核酸檢測實驗室的規(guī)范化管理

關(guān)于核酸檢測實驗室的規(guī)范化管理第一頁，共二十頁，2022年，8月28日一、規(guī)范化設(shè)置及管理第二頁，共二十頁，2022年，8月28日

(一)臨床基因擴增檢驗實驗室區(qū)域設(shè)置原則

1．臨床基因擴增檢驗實驗室原則上分為四個分隔開的工作區(qū)域：試劑貯存和準備區(qū)；標本制備區(qū)；擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)；擴增產(chǎn)物分析區(qū)。（如使用全自動分析儀，區(qū)域可適當合并）

2．各工作區(qū)域必須有明確的標記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用。

3．進入各工作區(qū)域必須嚴格按照單一方向進行，即：試劑貯存和準備區(qū)標本制備區(qū)擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)擴增產(chǎn)物分析區(qū)。

4．不同工作區(qū)域使用不同的工作服(例如不同的顏色)。工作人員離開各工作區(qū)域時，不得將工作服帶出。第三頁，共二十頁，2022年，8月28日（二）工作區(qū)域儀器設(shè)備配置標準

1．試劑貯存和準備區(qū)

2-8℃和-15℃冰箱；混勻器；微量加樣器(覆蓋1--1000μl)；移動紫外燈(近工作臺面)；消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭(帶濾芯)；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品。

2．標本制備區(qū)

1-8℃冰箱、-20℃或-80℃冰箱；高速臺式冷凍離心機；混勻器；水浴箱或加熱模塊；微量加樣器(覆蓋1--1000μl)；可移動紫外燈(近工作臺面)；超凈工作臺；消耗品;

一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭(帶濾芯)；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品；如需處理大分子DNA，應(yīng)備有超聲波水浴儀。第四頁，共二十頁，2022年，8月28日3.擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)

核酸擴增儀；微量加樣器(覆蓋1--1000μl)；可移動紫外燈(近工作臺面)；消耗品（一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭(帶濾芯)；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品.4.擴增產(chǎn)物分析區(qū)基本儀器設(shè)備如下：微量加樣器(覆蓋1--1000μl)；可移動紫外燈；消耗品；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品。

第五頁，共二十頁，2022年，8月28日（三）各區(qū)操作注意事項下述操作在該區(qū)進行：儲存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。在本區(qū)的實驗操作過程中，必須戴手套并經(jīng)常更換。操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施。嚴禁用嘴吸取液體，加樣器和吸頭等必須經(jīng)高壓處理。工作結(jié)束后必須立即對工作區(qū)進行清潔。實驗室及其設(shè)備的使用必須有日常記錄。1.試劑貯存和準備區(qū)第六頁，共二十頁，2022年，8月28日2.標本制備區(qū)

下述操作在該區(qū)進行：標本保存、核酸（RNA、DNA）提取、貯存及其加入至擴增反應(yīng)管和測定RNA時cDNA的合成。為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。對具有潛在傳染危險性的材料，必須有明確的樣本處理和滅活程序。樣本處理對核酸擴增有很大影響，必須使用有效的核酸提取方法。第七頁，共二十頁，2022年，8月28日3.擴增區(qū)下述操作在該區(qū)進行：DNA或RNA擴增。在巢式PCR測定中，通常第一輪擴增后必須打開反應(yīng)管，因此巢式擴增由較高的危險性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進行。不能從本區(qū)再進入任何“上游”區(qū)域，可降低本區(qū)的氣壓以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，盡量減少在本區(qū)的走動。第八頁，共二十頁，2022年，8月28日4.擴增產(chǎn)物分析區(qū)

下述操作在本區(qū)內(nèi)進行：擴增片段的測定。本區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源，因此必須注意避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴增產(chǎn)物帶出。本區(qū)有可能會用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如溴化乙錠、丙稀酰胺、甲醛或同位素等，應(yīng)注意實驗人員的安全防護。本區(qū)如采用負壓或減壓情況下可減少擴增產(chǎn)物從本區(qū)擴散至前面區(qū)域的可能性第九頁，共二十頁，2022年，8月28日二、質(zhì)量保證臨床基因擴增檢驗實驗室質(zhì)量保證涉及到整個基因擴增檢驗所有階段，即測定分析前的標本采集處理、測定中的核酸提取，擴增和產(chǎn)物分析以及測定后的結(jié)果報告等。（一）標本的采集（二）標本的穩(wěn)定化處理（三）標本的運送（四）標本的貯存（五）標本的處理(核酸提取)（六）靶核酸的逆轉(zhuǎn)錄CFIT)和擴增（七）污染（八）擴增產(chǎn)物的分析（九）質(zhì)量控制

第十頁，共二十頁，2022年，8月28日（一）標本的采集

常用于基因擴增檢測的臨床標本包括EDTA或構(gòu)櫞酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿、痰、腦脊液、尿及分泌物等。采血液等樣本時，應(yīng)使用一次性密閉容器，如真空采血管。當使用非密閉采樣系統(tǒng)時，如尿、分泌物和骨髓的采樣，必須注意防止來自采樣者的皮屑或分泌物的污染。采樣時必須戴一次性手套。玻璃器皿在使用前應(yīng)高壓處理。臨床用于RNA（如HCVRNA）擴增檢測的血標本建議進行抗凝處理，并盡快（3小時以內(nèi)）分離血漿，以避免RNA的降解。如未作抗凝處理，則抽血后，必須在1小時內(nèi)分離血清。第十一頁，共二十頁，2022年，8月28日（二）標本的穩(wěn)定化處理

用于DNA擴增檢測的標本，應(yīng)及時送至實驗室。用于RNA測定的標本應(yīng)進行穩(wěn)定化處理，異硫氰酸胍鹽(Guanidinethiocyanate，CITC)可使DNA酶和RNA酶立即失活，因此在采集標本時，可將標本材料如血清或血漿按1：4的比例加至含有5mol／LGITC的試管中，從而使血清(漿)中的RNA酶不可逆失活。第十二頁，共二十頁，2022年，8月28日（三）標本的運送

標本采集后必須盡快送至實驗室。經(jīng)過穩(wěn)定化處理的標本可在常溫下郵寄運送。用于RNA檢測的標本，如果未經(jīng)穩(wěn)定化處理，須速凍后，放在干冰中運送。第十三頁，共二十頁，2022年，8月28日（四）標本的貯存

臨床體液標本如血清／血漿等可于-70℃下長時間貯存。用于DNA測定的已純化核酸樣本可在10mmol／LTris—1mmol／LEDTA緩沖液(pH7.5—8.0)中4℃保存。用于RNA測定的已純化核酸樣本應(yīng)在緩沖液中-80℃或液氮中貯存。用乙醇沉淀的核酸樣本貯存在-20℃即可。用GITC處理的RNA標本在室溫可保存7天。第十四頁，共二十頁，2022年，8月28日（五）標本的處理(核酸提取)

標本處理即核酸提取純化是決定擴增檢測成敗的關(guān)鍵性步驟，在使用商品核酸提取試劑提取臨床標本中的核酸模板前，應(yīng)對其進行充分評價以驗證其提取的有效性。當靶核酸為RNA時，逆轉(zhuǎn)錄PCR測定失敗的常見原因是標本在運送前未經(jīng)充分的穩(wěn)定化處理及核酸提取試劑的RNA酶的污染。故建議使用高質(zhì)量的商品核酸提取試劑。第十五頁，共二十頁，2022年，8月28日（六）靶核酸的逆轉(zhuǎn)錄(RT)和擴增

1．靶RNA的逆轉(zhuǎn)錄下述因素通常影響cDNA合成的效率：(1)逆轉(zhuǎn)錄效率的降低或完全缺乏。其可能的原因有逆轉(zhuǎn)錄酶質(zhì)量不高、試劑降解變質(zhì)或加樣錯誤等；(2)用于逆轉(zhuǎn)錄的標本中存在逆轉(zhuǎn)錄或Taq酶的抑制物(如酚、氯仿、血紅素等)；(3)RNA酶的存在導致RNA的降解。2．核酸的擴增有多種因素可引起核酸擴增檢測的假陽性或假陰性結(jié)果，如擴增靶核酸中抑制劑存在、Taq酶失活、退火溫度不對、Mg2+濃度不佳、患者標本或試劑受污染等。擴增儀孔中熱傳導的均一性極為重要，必須定期對擴增儀的溫度控制和加熱模塊中熱傳導的一致性進行檢查，以避免假陰性結(jié)果。第十六頁，共二十頁，2022年，8月28日（七）污染

在實際工作中，常見有以下幾種污染類型：擴增片段的污染（產(chǎn)物污染）、天然基因組DNA的污染、試劑污染（儲存液或工作液）以及標本間交叉污染（如氣溶膠從一個陽性標本擴散到原本陰性的標本）。臨床基因擴增檢驗實驗室中污染的最主要來源是擴增產(chǎn)物的污染。

1．測定分析前的污染源

2．測定分析階段的污染源

3．污染的避免

工作區(qū)的嚴格劃分的目的即是為了預防污染。為避免以前測定中所產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物的污染，可設(shè)法將其破壞掉。如在擴增反應(yīng)中用dUTP取代部分dTTP，持續(xù)的長波紫外燈照射，不能用其來替代嚴格的實驗室設(shè)置和管理，尤其是這些方法不能防止外來非擴增的天然DNA的污染。

4．去除污染的措施:次氯酸鈉、紫外線照射、高壓消毒第十七頁，共二十頁，2022年，8月28日（八）擴增產(chǎn)物的分析

擴增產(chǎn)物的測定有各種方法，如電泳、限制性酶切、斑點印跡、探針雜交、測序、分光光度法定量等，但臨床PCR檢驗項目基本上都使用探針雜交方法。

雜交檢測時應(yīng)嚴格遵守商品試劑盒確定的雜交程序盒雜交條件。第十八頁，共二十頁，2022年，8月28日（九）質(zhì)量控制

必須對DNA和RNA分析的各步進行質(zhì)量控制，以避免假陽性和假陰性，保證測定結(jié)果的準確性和重復性。由于核酸擴增測定的高敏感性，所以標本制備、逆轉(zhuǎn)錄、擴增本身和產(chǎn)物分析中的每一步都要求有質(zhì)控措施。目前的商品試劑盒大部分沒采用內(nèi)標方法質(zhì)控。因此，在測定血清/血漿病原體核酸如HBVDNA、HCVRNA等時，應(yīng)使用已知的弱陽性血清