DNA甲基化與癌癥課件

表觀遺傳學(xué)與DNA甲基化DNA甲基化的檢測手段DNA甲基化與癌癥表觀遺傳學(xué)與DNA甲基化1一、表觀遺傳學(xué)與DNA甲基化一、表觀遺傳學(xué)與DNA甲基化2DNA甲基化與癌癥課件3基因型相同現(xiàn)象1：一個生物體的不同組織基因表達模式截然不同表達模式迥異基因型相同現(xiàn)象1：表達模式迥異4現(xiàn)象2：

同卵雙生的孿生子具有完全相同的基因組。但

他們往往在長大成人后在性格、健康方面往往

存在很大差異。

現(xiàn)象2：

同卵雙生的孿生子具有完全相同的基因組。但

他們往往5

現(xiàn)象3：腫瘤抑制基因被過量地甲基化而導(dǎo)致失去活性，而基因的DNA序列并不發(fā)生變化。

現(xiàn)象3：6現(xiàn)象4：

橘生淮南則為橘，生于淮北則為枳，葉徒相似，

其實味不同。同一種水果，在不同產(chǎn)地生長，其味道，大小，外觀可能相差很遠(yuǎn)。

現(xiàn)象4：

橘生淮南則為橘，生于淮北則為枳，葉徒相似，

其實味7Basketballplayer？Singer？President？TVhost？如果他們出生在不同的地方…Basketballplayer？Singer？Pres8基因環(huán)境表型表觀遺傳學(xué)基因環(huán)境表型表觀遺傳學(xué)9相同的基因型不同的表型

?

相同的基因型不同的表型?10

什么是表觀遺傳學(xué)？表觀遺傳學(xué)：

基因序列無變化

基因功能發(fā)生變化可遺傳并且是可逆的表觀遺傳學(xué)機制：

DNA甲基化組蛋白修飾RNA調(diào)控（RNA干擾，microRNA,longnon-codingRNA等)DNA甲基化與癌癥課件11表觀遺傳學(xué)/Epigenetics

基因型不變的情況下，影響表型并能遺傳的現(xiàn)象，稱為表觀遺傳或后生遺傳。表觀遺傳學(xué)研究的是在基因組DNA序列不變的情況下，在表型上具有的穩(wěn)定的、可遺傳(或潛在的可遺傳性)的變化。定義‘Epi’genetics-‘On’or‘over’thegeneticinformationencodedintheDNA表觀遺傳學(xué)/Epigenetics基因型不變的情況下，12在細(xì)胞基因組上存在兩類信息：

A-遺傳學(xué)信息

B-表觀遺傳學(xué)信息前者——維持細(xì)胞活性功能工廠的所有物質(zhì)材料后者——怎么建、何時建、在哪建的附加信息基因組不僅僅是序列包含遺傳信息，而且其修飾也可以記載遺傳信息。在細(xì)胞基因組上存在兩類信息：基因組不僅僅是序列包含遺傳信息，13DNAsequencecodingEpigeneticprogramming表觀遺傳的特點：廣泛，多樣，復(fù)雜DNAsequencecodingEpigenetic14DNA甲基化

染色質(zhì)重塑

RNA調(diào)控（RNA干擾，

非編碼RNA:microRNA,longnon-codingRNA等)表觀遺傳學(xué)目前的主要研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化表觀遺傳學(xué)目前的主要研究發(fā)現(xiàn)15細(xì)胞命運個體發(fā)育疾病發(fā)生表觀遺傳調(diào)控基因選擇表達表觀遺傳學(xué)基因表達前的調(diào)控：DNA甲基化、基因印記、染色質(zhì)重塑基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控：ncRNA、miRNA、反義寡核苷酸、核糖開關(guān)RNA蛋白翻譯后的修飾：組蛋白的甲基化和乙?；⒎墙M蛋白的共價修飾細(xì)胞命運個體發(fā)育疾病發(fā)生表觀遺傳調(diào)控基因選擇表達表觀16DNA甲基化組蛋白翻譯后修飾RNA機制DNA甲基化組蛋白翻譯后修飾RNA機制17甲基化是指從活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上將甲基催化轉(zhuǎn)移到其他化合物的過程,可形成各種甲基化合物，或是對某些蛋白質(zhì)或核酸等進行化學(xué)修飾形成甲基化產(chǎn)物。在生物系統(tǒng)內(nèi)，甲基化是經(jīng)酶催化的，這種甲基化涉及基因表達的調(diào)控、蛋白質(zhì)功能的調(diào)節(jié)以及核糖核酸(RNA)加工。甲基化甲基化是指從活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上將甲基催18DNA甲基化的概念及機理1950年，Wyatt在Nature上首次指出測序結(jié)果表明DNA可能存在第5堿基。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶：DNMT胞嘧啶：Cytosine5’-甲基胞嘧啶：5-MethylctosineS-腺苷-甲硫氨酸：SAMS-腺苷-高半胱氨酸：SAHDNA甲基化的概念及機理1950年，Wyatt在Natur19DNMTs活性甲基化合物DNA甲基化可以發(fā)生在腺嘌呤的N-6位、胞嘧啶的N-4位、鳥嘌呤的N-7位或胞嘧啶的C-5位等。但在哺乳動物中DNA甲基化主要發(fā)生在5’-CpG-3’的C上生成5-甲基胞嘧啶DNA甲基化（DNAmethylation）DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的作用下，將一個甲基添加在DNA分子中的堿基上，最常見的是加在胞嘧啶上，由此形成5-甲基胞嘧啶（5mC）。DNMTs活性甲基化合物DNA甲基化（DNAmethyla20DNA甲基化位點CpG島或富含CpG島的區(qū)域CpG雙核苷酸在人類基因組中的分布很不均一，而在基因組的某些區(qū)段，CpG保持或高于正常概率，這些區(qū)段被稱作CpG島。CCAGGCCTGGCCTTGACAGGCGGGCGGAGCAGCCAGTGCGAGACAGGGAGGCCGGTGCGGGTGCGGGAACCTGATCCGGAGGCGGGGGCGGGGCGGGGGCGCAGCGCGCGGGGAGGGGCCGGCGCCCGCCTTCCTCCCCGGGGCCCTCCGGCGTCTGCACTGCAGGAGCGCGGGCGCGGCGCCCCAGCCAGCGCGCAGGGCCCGGGCCCCGCCGGGGGCGCTTCCTCGCCCCGCGCGACCCGCTGCpG島特征：A、CpG島主要位于基因的啟動子區(qū)，部分位于基因的第一個外顯子區(qū)；B、CpG島甲基化可以直接導(dǎo)致相關(guān)基因的表觀遺傳學(xué)沉默。DNA甲基化位點CpG島或富含CpG島的區(qū)域21高等生物基因組甲基化特點1）廣泛性

2）可遺傳性

3）可逆性

4）組織特異性高等生物基因組甲基化特點1）廣泛性22CpG島(CpGislands)

在結(jié)構(gòu)基因5’端附近的調(diào)控區(qū)段，CG二聯(lián)核苷常常以成簇串聯(lián)的形式排列，含量大于50%。

預(yù)測軟件

http://pbil.univ-lyon1.fr/software/cpgprod_query.html

http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/廣泛性CpG島(CpGislands)廣泛性23可遺傳性可遺傳性24DNA修復(fù)基因表達的調(diào)節(jié)癌基因代謝

凋亡分化細(xì)胞周期DNA甲基化DNA甲基化的功能DNA修復(fù)基因表達的調(diào)節(jié)癌基因代謝凋亡分化細(xì)胞周期DNA25DNA甲基化的生物學(xué)意義DNA甲基化直接影響基因的活化狀態(tài)DNA甲基化的生物學(xué)意義在于：A、基因表達的時空調(diào)控B、保護基因組的穩(wěn)定性表現(xiàn)：基因在不同時期不同身體部位特異表達I. 有些基因在發(fā)育早期甲基化II. 發(fā)育晚期被誘導(dǎo)去甲基化III. 管家基因低甲基化IV. 印記基因高甲基化DNA甲基化的生物學(xué)意義DNA甲基化直接影響基因的活化狀態(tài)26CpG甲基化與轉(zhuǎn)錄活性成反比CpG島的數(shù)目與基因密度相關(guān)人類基因組甲基化情況1%-2%的人類基因組是CpG群人類基因組CpG島約為28890個平均值為每Mb含10.5個CpG島80%-90%的CpG位點已被甲基化CpG甲基化與轉(zhuǎn)錄活性成反比人類基因組甲基化情況27一、DNA甲基化干擾轉(zhuǎn)錄因子對DNA元件的識別與結(jié)合序列特異性的甲基化DNA結(jié)合蛋白與啟動子區(qū)甲基化CpG島結(jié)合，募集組蛋白去乙酰化酶（HDAC），形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，阻止轉(zhuǎn)錄因子與啟動子區(qū)靶序列的結(jié)合，從而影響基因的轉(zhuǎn)錄。DNA甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的機制沒有甲基化基因表達基因啟動子區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合不能結(jié)合甲基化基因不表達甲基化一、DNA甲基化干擾轉(zhuǎn)錄因子對DNA元件的識別與結(jié)合序列特異28二、序列特異性的甲基化DNA結(jié)合蛋白與啟動子區(qū)甲基化CpG島結(jié)合，募集組蛋白去乙?；福℉DAC），形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，阻止轉(zhuǎn)錄因子與啟動子區(qū)靶序列的結(jié)合，從而影響基因的轉(zhuǎn)錄。DNA甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的機制Sin3AMeCP2啟動子基因轉(zhuǎn)錄因子基因表達啟動子基因基因不表達二、序列特異性的甲基化DNA結(jié)合蛋白與啟動子區(qū)甲基化CpG島29染色質(zhì)構(gòu)型的變化伴隨組蛋白的乙?；腿ヒ阴；?，以調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的開關(guān)。DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達。三、DNA甲基化通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)抑制基因表達DNA甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的機制染色質(zhì)構(gòu)型的變化伴隨組蛋白的乙酰化和去乙?；?，以調(diào)控基因轉(zhuǎn)30二、DNA甲基化的檢測手段二、DNA甲基化的檢測手段31亞硫酸氫鹽測序的原理亞硫酸氫鹽測序的原理321.直接測序法1.直接測序法331.直接測序法1.直接測序法34

注：A：癌組織；B：癌旁組織；○-：未甲基化；●：甲基化43A43BM43AE43A43BE43B(369bp)43B2.重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后PCR克隆測序注：A：癌組織；B：癌旁組織；○352.重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后PCR克隆測序2.重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后PCR克隆測序363.甲基化特異性PCR3.甲基化特異性PCR373.甲基化特異性PCRUMUMUMladder100150200250MSP法檢測抑癌基因RASSF1A啟動子區(qū)的甲基化圖MSP檢測組織切片DNA甲基化狀態(tài)電泳圖片甲基化特異性PCR（MSP）結(jié)果，U為非甲基化，M為甲基化。3.甲基化特異性PCRUM384.結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法4.結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法395.基于限制性內(nèi)切酶的甲基化分析方法5.基于限制性內(nèi)切酶的甲基化分析方法406.基于親和純化的甲基化分析方法6.基于親和純化的甲基化分析方法41三、DNA甲基化與癌癥三、DNA甲基化與癌癥42DNA甲基化與癌癥DNA甲基化與癌癥的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，DNA甲基化改變包括高甲基化和去（低）甲基化。對不同腫瘤細(xì)胞的DNA分析表明，癌變細(xì)胞中出現(xiàn)基因突變的概率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于預(yù)期，與基因突變相比，DNA甲基化改變在細(xì)胞惡變過程中可能發(fā)揮了更大的作用。DNA甲基化與癌癥DNA甲基化與癌癥的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系43DNA甲基化與癌癥的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系高甲基化抑癌基因沉默低甲基化原癌基因被激活CpG島DNA甲基化與癌癥的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系高甲44抑癌基因高甲基化在腫瘤細(xì)胞中，抑癌基因啟動子區(qū)域的CpG島處于高甲基化狀態(tài)，因而抑癌基因沉默，使得細(xì)胞脫離正常的細(xì)胞周期，進入腫瘤發(fā)生過程。原癌基因激活正常細(xì)胞中，由于甲基化作用原癌基因多處于沉默狀態(tài)，但在多種腫瘤細(xì)胞中，均發(fā)現(xiàn)原癌基因處于低甲基化狀態(tài)，并且低甲基化狀態(tài)與其蛋白表達升高密切相關(guān)，表明低甲基化狀態(tài)可使原癌基因激活。

抑癌基因高甲基化在腫瘤細(xì)胞中，抑癌基因啟動子區(qū)域的CpG島處45腫瘤細(xì)胞的特性：現(xiàn)在認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞具有以下特征: 1.逃避細(xì)胞死亡(resistingcelldeath) 2.對生長抑制信號不敏感(evadinggrowthsuppressors) 3.誘導(dǎo)新血管生成(inducingangiogenesis) 4.無限的復(fù)制潛能(enablingreplicativeimmortality) 5.組織浸潤和轉(zhuǎn)移(activatinginvasionandmetastasis) 6.持續(xù)的增殖信號(sustainingproliferativesignaling)另外，近年的研究又提出了新的兩點:能量代謝的改變(reprogrammingofenergymetabolism)和逃避免疫系統(tǒng)的破壞(evadingimmunedestruction)以上幾點在細(xì)胞發(fā)生癌變的過程中有著重要的意義.近年來的研究發(fā)現(xiàn)，特定基因的DNA高甲基化在這些過程中均發(fā)揮重要作用.腫瘤細(xì)胞的特性：現(xiàn)在認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞具有以下特征:461.逃避細(xì)胞死亡通常情況下，細(xì)胞在接觸抑制、輻射、凋亡信號分子等刺激時會發(fā)生凋亡，但是癌細(xì)胞卻可以不受凋亡的控制，而大量分裂增殖.例如，p53基因是一個重要的抑癌基因，可以促使損傷細(xì)胞發(fā)生凋亡.50%的癌癥中存在p53基因的突變失活.p53基因編碼區(qū)的甲基化狀態(tài)容易因為脫氨基作用發(fā)生5mC->T的轉(zhuǎn)換.同時，INK4a/ARF基因啟動子區(qū)域的甲基化可以使表達下降，導(dǎo)致原來受抑制的MDM2表達上升，MDM2進而結(jié)合p53并使后者發(fā)生蛋白質(zhì)水平的降解，使細(xì)胞逃避p53引起的凋亡圈.DNA高甲基化與癌癥1.逃避細(xì)胞死亡通常情況下，細(xì)胞在接觸抑制、輻射、凋亡信號472.對生長抑制信號不敏感細(xì)胞生長抑制因子對細(xì)胞生長的調(diào)控存在多種機制。在丙肝病毒感染的肝細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)了丙肝病毒的核心蛋白(coreprotein)可引起p16基因啟動子的甲基化，p16表達水平下降從而促進了細(xì)胞的分裂，在丙肝誘導(dǎo)的肝癌中起著重要的作用DNA高甲基化與癌癥2.對生長抑制信號不敏感細(xì)胞生長抑制因子對細(xì)胞生長的調(diào)控存在483.誘導(dǎo)新血管生成新血管的生成是癌癥發(fā)生中重要的步驟.新血管生成首先需要金屬蛋白酶分解細(xì)胞外基質(zhì)，再通過血管內(nèi)皮生長因子來誘導(dǎo)血管生成。組織金屬蛋白酶抑制劑可以抑制金屬蛋白酶的活性，同時與血管內(nèi)皮生長因子結(jié)合阻止血管生成。腫瘤細(xì)胞中組織金屬蛋白酶抑制劑的下調(diào)有一部分原因是由于啟動子區(qū)域的甲基化引起的.血小管反應(yīng)蛋白（TSP1）是另一個抑制血管生成的蛋白，TSP1基因啟動子區(qū)域甲基化引起基因表達抑制，進而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生過程中細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)和血管生成.DNA高甲基化與癌癥3.誘導(dǎo)新血管生成新血管的生成是癌癥發(fā)生中重要的步驟.新血管494.無限的復(fù)制潛能癌細(xì)胞無限的復(fù)制潛能主要與端粒酶活性的升高有關(guān)。端粒酶可以利用RNA逆轉(zhuǎn)錄DNA，解決DNA復(fù)制時末端缺失的問題。正常情況下端粒酶只有在受精卵和十細(xì)胞中才有活性，而腫瘤細(xì)胞大多具有高活性的端粒酶。端粒酶的重要組成部分是人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶。它的活性與端粒酶活性高度相關(guān).引起人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶激活的啟動子甲基化有位置特異性，即與啟動子特定部位的甲基化及相關(guān)區(qū)域整體的非甲基化相關(guān)。DNA高甲基化與癌癥4.無限的復(fù)制潛能癌細(xì)胞無限的復(fù)制潛能主要與端粒酶活性的升高505.組織浸潤和轉(zhuǎn)移組織浸潤和轉(zhuǎn)移是細(xì)胞惡變的重要特征，近年來這力一面的研究進展迅速.細(xì)胞骨架的異常調(diào)節(jié)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。DFNAS是一個新發(fā)現(xiàn)的乳腺癌相關(guān)基因.DFNAS可以促進細(xì)胞凋亡，而DFNA基因啟動子甲基化后的表達抑制導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移幾率增大DNA高甲基化與癌癥5.組織浸潤和轉(zhuǎn)移組織浸潤和轉(zhuǎn)移是細(xì)胞惡變的重要特征，近年來516.持續(xù)的增殖信號大部分的癌細(xì)胞不需要外界的生長刺激因子的作用就可以完成增殖，原因是細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)生了變化，導(dǎo)致促增殖因子作用的增強。在結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞中SFRPs的啟動子區(qū)域的高甲基化使其表達抑制，引起了Wnt通路的過度激活而刺激細(xì)胞分裂，因而細(xì)胞在不需要外界生長刺激因子的作用下就可以不斷增殖。DNA高甲基化與癌癥6.持續(xù)的增殖信號大部分的癌細(xì)胞不需要外界的生長刺激因子的作52與癌癥發(fā)生過程中DNA的甲基化不同，DNA的低甲基化既包括特定基因(主要是原癌基因)的低甲基化，還包括基因組范圍內(nèi)以非編碼重復(fù)序列為主的DNA整體水平的低甲基化.DNA低甲基化與癌癥與癌癥發(fā)生過程中DNA的甲基化不同，DNA的低甲基化既包括特531.特定基因的甲基化水平降低CT(cancer/testisantigengenes)抗原屬于MACE(melanomaandgermcellexpressed)基因家族，正常情況下只在生殖細(xì)胞表達。CT抗原在多種腫瘤組織中高表達，如肺癌，胰腺癌，胃癌等。CT激活與它的啟動子區(qū)域的去甲基化相關(guān)。近年來，白血病基因，乳腺癌基因，結(jié)腸直腸癌，腎細(xì)胞癌基因肝癌基因中都發(fā)現(xiàn)了由啟動子低甲基化所引起的腫瘤相關(guān)基因的過表達.DNA低甲基化與癌癥1.特定基因的甲基化水平降低CT(cancer/te542.基因組范圍整體DNA甲基化的降低基因組范圍DNA甲基化的程度可以通過甲基化敏感的DNA酶來檢測。在多種癌癥當(dāng)中都發(fā)現(xiàn)了基因組范圍整體水平的DNA甲基化降低，包括許多重復(fù)序列甲基化水平的下降。正常組織細(xì)胞的甲基胞嘧啶含量約4%，而癌細(xì)胞則為大約2%一3%。DNA甲基化水平的降低可以出現(xiàn)在腫瘤發(fā)生早期階段。腫瘤細(xì)胞在基因缺乏區(qū)域(gene-poorareas)的DNA甲基化水平明顯下降，而基因啟動子區(qū)域的甲基化差異則相對較小，提示這些非編碼區(qū)域的甲基化水平降低可能與腫瘤發(fā)生有更密切的關(guān)系.DNA低甲基化與癌癥2.基因組范圍整體DNA甲基化的降低基因組范圍DNA甲基化的55DNA甲基化與癌癥診斷表觀遺傳學(xué)的改變是細(xì)胞癌變的重要特征之一，因此，細(xì)胞DNA甲基化的變化可以作為癌癥早期診斷的重要依據(jù)。甲基化生物標(biāo)記的不斷發(fā)現(xiàn)使這一技術(shù)在臨床的應(yīng)用成為可能。甲基化特異的PCR技術(shù)(methylation-specificPCRMSP)的出現(xiàn)，使得細(xì)胞DNA甲基化水平的檢測變得十分方便。DNA甲基化檢測穩(wěn)定性好，有組織特異性，易于檢測且其異常程度常與癌癥的進展相關(guān).因此，相對于傳統(tǒng)的基因突變檢測有很大的優(yōu)勢。在許多癌癥中都己經(jīng)發(fā)現(xiàn)了癌癥相關(guān)基因甲基化水平的改變，如外周血細(xì)胞的DNA低甲基化與膀胱癌的發(fā)生密切相關(guān)，隨著全基因組甲基化圖譜的繪制，相信會有更多的甲基化生物標(biāo)記投入到臨床癌癥的診斷中。DNA甲基化與癌癥診斷表觀遺傳學(xué)的改變是細(xì)胞癌變的重要特征之56與基因的突變不同，表觀遺傳學(xué)的改變大都是可逆的，因此，利用藥物來改變細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)狀態(tài)可能是治療癌癥的一條新途徑。目前的甲基化酶抑制劑主要有zebularine和5-ADC。5-ADC在試驗中顯示了對骨髓增生癥、白血病和實體腫瘤都有明顯的療效。Zebularine在小鼠的腸癌模型中能夠明顯減少息肉的數(shù)量。其它的甲基化抑制劑如RG-108，EGCG等在實驗中均表現(xiàn)出了對腫瘤的抑制作用。DNA甲基化抑制劑的研究才剛剛起步，但己表現(xiàn)出巨大的潛力，可以預(yù)想在將來會成為癌癥治療的一個重要方面。DNA甲基化與癌癥的治療與基因的突變不同，表觀遺傳學(xué)的改變大都是可逆的，因此，利用藥57DNA甲基化與癌癥的治療甲基化的過程是可逆的，因此可以甲基化位點為靶點，靶向用藥進行腫瘤的預(yù)防、治療。1、通過去甲基化恢復(fù)某些關(guān)鍵的抑癌基因或DNA修復(fù)基因的活性最多的是DNMTS抑制劑，它通過抑制DNMT活性以逆轉(zhuǎn)異常的DNA甲基化。第一個表型修飾藥物為5-azacytidine(氮雜胞苷)及其類似物5-aza-2'-deoxycytidine（5-aza-CdR）DNA甲基化抑制劑（甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT）：5-氮胞苷、5-氮脫氧胞苷（地西他賓）、假異胞苷與DNMT不可逆共價結(jié)合，抑制其活性，使DNA甲基化隨細(xì)胞分裂進行丟失，部分的逆轉(zhuǎn)腫瘤的惡性表現(xiàn)。聯(lián)合化療：聯(lián)合應(yīng)用甲基化抑制劑5-氮脫氧胞苷和脫乙酰化酶抑制劑苯丁酸，對人肺癌和乳腺癌細(xì)胞有明顯的協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。DNA甲基化與癌癥的治療甲基化的過程是可逆的，因此可以甲基化58DNA甲基化與癌癥的治療2、針對腫瘤相關(guān)癌基因啟動子低甲基化而進行的靶向甲基化治療。DNA介導(dǎo)的DNA甲基化RNA介導(dǎo)的DNA甲基化：雙鏈RNA可以介導(dǎo)啟動子區(qū)域DNA甲基化，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄表達。DNA甲基化與癌癥的治療2、針對腫瘤相關(guān)癌基因啟動子低甲基59總結(jié)越來越多的研究表明，DNA的甲基化異常和癌癥的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系.無論是異常的DNA高甲基化還是低甲基化都會導(dǎo)致基因的表達異常，從而促進了癌癥的發(fā)生。同時，DNA的甲基化改變也為癌癥的診斷和治療提供了一條新的途徑.通過檢測DNA甲基化可以提前發(fā)現(xiàn)癌變;通過糾正DNA甲基化異常則可能逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的惡變.進一步闡明腫瘤細(xì)胞特異DNA甲基化改變的機制及與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，將為最終攻克腫瘤治療難題提供新的思路?？偨Y(jié)越來越多的研究表明，DNA的甲基化異常和癌癥的發(fā)生發(fā)展有60表觀遺傳學(xué)與DNA甲基化DNA甲基化的檢測手段DNA甲基化與癌癥表觀遺傳學(xué)與DNA甲基化61一、表觀遺傳學(xué)與DNA甲基化一、表觀遺傳學(xué)與DNA甲基化62DNA甲基化與癌癥課件63基因型相同現(xiàn)象1：一個生物體的不同組織基因表達模式截然不同表達模式迥異基因型相同現(xiàn)象1：表達模式迥異64現(xiàn)象2：

同卵雙生的孿生子具有完全相同的基因組。但

他們往往在長大成人后在性格、健康方面往往

存在很大差異。

現(xiàn)象2：

同卵雙生的孿生子具有完全相同的基因組。但

他們往往65

現(xiàn)象3：腫瘤抑制基因被過量地甲基化而導(dǎo)致失去活性，而基因的DNA序列并不發(fā)生變化。

現(xiàn)象3：66現(xiàn)象4：

橘生淮南則為橘，生于淮北則為枳，葉徒相似，

其實味不同。同一種水果，在不同產(chǎn)地生長，其味道，大小，外觀可能相差很遠(yuǎn)。

現(xiàn)象4：

橘生淮南則為橘，生于淮北則為枳，葉徒相似，

其實味67Basketballplayer？Singer？President？TVhost？如果他們出生在不同的地方…Basketballplayer？Singer？Pres68基因環(huán)境表型表觀遺傳學(xué)基因環(huán)境表型表觀遺傳學(xué)69相同的基因型不同的表型

?

相同的基因型不同的表型?70

什么是表觀遺傳學(xué)？表觀遺傳學(xué)：

基因序列無變化

基因功能發(fā)生變化可遺傳并且是可逆的表觀遺傳學(xué)機制：

DNA甲基化組蛋白修飾RNA調(diào)控（RNA干擾，microRNA,longnon-codingRNA等)DNA甲基化與癌癥課件71表觀遺傳學(xué)/Epigenetics

基因型不變的情況下，影響表型并能遺傳的現(xiàn)象，稱為表觀遺傳或后生遺傳。表觀遺傳學(xué)研究的是在基因組DNA序列不變的情況下，在表型上具有的穩(wěn)定的、可遺傳(或潛在的可遺傳性)的變化。定義‘Epi’genetics-‘On’or‘over’thegeneticinformationencodedintheDNA表觀遺傳學(xué)/Epigenetics基因型不變的情況下，72在細(xì)胞基因組上存在兩類信息：

A-遺傳學(xué)信息

B-表觀遺傳學(xué)信息前者——維持細(xì)胞活性功能工廠的所有物質(zhì)材料后者——怎么建、何時建、在哪建的附加信息基因組不僅僅是序列包含遺傳信息，而且其修飾也可以記載遺傳信息。在細(xì)胞基因組上存在兩類信息：基因組不僅僅是序列包含遺傳信息，73DNAsequencecodingEpigeneticprogramming表觀遺傳的特點：廣泛，多樣，復(fù)雜DNAsequencecodingEpigenetic74DNA甲基化

染色質(zhì)重塑

RNA調(diào)控（RNA干擾，

非編碼RNA:microRNA,longnon-codingRNA等)表觀遺傳學(xué)目前的主要研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化表觀遺傳學(xué)目前的主要研究發(fā)現(xiàn)75細(xì)胞命運個體發(fā)育疾病發(fā)生表觀遺傳調(diào)控基因選擇表達表觀遺傳學(xué)基因表達前的調(diào)控：DNA甲基化、基因印記、染色質(zhì)重塑基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控：ncRNA、miRNA、反義寡核苷酸、核糖開關(guān)RNA蛋白翻譯后的修飾：組蛋白的甲基化和乙?；⒎墙M蛋白的共價修飾細(xì)胞命運個體發(fā)育疾病發(fā)生表觀遺傳調(diào)控基因選擇表達表觀76DNA甲基化組蛋白翻譯后修飾RNA機制DNA甲基化組蛋白翻譯后修飾RNA機制77甲基化是指從活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上將甲基催化轉(zhuǎn)移到其他化合物的過程,可形成各種甲基化合物，或是對某些蛋白質(zhì)或核酸等進行化學(xué)修飾形成甲基化產(chǎn)物。在生物系統(tǒng)內(nèi)，甲基化是經(jīng)酶催化的，這種甲基化涉及基因表達的調(diào)控、蛋白質(zhì)功能的調(diào)節(jié)以及核糖核酸(RNA)加工。甲基化甲基化是指從活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上將甲基催78DNA甲基化的概念及機理1950年，Wyatt在Nature上首次指出測序結(jié)果表明DNA可能存在第5堿基。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶：DNMT胞嘧啶：Cytosine5’-甲基胞嘧啶：5-MethylctosineS-腺苷-甲硫氨酸：SAMS-腺苷-高半胱氨酸：SAHDNA甲基化的概念及機理1950年，Wyatt在Natur79DNMTs活性甲基化合物DNA甲基化可以發(fā)生在腺嘌呤的N-6位、胞嘧啶的N-4位、鳥嘌呤的N-7位或胞嘧啶的C-5位等。但在哺乳動物中DNA甲基化主要發(fā)生在5’-CpG-3’的C上生成5-甲基胞嘧啶DNA甲基化（DNAmethylation）DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的作用下，將一個甲基添加在DNA分子中的堿基上，最常見的是加在胞嘧啶上，由此形成5-甲基胞嘧啶（5mC）。DNMTs活性甲基化合物DNA甲基化（DNAmethyla80DNA甲基化位點CpG島或富含CpG島的區(qū)域CpG雙核苷酸在人類基因組中的分布很不均一，而在基因組的某些區(qū)段，CpG保持或高于正常概率，這些區(qū)段被稱作CpG島。CCAGGCCTGGCCTTGACAGGCGGGCGGAGCAGCCAGTGCGAGACAGGGAGGCCGGTGCGGGTGCGGGAACCTGATCCGGAGGCGGGGGCGGGGCGGGGGCGCAGCGCGCGGGGAGGGGCCGGCGCCCGCCTTCCTCCCCGGGGCCCTCCGGCGTCTGCACTGCAGGAGCGCGGGCGCGGCGCCCCAGCCAGCGCGCAGGGCCCGGGCCCCGCCGGGGGCGCTTCCTCGCCCCGCGCGACCCGCTGCpG島特征：A、CpG島主要位于基因的啟動子區(qū)，部分位于基因的第一個外顯子區(qū)；B、CpG島甲基化可以直接導(dǎo)致相關(guān)基因的表觀遺傳學(xué)沉默。DNA甲基化位點CpG島或富含CpG島的區(qū)域81高等生物基因組甲基化特點1）廣泛性

2）可遺傳性

3）可逆性

4）組織特異性高等生物基因組甲基化特點1）廣泛性82CpG島(CpGislands)

在結(jié)構(gòu)基因5’端附近的調(diào)控區(qū)段，CG二聯(lián)核苷常常以成簇串聯(lián)的形式排列，含量大于50%。

預(yù)測軟件

http://pbil.univ-lyon1.fr/software/cpgprod_query.html

http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/廣泛性CpG島(CpGislands)廣泛性83可遺傳性可遺傳性84DNA修復(fù)基因表達的調(diào)節(jié)癌基因代謝

凋亡分化細(xì)胞周期DNA甲基化DNA甲基化的功能DNA修復(fù)基因表達的調(diào)節(jié)癌基因代謝凋亡分化細(xì)胞周期DNA85DNA甲基化的生物學(xué)意義DNA甲基化直接影響基因的活化狀態(tài)DNA甲基化的生物學(xué)意義在于：A、基因表達的時空調(diào)控B、保護基因組的穩(wěn)定性表現(xiàn)：基因在不同時期不同身體部位特異表達I. 有些基因在發(fā)育早期甲基化II. 發(fā)育晚期被誘導(dǎo)去甲基化III. 管家基因低甲基化IV. 印記基因高甲基化DNA甲基化的生物學(xué)意義DNA甲基化直接影響基因的活化狀態(tài)86CpG甲基化與轉(zhuǎn)錄活性成反比CpG島的數(shù)目與基因密度相關(guān)人類基因組甲基化情況1%-2%的人類基因組是CpG群人類基因組CpG島約為28890個平均值為每Mb含10.5個CpG島80%-90%的CpG位點已被甲基化CpG甲基化與轉(zhuǎn)錄活性成反比人類基因組甲基化情況87一、DNA甲基化干擾轉(zhuǎn)錄因子對DNA元件的識別與結(jié)合序列特異性的甲基化DNA結(jié)合蛋白與啟動子區(qū)甲基化CpG島結(jié)合，募集組蛋白去乙酰化酶（HDAC），形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，阻止轉(zhuǎn)錄因子與啟動子區(qū)靶序列的結(jié)合，從而影響基因的轉(zhuǎn)錄。DNA甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的機制沒有甲基化基因表達基因啟動子區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合不能結(jié)合甲基化基因不表達甲基化一、DNA甲基化干擾轉(zhuǎn)錄因子對DNA元件的識別與結(jié)合序列特異88二、序列特異性的甲基化DNA結(jié)合蛋白與啟動子區(qū)甲基化CpG島結(jié)合，募集組蛋白去乙?；福℉DAC），形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，阻止轉(zhuǎn)錄因子與啟動子區(qū)靶序列的結(jié)合，從而影響基因的轉(zhuǎn)錄。DNA甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的機制Sin3AMeCP2啟動子基因轉(zhuǎn)錄因子基因表達啟動子基因基因不表達二、序列特異性的甲基化DNA結(jié)合蛋白與啟動子區(qū)甲基化CpG島89染色質(zhì)構(gòu)型的變化伴隨組蛋白的乙?；腿ヒ阴；?，以調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的開關(guān)。DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達。三、DNA甲基化通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)抑制基因表達DNA甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的機制染色質(zhì)構(gòu)型的變化伴隨組蛋白的乙?；腿ヒ阴；?，以調(diào)控基因轉(zhuǎn)90二、DNA甲基化的檢測手段二、DNA甲基化的檢測手段91亞硫酸氫鹽測序的原理亞硫酸氫鹽測序的原理921.直接測序法1.直接測序法931.直接測序法1.直接測序法94

注：A：癌組織；B：癌旁組織；○-：未甲基化；●：甲基化43A43BM43AE43A43BE43B(369bp)43B2.重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后PCR克隆測序注：A：癌組織；B：癌旁組織；○952.重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后PCR克隆測序2.重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后PCR克隆測序963.甲基化特異性PCR3.甲基化特異性PCR973.甲基化特異性PCRUMUMUMladder100150200250MSP法檢測抑癌基因RASSF1A啟動子區(qū)的甲基化圖MSP檢測組織切片DNA甲基化狀態(tài)電泳圖片甲基化特異性PCR（MSP）結(jié)果，U為非甲基化，M為甲基化。3.甲基化特異性PCRUM984.結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法4.結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法995.基于限制性內(nèi)切酶的甲基化分析方法5.基于限制性內(nèi)切酶的甲基化分析方法1006.基于親和純化的甲基化分析方法6.基于親和純化的甲基化分析方法101三、DNA甲基化與癌癥三、DNA甲基化與癌癥102DNA甲基化與癌癥DNA甲基化與癌癥的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，DNA甲基化改變包括高甲基化和去（低）甲基化。對不同腫瘤細(xì)胞的DNA分析表明，癌變細(xì)胞中出現(xiàn)基因突變的概率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于預(yù)期，與基因突變相比，DNA甲基化改變在細(xì)胞惡變過程中可能發(fā)揮了更大的作用。DNA甲基化與癌癥DNA甲基化與癌癥的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系103DNA甲基化與癌癥的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系高甲基化抑癌基因沉默低甲基化原癌基因被激活CpG島DNA甲基化與癌癥的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系高甲104抑癌基因高甲基化在腫瘤細(xì)胞中，抑癌基因啟動子區(qū)域的CpG島處于高甲基化狀態(tài)，因而抑癌基因沉默，使得細(xì)胞脫離正常的細(xì)胞周期，進入腫瘤發(fā)生過程。原癌基因激活正常細(xì)胞中，由于甲基化作用原癌基因多處于沉默狀態(tài)，但在多種腫瘤細(xì)胞中，均發(fā)現(xiàn)原癌基因處于低甲基化狀態(tài)，并且低甲基化狀態(tài)與其蛋白表達升高密切相關(guān)，表明低甲基化狀態(tài)可使原癌基因激活。

抑癌基因高甲基化在腫瘤細(xì)胞中，抑癌基因啟動子區(qū)域的CpG島處105腫瘤細(xì)胞的特性：現(xiàn)在認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞具有以下特征: 1.逃避細(xì)胞死亡(resistingcelldeath) 2.對生長抑制信號不敏感(evadinggrowthsuppressors) 3.誘導(dǎo)新血管生成(inducingangiogenesis) 4.無限的復(fù)制潛能(enablingreplicativeimmortality) 5.組織浸潤和轉(zhuǎn)移(activatinginvasionandmetastasis) 6.持續(xù)的增殖信號(sustainingproliferativesignaling)另外，近年的研究又提出了新的兩點:能量代謝的改變(reprogrammingofenergymetabolism)和逃避免疫系統(tǒng)的破壞(evadingimmunedestruction)以上幾點在細(xì)胞發(fā)生癌變的過程中有著重要的意義.近年來的研究發(fā)現(xiàn)，特定基因的DNA高甲基化在這些過程中均發(fā)揮重要作用.腫瘤細(xì)胞的特性：現(xiàn)在認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞具有以下特征:1061.逃避細(xì)胞死亡通常情況下，細(xì)胞在接觸抑制、輻射、凋亡信號分子等刺激時會發(fā)生凋亡，但是癌細(xì)胞卻可以不受凋亡的控制，而大量分裂增殖.例如，p53基因是一個重要的抑癌基因，可以促使損傷細(xì)胞發(fā)生凋亡.50%的癌癥中存在p53基因的突變失活.p53基因編碼區(qū)的甲基化狀態(tài)容易因為脫氨基作用發(fā)生5mC->T的轉(zhuǎn)換.同時，INK4a/ARF基因啟動子區(qū)域的甲基化可以使表達下降，導(dǎo)致原來受抑制的MDM2表達上升，MDM2進而結(jié)合p53并使后者發(fā)生蛋白質(zhì)水平的降解，使細(xì)胞逃避p53引起的凋亡圈.DNA高甲基化與癌癥1.逃避細(xì)胞死亡通常情況下，細(xì)胞在接觸抑制、輻射、凋亡信號1072.對生長抑制信號不敏感細(xì)胞生長抑制因子對細(xì)胞生長的調(diào)控存在多種機制。在丙肝病毒感染的肝細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)了丙肝病毒的核心蛋白(coreprotein)可引起p16基因啟動子的甲基化，p16表達水平下降從而促進了細(xì)胞的分裂，在丙肝誘導(dǎo)的肝癌中起著重要的作用DNA高甲基化與癌癥2.對生長抑制信號不敏感細(xì)胞生長抑制因子對細(xì)胞生長的調(diào)控存在1083.誘導(dǎo)新血管生成新血管的生成是癌癥發(fā)生中重要的步驟.新血管生成首先需要金屬蛋白酶分解細(xì)胞外基質(zhì)，再通過血管內(nèi)皮生長因子來誘導(dǎo)血管生成。組織金屬蛋白酶抑制劑可以抑制金屬蛋白酶的活性，同時與血管內(nèi)皮生長因子結(jié)合阻止血管生成。腫瘤細(xì)胞中組織金屬蛋白酶抑制劑的下調(diào)有一部分原因是由于啟動子區(qū)域的甲基化引起的.血小管反應(yīng)蛋白（TSP1）是另一個抑制血管生成的蛋白，TSP1基因啟動子區(qū)域甲基化引起基因表達抑制，進而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生過程中細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)和血管生成.DNA高甲基化與癌癥3.誘導(dǎo)新血管生成新血管的生成是癌癥發(fā)生中重要的步驟.新血管1094.無限的復(fù)制潛能癌細(xì)胞無限的復(fù)制潛能主要與端粒酶活性的升高有關(guān)。端粒酶可以利用RNA逆轉(zhuǎn)錄DNA，解決DNA復(fù)制時末端缺失的問題。正常情況下端粒酶只有在受精卵和十細(xì)胞中才有活性，而腫瘤細(xì)胞大多具有高活性的端粒酶。端粒酶的重要組成部分是人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶。它的活性與端粒酶活性高度相關(guān).引起人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶激活的啟動子甲基化有位置特異性，即與啟動子特定部位的甲基化及相關(guān)區(qū)域整體的非甲基化相關(guān)。DNA高甲基化與癌癥4.無限的復(fù)制潛能癌細(xì)胞無限的復(fù)制潛能主要與端粒酶活性的升高1105.組織浸潤和轉(zhuǎn)移組織浸潤和轉(zhuǎn)移是細(xì)胞惡變的重要特征，近年來這力一面的研究進展迅速.細(xì)胞骨架的異常調(diào)節(jié)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。DFNAS是一個新發(fā)現(xiàn)的乳腺癌相關(guān)基因.DFNAS可以促進細(xì)胞凋亡，而DFNA基因啟動子甲基化后的表達抑制導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移幾率增大DNA高甲基化與癌癥5.組織浸潤和轉(zhuǎn)移組織浸潤和轉(zhuǎn)移是細(xì)胞惡變的重要特征，近年來1116.持續(xù)的增殖信號大部分的癌細(xì)胞不需要外界的生長刺激因子的作用就可以完成增殖，原因是細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)生了變化，導(dǎo)致促增殖因子作用的增強。在結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞中SFRPs的啟動子區(qū)域的高甲基化使其表達抑制，引起了Wnt通路的過度激活而刺激細(xì)胞分裂，因而細(xì)胞在不需要外界生長刺激因子的作用下就可以不斷增殖。DNA高甲基化與癌癥6.持續(xù)的增殖信號大部分的癌細(xì)胞不需要外界的生長刺激因子的作112與癌癥發(fā)生過程中DNA的甲基化不同，DNA的低甲基化既包括特定基因(主要是原癌基因)的低甲基化，還包括基因組范圍內(nèi)以非編碼重復(fù)序列為主的DNA整體水平的低甲基化.DNA低甲基化與癌癥與癌癥發(fā)生過程中DNA的甲基化不同，DNA的低甲基化既包括特1131.特定基因的甲基化水平降低CT(cancer/testisantigengenes)抗原屬于MACE(melanomaandgermcellexpressed)基因家族，正常情況下只在生殖細(xì)胞表達。CT抗原在多種腫瘤組織中高表達，如肺癌，胰腺癌，胃癌等。CT激活與它的啟動子區(qū)域的去甲基化相關(guān)。近年來，白血病基因，乳腺癌基因，結(jié)腸直腸癌，腎細(xì)胞癌基因肝癌基因中都發(fā)現(xiàn)了由啟動