢測器信號(hào)記錄載氣.樣品進(jìn)樣汽化色譜柱分離檢測器信號(hào)記錄載氣.39進(jìn)樣系統(tǒng)由進(jìn)樣器和氣化室構(gòu)成。液體樣品—微量注射器氣體樣品—六通閥、微量注射器氣化室溫度：要保證樣品瞬間、完全氣化，一般高于沸點(diǎn)50℃以上，但也不宜太高，以防分解.進(jìn)樣系統(tǒng)由進(jìn)樣器和氣化室構(gòu)成。.40柱溫的選擇柱溫應(yīng)低于固定液的最高使用溫度；柱溫過高，易造成固定液流失、檢測器噪聲變大、基線漂移。柱溫一般選擇接近或略高于組分的平均沸點(diǎn)。降低柱溫可在一定程度內(nèi)改善分離；升高柱溫可加快分析速度。組分復(fù)雜，沸程寬（80-100℃）的試樣，采用程序升溫。.柱溫的選擇柱溫應(yīng)低于固定液的最高使用溫度；柱溫過高，易造成固41對(duì)檢測器的要求穩(wěn)定性好、噪聲低；靈敏度高；線性范圍寬；死體積小，響應(yīng)快.對(duì)檢測器的要求穩(wěn)定性好、噪聲低；.42噪聲和漂移噪聲（N）：在沒有樣品進(jìn)入檢測器時(shí)，基線在短期內(nèi)發(fā)生的波動(dòng)。噪聲的來源：固定液的流失、載氣的不純，電子元件不穩(wěn)定、溫度變化、外磁場干擾等。基線漂移：基線在一定時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的單向、緩慢移動(dòng)。良好的檢測器其噪聲與漂移都應(yīng)很小。.噪聲和漂移噪聲（N）：在沒有樣品進(jìn)入檢測器時(shí)，基線在短期內(nèi)43GC的特點(diǎn)1.優(yōu)點(diǎn)分離效率高（填充柱上千塊塔板）分析速度快樣品用量少（檢測限低，高靈敏檢測器）2.缺點(diǎn)：（約20%樣品適用）樣品須能氣化（350℃下有一定的揮發(fā)性）熱穩(wěn)定性要好定性困難.GC的特點(diǎn)1.優(yōu)點(diǎn).445.色譜分離的應(yīng)用薄層色譜（TLC）氣相色譜法（GC）高效液相色譜（HPLC）典型制備色譜.5.色譜分離的應(yīng)用薄層色譜（TLC）.45高效液相色譜儀高效液相色譜是20世紀(jì)60年代末發(fā)展的一種以液體為流動(dòng)相的色譜技術(shù)。特點(diǎn)如下：高壓一般可達(dá)（150~350）×105Pa高速一般可達(dá)1~10mL/min高效高靈敏度分析時(shí)使用樣品少一般僅幾毫升.高效液相色譜儀高效液相色譜是20世紀(jì)60年代末發(fā)展的一種以液46高效液相色譜儀流程（圖）1．貯液罐（濾棒，可濾去顆粒狀物質(zhì)）2．高壓泵（輸液泵）3．進(jìn)樣裝置4．色譜柱——分離5．檢測器——分析6．廢液出口或組分收集器7．記錄裝置.高效液相色譜儀流程（圖）1．貯液罐（濾棒，可濾去顆粒狀物質(zhì)）47貯液器高壓泵梯度洗脫裝置進(jìn)樣器色譜柱記錄儀數(shù)據(jù)處理機(jī)檢測器組分收集器試樣壓力表輸液系統(tǒng).貯液器高壓泵梯度洗脫進(jìn)樣器色記錄儀檢測器組分試樣壓輸液系統(tǒng).48流動(dòng)相脫氣的方法超聲波振蕩脫氣惰性氣體鼓泡吹掃脫氣在線（真空）脫氣.流動(dòng)相脫氣的方法超聲波振蕩脫氣.49HPLC用水專門的純水機(jī)或超純水機(jī)；二次或三次重蒸水；市場上瓶裝的純凈水或蒸餾水；其它途徑；.HPLC用水專門的純水機(jī)或超純水機(jī)；.50流動(dòng)相溶劑的要求溶劑對(duì)于待測樣品必須具有合適的極性和良好的選擇性。溶劑要與檢測器匹配對(duì)于紫外吸收檢測器，應(yīng)注意選用檢測器波長比溶劑的紫外截止波長要長。對(duì)于折光率檢測器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動(dòng)相，以達(dá)最高靈敏度。高純度由于高效液相靈敏度高，對(duì)流動(dòng)相溶劑的純度也要求高?；瘜W(xué)穩(wěn)定性好低粘度若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙睛等。.流動(dòng)相溶劑的要求溶劑對(duì)于待測樣品必須具有合適的極性和良好51洗脫方式等度洗脫用恒定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫梯度洗脫在一個(gè)分析周期內(nèi)，按一定程序不斷改變流動(dòng)相的濃度配比。優(yōu)點(diǎn)：縮短分析周期；提高分離效果；改善峰形；增加檢測靈敏度。缺點(diǎn)：有時(shí)引起基線漂移；重復(fù)性不佳。.洗脫方式等度洗脫.52HPLC色譜柱類型類型內(nèi)徑D(cm)柱長(cm)粒徑(μm)分析柱0.3–0.463-253-10半制備柱0.8–1.010-255-20制備柱2.0–5.010-255-20.HPLC色譜柱類型類型內(nèi)徑D(cm)柱長(cm53化學(xué)鍵合相利用化學(xué)反應(yīng)將不同的有機(jī)官能團(tuán)通過共價(jià)鍵鍵合到載體硅膠表面的游離羥基上而形成的固定相。種類非極性鍵合相：如鍵合C18、C8、苯基等，其中十八烷（ODS或C18）鍵合相是常用的代表，可完成HPLC分析任務(wù)的80%。中等極性鍵合相：如鍵合醚基，可分離能形成氫鍵的化合物（如酚類）.化學(xué)鍵合相利用化學(xué)反應(yīng)將不同的有機(jī)官能團(tuán)通過共價(jià)鍵鍵.54評(píng)價(jià)色譜柱好壞的標(biāo)準(zhǔn)1）理論塔板數(shù)n2）拖尾因子Tf3)色譜柱批與批之間的重現(xiàn)性4）pH值的適用范圍5）使用壽命.評(píng)價(jià)色譜柱好壞的標(biāo)準(zhǔn)1）理論塔板數(shù)n.55拖尾因子Tf不對(duì)稱因子(As)=BAA拖尾因子(Tf)=A+B2A10%峰高5%峰高.拖尾因子Tf不對(duì)稱因子(As)BAA拖尾因子(Tf)A56對(duì)理想檢測器的要求高靈敏度；適用范圍廣，對(duì)所有組分都有響應(yīng)；溫度、流動(dòng)相流速的變化對(duì)響應(yīng)沒有影響；可梯度洗脫，響應(yīng)與流動(dòng)相的組成無關(guān)；死體積??；使用方便、可靠、耐用；線性范圍寬；響應(yīng)時(shí)間快；.對(duì)理想檢測器的要求高靈敏度；.57常用檢測器紫外檢測器（UV）熒光檢測器（FD）示差折光檢測器（RID）蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）.常用檢測器紫外檢測器（UV）.58紫外檢測器（UV）配置最普遍；主要用于檢測具有π-π、p–π共軛結(jié)構(gòu)的化合物，如芳烴、稠環(huán)芳烴等；靈敏度高；可用于梯度洗脫

缺點(diǎn)：只能檢測有紫外吸收的樣品；（衍生化解決）對(duì)流動(dòng)相的選擇有一定的限制；（截止波長）.紫外檢測器（UV）配置最普遍；.59熒光檢測器（FD）適用于能產(chǎn)生熒光的化合物；主要用于氨基酸、多環(huán)芳烴等樣品；靈敏度極高（比紫外高1~3個(gè)數(shù)量級(jí)），適用于痕量分析；可梯度洗脫

缺點(diǎn)：許多化合物不產(chǎn)生熒光（可衍生化解決）；.熒光檢測器（FD）適用于能產(chǎn)生熒光的化合物；.60示差折光檢測器（RID）通用性好；對(duì)糖類分析靈敏度尚可；缺點(diǎn)：靈敏度低（比紫外低3個(gè)數(shù)量級(jí)）；不能梯度洗脫（否則，基線會(huì)漂移）.示差折光檢測器（RID）通用性好；.61蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）20世紀(jì)90年代新開發(fā)；是示差折光檢測器的理想替代品，對(duì)葡萄糖最小檢出量5ng；高靈敏；可梯度洗脫；缺點(diǎn)：對(duì)有紫外吸收的樣品，檢測靈敏度較低；.蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）20世紀(jì)90年代新開發(fā)；.62檢測器比較

紫外

熒光示差折光蒸發(fā)光散射測量參數(shù)吸光度熒光強(qiáng)度折射率質(zhì)量類型選擇型選擇型通用型通用型梯度洗脫可以可以不可以可以最小檢出量約1ng約1pg約1μg0.1~10ng.檢測器比較紫外熒光示差折光蒸發(fā)光散射測量參數(shù)吸光63HPLC定性、定量分析定性分析利用保留值定性；色譜-光譜聯(lián)用定性；

利用餾分收集器收集后，再用光譜定性；定量分析歸一化少用外標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法.HPLC定性、定量分析定性分析定量分析.64HPLC與GC比較GC：適于能氣化、熱穩(wěn)定性好的樣品；約占有機(jī)物的20%；HPLC：不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，對(duì)分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差的樣品均可檢測，約占有機(jī)物的80%。.HPLC與GC比較.655.色譜分離的應(yīng)用薄層色譜（TLC）氣相色譜法（GC）高效液相色譜（HPLC）典型制備色譜.5.色譜分離的應(yīng)用薄層色譜（TLC）.66典型制備色譜制備色譜是適應(yīng)科技和生產(chǎn)需要發(fā)展起來的一種新型、高效、節(jié)能的分離技術(shù)，目前在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用的色譜分離技術(shù)主要是中、高壓液相色譜。由于新的高選擇性能固定相的開發(fā)，新型色譜技術(shù)的出現(xiàn)，以及色譜機(jī)制、色譜柱放大效應(yīng)理論及相關(guān)數(shù)學(xué)模型研究的不斷深入，使色譜分離取得了長足的發(fā)展。同時(shí)新的概念如SMBC（模擬移動(dòng)床色譜）、Pre-SFC（制備型超臨界流體色譜）以及EBAC（擴(kuò)展床吸附色譜）也被引入，大大擴(kuò)展了色譜作為一種工業(yè)提純工具的應(yīng)用領(lǐng)域。.典型制備色譜制備色譜是適應(yīng)科技和生產(chǎn)需要發(fā)展起來的一種新型、67模擬移動(dòng)床色譜（SMB）SMB色譜是連續(xù)操作的色譜系統(tǒng)它由多根（大多為5~12根）色譜柱組成。每根柱子之間用多位閥和管子連接在一起，每根柱子均設(shè)有樣品的進(jìn)出口，并通過多位閥沿著流動(dòng)相的流動(dòng)方向，周期性的改變樣品進(jìn)出口的位置，一次來模擬固定相與流動(dòng)相之間的逆流移動(dòng)，實(shí)現(xiàn)組分的連續(xù)分離。.模擬移動(dòng)床色譜（SMB）SMB色譜是連續(xù)操作的色譜系統(tǒng).68SMB色譜原理示意圖978101211654123進(jìn)料液A+BⅡ帶Ⅲ帶Ⅰ帶Ⅳ帶萃取液洗提液萃余液液體循環(huán)方向.SMB色譜原理示意圖978101211654123進(jìn)料液Ⅱ帶69模擬移動(dòng)床色譜（SMB）SMB的優(yōu)勢：是一個(gè)連續(xù)的色譜分離過程；SMB色譜技術(shù)比其他制備色譜的分離效率高；SMB色譜技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)旋光異構(gòu)物分離過程從分析型色譜條件快速、可靠的放大；SMB色譜裝置可以適合不同規(guī)模的色譜分離過程。.模擬移動(dòng)床色譜（SMB）SMB的優(yōu)勢：.70制備型超臨界流體色譜制備型超臨界流體色譜（Pre-SFC）已應(yīng)用于許多化學(xué)工業(yè)中的提取過程。最常見的是采用Pre-SFC提取香料或咖啡因等。目前SF-CO2在緩釋藥物合成及生物分子穩(wěn)定和轉(zhuǎn)移等方面的應(yīng)用，使Pre-SFC制藥工業(yè)的廣泛關(guān)注。超臨界流體是用二氧化碳等一類氣體，使其處于臨界狀態(tài)下成為流體，以這種臨界流體做流動(dòng)相的色譜法，是處于液體色譜和氣體色譜之間的色譜方法。CO2是SFC中最常用最安全的超臨界流體。.制備型超臨界流體色譜制備型超臨界流體色譜（Pre-SFC）已71SF-CO2色譜的工作示意圖p凈化1T0CO2循環(huán)色譜柱Det4532T0T0進(jìn)料液泵氣態(tài)區(qū)泵p超臨界狀態(tài)區(qū)液態(tài)區(qū)液態(tài)CO2純組分.SF-CO2色譜的工作示意圖p凈化1T0CO2循環(huán)色譜柱De72超臨界流體色譜的優(yōu)勢：①在Pre-SFC中，通過改變流動(dòng)相溫度或壓力即可改變其密度，色譜分享的特性就會(huì)改變；②收集的餾分中的流動(dòng)相容易除去；③流動(dòng)相回收簡便，處理后可循環(huán)使用。然而Pre-SFC的應(yīng)用也受到其自身特點(diǎn)的局限：①技術(shù)相當(dāng)昂貴；②超臨界流體的溶解性能不可能溶解所有物質(zhì)，通常需要加入改良劑改善溶解性能，但同時(shí)部分抵消了其一些優(yōu)勢。.超臨界流體色譜的優(yōu)勢：.73色譜法的應(yīng)用石油和石油化工分析環(huán)境分析食品分析藥物和臨床分析物化參數(shù)測定聚合物分析.色譜法的應(yīng)用石油和石油化工分析.74色譜分離.色譜分離.75概述色譜分離過程的基本原理色譜的分類色譜分離過程基礎(chǔ)理論色譜技術(shù)的應(yīng)用.概述.76

1.概述-發(fā)展關(guān)于色譜分離方法的研究始于1901年，俄國植物學(xué)家Tswett（茨維特）在研究植物葉子的組成時(shí)，用碳酸鈣填充豎立的玻璃管，以石油醚洗脫植物色素的提取液，經(jīng)過一段時(shí)間洗脫之后，植物色素在碳酸鈣柱中實(shí)現(xiàn)分離，由一條色帶分散成三種顏色的6個(gè)色帶。兩年后他發(fā)表了他的研究成果“一種新型吸附現(xiàn)象及其在生化分析上的應(yīng)用”，提出了應(yīng)用吸附原理分離植物色素的新方法，在這一方法中把玻璃管叫做“色譜柱”，碳酸鈣叫做“固定相”，石油醚叫做“流動(dòng)相”。三年后，他將這種方法命名為色譜法（Chromatography）。.1.概述-發(fā)展關(guān)于色譜分離方法的研究始于1901年，俄國植77色譜法于二十世紀(jì)五十年代之后飛速發(fā)展，并發(fā)展出一個(gè)獨(dú)立的三級(jí)學(xué)科-色譜學(xué)。1952年英國科學(xué)家阿切爾·馬丁、理查德·辛格因發(fā)明了分配色譜法而共同獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，此外色譜分析方法還在12項(xiàng)獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的研究工作中起到關(guān)鍵作用。.色譜法于二十世紀(jì)五十年代之后飛速發(fā)展，并發(fā)展出一個(gè)獨(dú)立的三級(jí)78

1.概述-色譜分離的特點(diǎn)應(yīng)用范圍廣復(fù)雜混合物，有機(jī)同系物，異構(gòu)體，手性異構(gòu)體。氣相色譜：沸點(diǎn)低于400℃的各種有機(jī)或無機(jī)試樣的分析。液相色譜：高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析。分離效率高若用塔板理論數(shù)來表示色譜柱的效率，每米柱長可達(dá)幾千至幾十萬的塔板數(shù)，特別適用于極復(fù)雜混合物的分離，且通常收率、產(chǎn)率、和純度都較高。操作模式多樣可通過選擇不同的操作模式，以適應(yīng)不同樣品的分離。靈敏度高可以檢測出μg.g-1(10-6)級(jí)甚至ng.g-1(10-9)級(jí)的物質(zhì)量。.1.概述-色譜分離的特點(diǎn)應(yīng)用范圍廣.792.色譜分離過程的基本原理

色譜分離的幾個(gè)概念所有的色譜分離操作均分為：裝柱、上樣、層析、洗脫。其中的固定不動(dòng)的相，稱為固定相；攜帶試樣混合物流過此固定相的流體，稱為流動(dòng)相；作為流動(dòng)相的液體或氣體，稱為洗脫劑；洗脫時(shí)從柱中流出的溶液，稱為洗脫液；加入洗脫劑使各組分分層的操作，叫層析，也叫展開。.2.色譜分離過程的基本原理色譜分離的幾個(gè)概念.80分離原理

色譜過程的本質(zhì)是待分離物質(zhì)分子在固定相和流動(dòng)相之間分配平衡的過程，不同的物質(zhì)在兩相之間的分配會(huì)不同，這使其隨流動(dòng)相運(yùn)動(dòng)速度各不相同，隨著流動(dòng)相的運(yùn)動(dòng)，混合物中的不同組分在固定相上相互分離。不同組分在色譜分離過程中分離情況取決于各組分在兩相間的分配系數(shù)、吸附能力、親和力等的差異。.分離原理色譜過程的本質(zhì)是待分離物質(zhì)分子在固定相和流81常用的固定相（色譜柱填料）硅膠活性炭離子交換樹脂大孔吸附樹脂氧化鋁凝膠纖維素衍生物環(huán)糊精聚丙烯酰胺.常用的固定相（色譜柱填料）硅膠凝膠.82硅膠：應(yīng)用廣泛，適合各類成分氧化鋁：主要用于堿性或中性親脂性成分，如生物堿、甾體、萜類等活性炭:用于水溶性氨基酸、糖類及苷類聚酰胺：主用于酚類、醌類如黃酮類、蒽醌類及鞣質(zhì)等成分.硅膠：應(yīng)用廣泛，適合各類成分.833.色譜的分類按兩相狀態(tài)氣固色譜、氣液色譜、液固色譜、液液色譜按固定相幾何形式柱色譜、紙色譜、薄層色譜按分離原理吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、凝膠色譜、排阻色譜、親和色譜.3.色譜的分類按兩相狀態(tài).84吸附色譜凝膠過濾色譜離子交換色譜大孔樹脂色譜分配色譜色譜分離法.吸附色譜凝膠過濾色譜離子交換色譜大孔樹脂色譜分配色譜色譜分離85吸附色譜物理吸附：硅膠、氧化鋁、活性炭為吸附劑進(jìn)行的吸附色譜；化學(xué)吸附：黃酮等酚酸性物質(zhì)被氧化鋁吸附、生物堿被酸性硅膠吸附等；半化學(xué)吸附：聚酰胺與黃酮類、醌類等酚性化合物之間的氫鍵吸附，吸附力較弱，介于物理吸附與化學(xué)吸附之間。常用的極性吸附劑：硅膠、氧化鋁。常用的非極性吸附劑：活性炭。.吸附色譜物理吸附：硅膠、氧化鋁、活性炭為吸附劑進(jìn)行的吸附色譜86凝膠過濾色譜（凝膠滲透色譜、分子篩濾過色譜、排阻色譜）原理：分子篩作用葡聚糖凝膠（sephadexG）羥丙基葡聚糖凝膠(sephadexLH-20)凝膠過濾色譜.凝膠過濾色譜（凝膠滲透色譜、分子篩濾過色譜、排阻色譜）凝膠過87..88離子交換樹脂法原理：可交換離子與樹脂上的交換基團(tuán)進(jìn)行離子交換，并被吸附，用適當(dāng)?shù)娜軇闹舷疵撓聛?，?shí)現(xiàn)物質(zhì)的分離。吸附規(guī)律陽離子交換樹脂—分離堿性成分陰離子交換樹脂—分離酸性成分.離子交換樹脂法原理：可交換離子與樹脂上的交換基團(tuán)進(jìn).89大孔吸附樹脂吸附性和分子篩原理相結(jié)合以苯乙烯為母體，二乙烯苯為交聯(lián)劑（非極性）吸附力：范德華力或氫鍵工藝流程：樹脂預(yù)處理→樹脂上柱→藥液上柱→樹脂的解吸→樹脂的清洗、再生。.大孔吸附樹脂吸附性和分子篩原理相結(jié)合以苯乙烯為母體，二乙烯苯90..91分配色譜原理：被分離成分在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)不同。正相分配色譜：流動(dòng)相極性<固定相極性反相分配色譜：流動(dòng)相極性>固定相極性HPLC、MPLC、LPLC.分配色譜原理：被分離成分在固定相和流動(dòng)相之間的.924.色譜分離過程理論基礎(chǔ)隨著色譜技術(shù)的發(fā)展，為了解釋色譜分離現(xiàn)象，指導(dǎo)色譜技術(shù)的發(fā)展，許多研究者對(duì)色譜基礎(chǔ)理論進(jìn)行了不懈的研究，提出了多種色譜過程的理論。主要有速率方程理論、平衡色譜理論、

塔板理論、軸向擴(kuò)散理論。.4.色譜分離過程理論基礎(chǔ)隨著色譜技術(shù)的發(fā)展，為了解釋色934.色譜分離過程理論基礎(chǔ)塔板理論由馬丁（Martin）和欣革（Synge）最早提出將色譜柱比作蒸餾塔，把一根連續(xù)的色譜柱設(shè)想成由許多小段組成。在每一小段內(nèi)，一部分空間被固定相占據(jù)，而另一部分空間充滿流動(dòng)相。組分隨流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱后，就在兩相間進(jìn)行分配。在每一個(gè)塔板內(nèi)組分分子在固定相和流動(dòng)相之間形成平衡，隨著流動(dòng)相的流動(dòng)，組分分子不斷從一個(gè)塔板移動(dòng)到下一個(gè)塔板，并不斷形成新的平衡。一個(gè)色譜柱的塔板數(shù)越多，其分離效果就越好。.4.色譜分離過程理論基礎(chǔ)塔板理論.944.色譜分離過程理論基礎(chǔ)-保留值保留時(shí)間（tR）：從進(jìn)樣到某個(gè)組分的色譜峰頂點(diǎn)之間的時(shí)間間隔死時(shí)間（tM）：不被固定相滯留的組分從進(jìn)樣開始、通過色譜柱、到出現(xiàn)峰最大值所需要的時(shí)間。調(diào)整保留時(shí)間（tR＇）：tR＇=tR－tM保留值是色譜過程的基本熱力學(xué)參數(shù)之一。在相同的操作條件下，不同的物質(zhì)有各自固有的保留時(shí)間，因此它也是色譜定性的基本依據(jù)。.4.色譜分離過程理論基礎(chǔ)-保留值保留時(shí)間（tR）：從進(jìn)樣到95峰寬Wb：色譜峰拐點(diǎn)處的兩條切線與基線的兩個(gè)交點(diǎn)之間的距離；半峰寬Y1/2：峰高一半處對(duì)應(yīng)的峰寬，為2.35

；相鄰色譜峰峰頂之間的距離除以此二色譜峰的平均寬度。用R表示：分離度.峰寬Wb：色譜峰拐點(diǎn)處的兩條切線與基線的兩個(gè)交點(diǎn)之間的距離；96定性時(shí)要求：R=1.0（相鄰兩峰分離程度98%）定量時(shí)要求：R=1.5（相鄰兩峰分離程度99.7%，基線分離，作為完全分離的標(biāo)準(zhǔn)）。一般將R≥1作為色譜能較好分離的判據(jù)。.定性時(shí)要求：R=1.0（相鄰兩峰分離程度98%）.97柱效率實(shí)際工作中，塔板數(shù)的計(jì)算用下列公式：

而理論塔板數(shù)的計(jì)算公式為：

n=L/H

其中L為色譜柱的柱長；H為理論板高度。.柱效率.98

考慮到組分在死時(shí)間內(nèi)不參與柱內(nèi)分配，用調(diào)整保留時(shí)間代替保留時(shí)間，得有效塔板數(shù)和有效塔板高度：.考慮到組分在死時(shí)間內(nèi)不參與柱內(nèi)分配，用調(diào)整保留時(shí)間代995.色譜分離的應(yīng)用色譜法的應(yīng)用可以根據(jù)目的分為分析性色譜和制備性色譜兩大類。分析性色譜的目的是定量或者定性測定混合物中各組分的性質(zhì)和含量。定性的分析性色譜有薄層色譜、紙色譜等，定量的分析性色譜有氣相色譜、高效液相色譜等。制備性色譜的目的是分離混合物，獲得一定數(shù)量的純凈組分。.5.色譜分離的應(yīng)用色譜法的應(yīng)用可以根據(jù)目的分為分析性色譜和制1005.色譜分離的應(yīng)用薄層色譜（TLC）氣相色譜法（GC）高效液相色譜（HPLC）典型制備色譜.5.色譜分離的應(yīng)用薄層色譜（TLC）.1011938年俄國人首先實(shí)現(xiàn)了在氧化鋁薄層上分離一種天然藥物。1965年德國化學(xué)家Stahl出版了“薄層色譜法”一書，推動(dòng)了這一技術(shù)的發(fā)展。因TLC法設(shè)備簡單，分析速度快，分離效率高，結(jié)果直觀，很快被用作定性和半定量的方法。70年代中后期發(fā)展了高效薄層色譜。80年代以后發(fā)展了薄層色譜光密度掃描儀，和各步操作的儀器化，并實(shí)現(xiàn)了計(jì)算機(jī)化。薄層層析流動(dòng)相的移動(dòng)是依靠毛細(xì)作用。薄層色譜（TLC）.1938年俄國人首先實(shí)現(xiàn)了在氧化鋁薄層上分離一種天然藥物。1102..103比移值（Rf值）:用來表征斑點(diǎn)位置的基本參數(shù)是保留因子，通常稱作比移值，用Rf表示。.比移值（Rf值）:用來表征斑點(diǎn)位置的基本參數(shù)是保.104顯色方法日光下觀察,劃出有色物質(zhì)的斑點(diǎn)位置在紫外燈下(254nm或365nm),觀察有無熒光的產(chǎn)生,用硅膠G板熒光淬滅法,適用于有紫外吸收的物質(zhì)，用GF254板顯色劑顯色,破壞性檢出方法.顯色方法日光下觀察,劃出有色物質(zhì)的斑點(diǎn)位置.105常用顯色劑硫酸硫酸-水；硫酸-甲醇/乙醇；0.5%碘的氯仿溶液對(duì)很多化合物顯黃棕色中性0.05%高錳酸鉀溶液易還原性化合物在淡紅色背景上顯黃色堿性高錳酸鉀試劑還原性化合物在淡紅色背景上顯黃色.常用顯色劑硫酸硫酸-水；硫酸-甲醇/乙醇；.106優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡單、操作方便、運(yùn)行費(fèi)用低；分離時(shí)間短，工作效率高；展開劑選擇范圍廣，展開方式多樣；顯色方便，檢測手段豐富；既可分析，又可制備；試樣一般不需要經(jīng)過嚴(yán)格預(yù)處理即可分離。

缺點(diǎn)：

分離效率較低；不適用揮發(fā)性試樣分離；定性定量不便。.優(yōu)點(diǎn)：.107

TLC的應(yīng)用1.用于柱層析后相同組分的合并2.有機(jī)合成監(jiān)控反應(yīng)，摸索最佳條件3.制備有機(jī)化合物4.中藥材的鑒定在中華人民共和國藥典中，共有超過約600種化學(xué)合成藥和超過約400種中藥的質(zhì)量控制應(yīng)用了高效液相色譜的方法。

.TLC的應(yīng)用1.用于柱層析后相同組分的合并.1085.色譜分離的應(yīng)用薄層色譜（TLC）氣相色譜法（GC）高效液相色譜（HPLC）典型制備色譜.5.色譜分離的應(yīng)用薄層色譜（TLC）.1091953年阿切爾·馬丁和A.T.詹姆斯發(fā)明了氣相色譜法。.1953年阿切爾·馬丁和A.T.詹姆斯發(fā)明了氣相色譜法。.110GC：以氣體（即載氣）為流動(dòng)相的柱色譜分離技術(shù)。GC中常用作的載氣的氣體有N2、He、H2、Ar，均為惰性氣體。GC載氣的功能僅僅是攜帶試樣、洗脫組分。GC的選擇性主要取決于固定相和組分分子間的作用，所以可通過改變固定相來改變GC的選擇性。氣相色譜儀-GC.GC：以氣體（即載氣）為流動(dòng)相的柱色譜氣相色譜儀-GC.111氣相色譜儀流程（圖）氣路系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)（色譜柱系統(tǒng)）檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理和控制系統(tǒng)（含溫控系統(tǒng)）.氣相色譜儀流程（圖）氣路系統(tǒng).112樣品進(jìn)樣汽化色譜柱分離檢測器信號(hào)記錄載氣.樣品進(jìn)樣汽化色譜柱分離檢測器信號(hào)記錄載氣.113進(jìn)樣系統(tǒng)由進(jìn)樣器和氣化室構(gòu)成。液體樣品—微量注射器氣體樣品—六通閥、微量注射器氣化室溫度：要保證樣品瞬間、完全氣化，一般高于沸點(diǎn)50℃以上，但也不宜太高，以防分解.進(jìn)樣系統(tǒng)由進(jìn)樣器和氣化室構(gòu)成。.114柱溫的選擇柱溫應(yīng)低于固定液的最高使用溫度；柱溫過高，易造成固定液流失、檢測器噪聲變大、基線漂移。柱溫一般選擇接近或略高于組分的平均沸點(diǎn)。降低柱溫可在一定程度內(nèi)改善分離；升高柱溫可加快分析速度。組分復(fù)雜，沸程寬（80-100℃）的試樣，采用程序升溫。.柱溫的選擇柱溫應(yīng)低于固定液的最高使用溫度；柱溫過高，易造成固115對(duì)檢測器的要求穩(wěn)定性好、噪聲低；靈敏度高；線性范圍寬；死體積小，響應(yīng)快.對(duì)檢測器的要求穩(wěn)定性好、噪聲低；.116噪聲和漂移噪聲（N）：在沒有樣品進(jìn)入檢測器時(shí)，基線在短期內(nèi)發(fā)生的波動(dòng)。噪聲的來源：固定液的流失、載氣的不純，電子元件不穩(wěn)定、溫度變化、外磁場干擾等?；€漂移：基線在一定時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的單向、緩慢移動(dòng)。良好的檢測器其噪聲與漂移都應(yīng)很小。.噪聲和漂移噪聲（N）：在沒有樣品進(jìn)入檢測器時(shí)，基線在短期內(nèi)117GC的特點(diǎn)1.優(yōu)點(diǎn)分離效率高（填充柱上千塊塔板）分析速度快樣品用量少（檢測限低，高靈敏檢測器）2.缺點(diǎn)：（約20%樣品適用）樣品須能氣化（350℃下有一定的揮發(fā)性）熱穩(wěn)定性要好定性困難.GC的特點(diǎn)1.優(yōu)點(diǎn).1185.色譜分離的應(yīng)用薄層色譜（TLC）氣相色譜法（GC）高效液相色譜（HPLC）典型制備色譜.5.色譜分離的應(yīng)用薄層色譜（TLC）.119高效液相色譜儀高效液相色譜是20世紀(jì)60年代末發(fā)展的一種以液體為流動(dòng)相的色譜技術(shù)。特點(diǎn)如下：高壓一般可達(dá)（150~350）×105Pa高速一般可達(dá)1~10mL/min高效高靈敏度分析時(shí)使用樣品少一般僅幾毫升.高效液相色譜儀高效液相色譜是20世紀(jì)60年代末發(fā)展的一種以液120高效液相色譜儀流程（圖）1．貯液罐（濾棒，可濾去顆粒狀物質(zhì)）2．高壓泵（輸液泵）3．進(jìn)樣裝置4．色譜柱——分離5．檢測器——分析6．廢液出口或組分收集器7．記錄裝置.高效液相色譜儀流程（圖）1．貯液罐（濾棒，可濾去顆粒狀物質(zhì)）121貯液器高壓泵梯度洗脫裝置進(jìn)樣器色譜柱記錄儀數(shù)據(jù)處理機(jī)檢測器組分收集器試樣壓力表輸液系統(tǒng).貯液器高壓泵梯度洗脫進(jìn)樣器色記錄儀檢測器組分試樣壓輸液系統(tǒng).122流動(dòng)相脫氣的方法超聲波振蕩脫氣惰性氣體鼓泡吹掃脫氣在線（真空）脫氣.流動(dòng)相脫氣的方法超聲波振蕩脫氣.123HPLC用水專門的純水機(jī)或超純水機(jī)；二次或三次重蒸水；市場上瓶裝的純凈水或蒸餾水；其它途徑；.HPLC用水專門的純水機(jī)或超純水機(jī)；.124流動(dòng)相溶劑的要求溶劑對(duì)于待測樣品必須具有合適的極性和良好的選擇性。溶劑要與檢測器匹配對(duì)于紫外吸收檢測器，應(yīng)注意選用檢測器波長比溶劑的紫外截止波長要長。對(duì)于折光率檢測器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動(dòng)相，以達(dá)最高靈敏度。高純度由于高效液相靈敏度高，對(duì)流動(dòng)相溶劑的純度也要求高。化學(xué)穩(wěn)定性好低粘度若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙睛等。.流動(dòng)相溶劑的要求溶劑對(duì)于待測樣品必須具有合適的極性和良好125洗脫方式等度洗脫用恒定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫梯度洗脫在一個(gè)分析周期內(nèi)，按一定程序不斷改變流動(dòng)相的濃度配比。優(yōu)點(diǎn)：縮短分析周期；提高分離效果；改善峰形；增加檢測靈敏度。缺點(diǎn)：有時(shí)引起基線漂移；重復(fù)性不佳。.洗脫方式等度洗脫.126HPLC色譜柱類型類型內(nèi)徑D(cm)柱長(cm)粒徑(μm)分析柱0.3–0.463-253-10半制備柱0.8–1.010-255-20制備柱2.0–5.010-255-20.HPLC色譜柱類型類型內(nèi)徑D(cm)柱長(cm127化學(xué)鍵合相利用化學(xué)反應(yīng)將不同的有機(jī)官能團(tuán)通過共價(jià)鍵鍵合到載體硅膠表面的游離羥基上而形成的固定相。種類非極性鍵合相：如鍵合C18、C8、苯基等，其中十八烷（ODS或C18）鍵合相是常用的代表，可完成HPLC分析任務(wù)的80%。中等極性鍵合相：如鍵合醚基，可分離能形成氫鍵的化合物（如酚類）.化學(xué)鍵合相利用化學(xué)反應(yīng)將不同的有機(jī)官能團(tuán)通過共價(jià)鍵鍵.128評(píng)價(jià)色譜柱好壞的標(biāo)準(zhǔn)1）理論塔板數(shù)n2）拖尾因子Tf3)色譜柱批與批之間的重現(xiàn)性4）pH值的適用范圍5）使用壽命.評(píng)價(jià)色譜柱好壞的標(biāo)準(zhǔn)1）理論塔板數(shù)n.129拖尾因子Tf不對(duì)稱因子(As)=BAA拖尾因子(Tf)=A+B2A10%峰高5%峰高.拖尾因子Tf不對(duì)稱因子(As)BAA拖尾因子(Tf)A130對(duì)理想檢測器的要求高靈敏度；適用范圍廣，對(duì)所有組分都有響應(yīng)；溫度、流動(dòng)相流速的變化對(duì)響應(yīng)沒有影響；可梯度洗脫，響應(yīng)與流動(dòng)相的組成無關(guān)；死體積??；使用方便、可靠、耐用；線性范圍寬；響應(yīng)時(shí)間快；.對(duì)理想檢測器的要求高靈敏度；.131常用檢測器紫外檢測器（UV）熒光檢測器（FD）示差折光檢測器（RID）蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）.常用檢測器紫外檢測器（UV）.132紫外檢測器（UV）配置最普遍；主要用于檢測具有π-π、p–π共軛結(jié)構(gòu)的化合物，如芳烴、稠環(huán)芳烴等；靈敏度高；可用于梯度洗脫

缺點(diǎn)：只能檢測有紫外吸收的樣品；（衍生化解決）對(duì)流動(dòng)相的選擇有一定的限制；（截止波長）.紫外檢測器（UV）配置最普遍；.133熒光檢測器（FD）適用于能產(chǎn)生熒光的化合物；主要用于氨基酸、多環(huán)芳烴等樣品；靈敏度極高（比紫外高1~3個(gè)數(shù)量級(jí)），適用于痕量分析；可梯度洗脫

缺點(diǎn)：許多化合物不產(chǎn)生熒光（可衍生化解決）；.熒光檢測器（FD）適用于能產(chǎn)生熒光的化合物；.134示差折光檢測器（RID）通用性好；對(duì)糖類分析靈敏度尚可；缺點(diǎn)：靈敏度低（比紫外低3個(gè)數(shù)量級(jí)）；不能梯度洗脫（否則，基線會(huì)漂移）.示差折光檢測器（RID）通用性好；.135蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）20世紀(jì)90年代新開發(fā)；是示差折光檢測器的理想替代品，對(duì)葡萄糖最小檢出