植物細(xì)胞培養(yǎng)及次生產(chǎn)物代謝生產(chǎn)

關(guān)于植物細(xì)胞培養(yǎng)及次生產(chǎn)物代謝生產(chǎn)第一頁，共八十一頁，2022年，8月28日一、懸浮培養(yǎng)二、單細(xì)胞培養(yǎng)三、植物細(xì)胞的規(guī)?；囵B(yǎng)及有用物質(zhì)生產(chǎn)第二頁，共八十一頁，2022年，8月28日一、懸浮培養(yǎng)（cellsuspensionculture）懸浮培養(yǎng)是細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法，是將單個(gè)游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。

第三頁，共八十一頁，2022年，8月28日1、愈傷組織誘導(dǎo)

要求：松散性好，增殖快，再生能力強(qiáng)。其外觀一般是鮮艷的乳白或淡黃色，呈細(xì)小顆粒狀，松散易碎。

適于懸浮培養(yǎng)適于再生植株第四頁，共八十一頁，2022年，8月28日如何獲得符合要求的愈傷組織？1、選擇適宜的外植體：胚、胚軸、子葉是最常用的外植體，特別是幼胚。2、選擇適宜的培養(yǎng)基：生長素濃度很重要配合一定濃度的細(xì)胞分裂素；添加附加物。3、愈傷組織要進(jìn)行繼代選擇：選擇疏松性好、細(xì)胞狀態(tài)好的細(xì)胞不斷繼代培養(yǎng)。第五頁，共八十一頁，2022年，8月28日懸浮系建立過程：影響懸浮細(xì)胞生長的因素：1、起始愈傷組織的質(zhì)量2、接種細(xì)胞密度3、培養(yǎng)條件：方式、溫度、4、繼代周期2、懸浮系的建立與繼代培養(yǎng)愈傷組織1g愈傷/10ml培養(yǎng)基150、250ml三角瓶（30、70ml培養(yǎng)基）120rpm,25℃黑暗培養(yǎng),換液1次/3d以防粘稠蔗糖梯度離心或過濾法(淘汰過大或生理狀態(tài)不好的細(xì)胞團(tuán))繼代培養(yǎng)80rpm（懸浮細(xì)胞系穩(wěn)定以后）繼代時(shí)間為1周時(shí)（原懸浮液：新培養(yǎng)基=1：4）每次繼代都要進(jìn)行選擇，篩選生活力好的細(xì)胞繼代第六頁，共八十一頁，2022年，8月28日成功的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系必須滿足3個(gè)條件：1、浮懸培養(yǎng)物分散性良好，細(xì)胞團(tuán)較小，一般在30～50個(gè)細(xì)胞以下，在實(shí)際培養(yǎng)中很少有完全由單細(xì)胞組成的植物細(xì)胞懸浮系。2、均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同，懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細(xì)胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。3、細(xì)胞生長迅速，懸浮細(xì)胞的生長量一般

2～3天甚至更短時(shí)間便可增加1倍。第七頁，共八十一頁，2022年，8月28日3、懸浮細(xì)胞生長動(dòng)態(tài)：基本的懸浮培養(yǎng)體系均是將細(xì)胞分散在一定容積的培養(yǎng)液中進(jìn)行，在一個(gè)培養(yǎng)周期不添加培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)體系基本是處于封閉狀態(tài)。當(dāng)一種營養(yǎng)物質(zhì)耗盡時(shí)，細(xì)胞及停止生長。在這種懸浮培養(yǎng)體系中，細(xì)胞擴(kuò)增生長成S形曲線。第八頁，共八十一頁，2022年，8月28日

培養(yǎng)周期的概念

具有一定起始培養(yǎng)密度的單細(xì)胞，從開始培養(yǎng)到細(xì)胞數(shù)目和總重量增長停止這一過程，稱為一個(gè)培養(yǎng)周期。

第九頁，共八十一頁，2022年，8月28日

接種初期的細(xì)胞密度過低會(huì)使延遲期加長，懸浮細(xì)胞的起始密度一般在（0.5~2.5）*105個(gè)范圍內(nèi)調(diào)整。一般繼代培養(yǎng)可降低密度；若在短時(shí)間內(nèi)獲得大量細(xì)胞可提高接種密度。在實(shí)際應(yīng)用中，還需要確定一些參數(shù)：最低起始密度、最大生長速率、每個(gè)培養(yǎng)周期所經(jīng)歷的天數(shù)等。第十頁，共八十一頁，2022年，8月28日4、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的同步化細(xì)胞同步化：同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細(xì)胞都同時(shí)通過細(xì)胞周期的某一特定時(shí)期。植物細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)中的游離性較差，容易團(tuán)聚進(jìn)入不同程度的分化狀態(tài)，因此要達(dá)到完全同步化相當(dāng)困難。①分選法：通過細(xì)胞體積大小分級(jí)，直接將處于相同周期的細(xì)胞進(jìn)行分選，然后將同一狀態(tài)的細(xì)胞繼代培養(yǎng)于同一培養(yǎng)體系中。②饑餓法：在一個(gè)培養(yǎng)體系中，如果細(xì)胞生長的基本成分喪失，則導(dǎo)致細(xì)胞因饑餓而分裂受阻，從而停留在某一分裂時(shí)期。第十一頁，共八十一頁，2022年，8月28日③抑制劑法：通過一些DNA合成抑制劑處理細(xì)胞，使細(xì)胞滯留在DNA合成前期，當(dāng)解除抑制后，即可獲得處于同一細(xì)胞周期—G1期的同步化細(xì)胞。④低溫法：冷處理也可提高培養(yǎng)體系中細(xì)胞同步化程度。第十二頁，共八十一頁，2022年，8月28日

二、單細(xì)胞培養(yǎng)

1、平板培養(yǎng)

2、看護(hù)培養(yǎng)

3、微室培養(yǎng)

4、雙層濾紙培養(yǎng)第十三頁，共八十一頁，2022年，8月28日

懸浮培養(yǎng)不能對(duì)某一細(xì)胞進(jìn)行定點(diǎn)觀察和分析，也就不能進(jìn)行定點(diǎn)選擇。因此，在進(jìn)行細(xì)胞株（種子細(xì)胞）選擇和需要對(duì)細(xì)胞活動(dòng)跟蹤觀察的情況下，必須進(jìn)行真正意義上的單細(xì)胞培養(yǎng)。由于植物細(xì)胞的團(tuán)聚性，單細(xì)胞培養(yǎng)還比較困難。第十四頁，共八十一頁，2022年，8月28日1、細(xì)胞平板培養(yǎng)

平板培養(yǎng)(plateculture)：將一定密度的懸浮細(xì)胞接種到一薄層固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)。單細(xì)胞的分離：用于平板培養(yǎng)的小細(xì)胞團(tuán)不能超過6個(gè)細(xì)胞，所以過濾時(shí)篩網(wǎng)的網(wǎng)孔大小要合適。單細(xì)胞懸浮液的制備：分離的單細(xì)胞經(jīng)低速離心，培養(yǎng)液洗滌2次后，調(diào)整密度為5×105／ml。植板：將1份已調(diào)整好密度的單細(xì)胞懸浮液與4份35℃的固體培養(yǎng)基充分混合均勻，然后均勻地平鋪于培養(yǎng)皿中，厚度約1~2mm。

封口：用石蠟?zāi)し馀囵B(yǎng)皿。第十五頁，共八十一頁，2022年，8月28日

平板培養(yǎng)的效果一般用植板率來衡量。植板率：

能長出細(xì)胞團(tuán)的單細(xì)胞在接種單細(xì)胞中所占的比例。

植板率（％）＝每個(gè)平板形成的細(xì)胞團(tuán)數(shù)每個(gè)平板接種的細(xì)胞總數(shù)平板培養(yǎng)中細(xì)胞密度和培養(yǎng)基成分是培養(yǎng)成功的關(guān)鍵，而細(xì)胞密度和培養(yǎng)基成分互相依賴（負(fù)相關(guān)）。鏡檢：用倒置顯微鏡觀察將單細(xì)胞做標(biāo)記，已獲得真正的單細(xì)胞系。培養(yǎng)：25℃黑暗培養(yǎng)。第十六頁，共八十一頁，2022年，8月28日2、看護(hù)培養(yǎng)看護(hù)培養(yǎng)（nurseculture）：是由Muir1954年設(shè)計(jì)的。

操作方法：

在固體培養(yǎng)基上置入一塊活躍生長的愈組織，再在愈傷組織上放一小片濾紙，待濾紙濕潤后將細(xì)胞接種于濾紙上。當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞長出微小細(xì)胞團(tuán)以后，將其直接轉(zhuǎn)至瓊脂培養(yǎng)基上讓其迅速生長第十七頁，共八十一頁，2022年，8月28日3、微室培養(yǎng)它可對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行活體連續(xù)觀察。這一方法也可用于原生質(zhì)體培養(yǎng)觀察細(xì)胞壁的再生和細(xì)胞分裂過程。第十八頁，共八十一頁，2022年，8月28日4、雙層濾紙培養(yǎng)

Horsch等（1980）將平板培養(yǎng)與飼養(yǎng)層培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，建立了雙層濾紙植板培養(yǎng)方法。第十九頁，共八十一頁，2022年，8月28日三、植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)及有用物質(zhì)生產(chǎn)

（一）、概述（二）、植物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)體系的建立（三）、利用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質(zhì)第二十頁，共八十一頁，2022年，8月28日

植物次生代謝產(chǎn)物：植物中一大類并非植物生長發(fā)育所必需的小分子有機(jī)化合物，其產(chǎn)生和分布通常有種屬、器官組織和生長發(fā)育期的特異性。次生產(chǎn)物在植物中的合成與分解過程稱為次生代謝。（一）、概述

第二十一頁，共八十一頁，2022年，8月28日

植物產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的類型根據(jù)分子結(jié)構(gòu)不同大致分為：

酚類化合物：黃酮類；醌類（苯醌、萘醌、蒽醌）萜類化合物：三萜皂甙；甾體皂甙；單萜、倍半萜、二萜含氮化合物：生物堿；胺類（伯、仲、叔、季胺）非蛋白氨基酸生氰甙多炔類、有機(jī)酸第二十二頁，共八十一頁，2022年，8月28日

植物次生代謝產(chǎn)物在醫(yī)藥、食品、輕化工業(yè)等領(lǐng)域具有重要意義。李時(shí)珍在《本草綱目》中所開列的1892種藥物絕大多數(shù)是植物藥物，目前仍有約25％的法定藥品來自植物。其藥物的有效成分均為次生產(chǎn)物。許多植物次生代謝產(chǎn)物是優(yōu)良的食品添加劑和名貴化妝品原料。有些是生物毒素的主要來源，可以用于殺蟲、殺菌，而對(duì)環(huán)境和人畜無害是理想的環(huán)保產(chǎn)品。

第二十三頁，共八十一頁，2022年，8月28日

自然植物和細(xì)胞培養(yǎng)的紫草寧含量比較生產(chǎn)方式生產(chǎn)周期紫草寧含量（％干重）完整植物2～3年1～2植物細(xì)胞培養(yǎng)3周14第二十四頁，共八十一頁，2022年，8月28日植物次生代謝產(chǎn)品的市場潛能產(chǎn)品成分用途年銷售額（億美元）長春花堿治療白血病18～20（美國）奎寧治療瘧疾5～10（美國）致熱素殺蟲劑20（全世界）毛地黃心臟病藥20～55（美國）第二十五頁，共八十一頁，2022年，8月28日

植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的技術(shù)要求：

從工程的角度講必須要進(jìn)一步研究和開發(fā)適宜于植物細(xì)胞生長和次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的生物反應(yīng)器，建立最佳的控制和調(diào)節(jié)系統(tǒng)。從細(xì)胞生長與培養(yǎng)技術(shù)方面講必須滿足以下3個(gè)條件：

1、培養(yǎng)的細(xì)胞在遺傳上應(yīng)是穩(wěn)定的，以得到產(chǎn)量恒定的產(chǎn)物。

2、細(xì)胞生長及生物合成的速度快，在較短的時(shí)間內(nèi)能得到較高產(chǎn)量的終產(chǎn)物。

3、代謝產(chǎn)物要在細(xì)胞中積累而不被迅速分解，最好能將其釋放到培養(yǎng)基中。第二十六頁，共八十一頁，2022年，8月28日（二）、植物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)體系的建立

1、種子細(xì)胞的選擇

（1）準(zhǔn)確選擇能產(chǎn)生目的化合物的植物種類；（2）盡量選擇自然狀態(tài)下產(chǎn)生天然產(chǎn)物的組織器官為外植體；

(3)高產(chǎn)種子細(xì)胞克隆的方法：單細(xì)胞培養(yǎng)后，將單細(xì)胞擴(kuò)增形成的愈傷組織分2份，1份成分含量分析，另1份保留培養(yǎng)。第二十七頁，共八十一頁，2022年，8月28日2、種子細(xì)胞系的增殖與放大培養(yǎng)種子細(xì)胞增殖初期一般采用搖瓶培養(yǎng)，搖瓶體積從幾百毫升到幾升逐級(jí)放大。當(dāng)細(xì)胞數(shù)量增加到一定值后，應(yīng)轉(zhuǎn)移至體積較小的生物反應(yīng)器培養(yǎng)。第二十八頁，共八十一頁，2022年，8月28日3、大規(guī)模培養(yǎng)體系的建立

（1）成批培養(yǎng)：在一個(gè)培養(yǎng)體積中接種細(xì)胞或添加培養(yǎng)基后，中途不添加也不更換培養(yǎng)基的方式。

（2）連續(xù)培養(yǎng)：在培養(yǎng)過程中，不斷向反應(yīng)器中以一定流量添加新培養(yǎng)基，同時(shí)以一定流量從系統(tǒng)中取出培養(yǎng)基的方式。

(3)半連續(xù)培養(yǎng)：在完成成批培養(yǎng)的一個(gè)周期后，從反應(yīng)器中取出大部分細(xì)胞懸液，只保留小部分細(xì)胞懸液作為下一培養(yǎng)周期的種子細(xì)胞，然后加入新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的方式。第二十九頁，共八十一頁，2022年，8月28日(三)生物反應(yīng)器類型及特點(diǎn)大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)基本原理方法與上述實(shí)驗(yàn)室懸浮培養(yǎng)一致，但大規(guī)模培養(yǎng)所采用的設(shè)備及控制技術(shù)比實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模培養(yǎng)要復(fù)雜的多。

第三十頁，共八十一頁，2022年，8月28日

植物細(xì)胞培養(yǎng)具有周期長、細(xì)胞抗剪切能力弱、易團(tuán)聚等特點(diǎn)。同時(shí)，植物細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)的目的是生產(chǎn)天然產(chǎn)物，所以，植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器的設(shè)計(jì)不僅要考慮有利于細(xì)胞生長，還要考慮有利于產(chǎn)物的積累和分離?？傮w上，適合植物細(xì)胞培養(yǎng)的反應(yīng)器應(yīng)具有適宜的氧傳遞、良好的流動(dòng)性和較低的剪切力。第三十一頁，共八十一頁，2022年，8月28日機(jī)械攪拌式培養(yǎng)系統(tǒng)

機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器通常是在微生物發(fā)酵罐的基礎(chǔ)上改進(jìn)設(shè)計(jì)的，根據(jù)植物細(xì)胞的特性，其設(shè)備要求在微生物發(fā)酵罐的基礎(chǔ)上作如下改進(jìn)：攪拌裝置要減少剪切，一般改葉輪式為螺旋式；因?yàn)橹参锛?xì)胞生長周期長，需要隨時(shí)補(bǔ)充水分和營養(yǎng)，因此必須設(shè)計(jì)加液裝置；由于植物細(xì)胞的生理活動(dòng)需要新鮮空氣，且細(xì)胞代謝也可能產(chǎn)生有害氣體，所以必須設(shè)計(jì)通氣裝置；為便于取樣觀察，一般還設(shè)計(jì)有取樣口。

第三十二頁，共八十一頁，2022年，8月28日生物反應(yīng)器第三十三頁，共八十一頁，2022年，8月28日StirredTankBioreactorsAnexternalmotorisusedtoagitatethegrowthmediumwithimpellers.Sterileairorcombinationsofgasescanbeintroduced(sparkling)第三十四頁，共八十一頁，2022年，8月28日氣壓攪拌式培養(yǎng)系統(tǒng)

考慮到機(jī)械攪拌式反應(yīng)器的剪切作用難以避免，同時(shí)攪拌器轉(zhuǎn)動(dòng)的中軸往往是容易使培養(yǎng)物污染的部位，因此，發(fā)展出空氣提升式生物反應(yīng)器，但其缺點(diǎn)是攪拌不均勻。

第三十五頁，共八十一頁，2022年，8月28日BubbleColumnBioreactor

(AirliftReactor)Introductionofsterileairorpuregases

isusedbothforagitationandoxygenation第三十六頁，共八十一頁，2022年，8月28日InternalLoopAirliftBioreactorTubeplacedinsidethereactorcreatesinternalcirculationloop

第三十七頁，共八十一頁，2022年，8月28日ExternalLoopAirliftBioreactorCirculationthroughanexternalloop

第三十八頁，共八十一頁，2022年，8月28日旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)系統(tǒng)

一般用于產(chǎn)品中試或某些必需裂解細(xì)胞才能獲得目的產(chǎn)物的培養(yǎng)，其優(yōu)點(diǎn)是控制精確，處理靈活，缺點(diǎn)是培養(yǎng)體積較小。

第三十九頁，共八十一頁，2022年，8月28日②固定化培養(yǎng)系統(tǒng)這一技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于：

可以較容易地控制培養(yǎng)系統(tǒng)的理化環(huán)境，從而可以研究特定的代謝途徑，并便于調(diào)節(jié)；細(xì)胞位置的固定使其所處的環(huán)境類似于在植物體中所處的狀態(tài)，相互間接觸密切，可以形成一定的理化梯度，有利于次生產(chǎn)物的合成；由于細(xì)胞固定在支持物上，培養(yǎng)基可以不斷更換，可以從培養(yǎng)基中提取產(chǎn)物，免除了培養(yǎng)基中因含有過多的初生產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞代謝的反饋抑制，也由于細(xì)胞留在反應(yīng)器中，新的培養(yǎng)基可以再次利用這些細(xì)胞生產(chǎn)初生產(chǎn)物，從而節(jié)省了生產(chǎn)細(xì)胞所付出的時(shí)間和費(fèi)用；正是由于細(xì)胞固定在一定的介質(zhì)中，并可以從培養(yǎng)基中不斷提取產(chǎn)物，因此，它可以進(jìn)行連續(xù)生產(chǎn)。第四十頁，共八十一頁，2022年，8月28日細(xì)胞固定化培養(yǎng)技術(shù)按照其支持物不同可以分為兩大類：

包埋式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物多采用瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽、聚丙烯酰胺等；附著式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物采用尼龍網(wǎng)、聚氨酯泡沫、中空纖維等材料。

第四十一頁，共八十一頁，2022年，8月28日

1、利用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質(zhì)的一般程序（1）選材

應(yīng)注意以下條件：①藥效肯定；②對(duì)其有效成分有充分的了解；③有測定有效成分和藥理的可靠方法；④市場短缺或價(jià)格昂貴；⑤取有藥效成分的部位，且該部位較易形成愈傷組織。（四）、利用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質(zhì)第四十二頁，共八十一頁，2022年，8月28日

（2）細(xì)胞株系建立

將誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織進(jìn)行分離，建立懸浮細(xì)胞繁殖體系（液體培養(yǎng)）。

在工廠化生產(chǎn)中，為了提高有用物質(zhì)產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的選擇有兩個(gè)基本要求：①有用物質(zhì)的合成積累能力強(qiáng)②生長速度快

第四十三頁，共八十一頁，2022年，8月28日

（3）大量培養(yǎng)

將選出的優(yōu)良細(xì)胞株擴(kuò)大繁殖后，可作為細(xì)胞工廠化培養(yǎng)的生產(chǎn)“種子”，進(jìn)行大量培養(yǎng)。

（4）產(chǎn)品提取與純化從植物細(xì)胞培養(yǎng)物中提取和純化有的產(chǎn)品。第四十四頁，共八十一頁，2022年，8月28日2、提高有用物質(zhì)生產(chǎn)效率的技術(shù)因素

①篩選高產(chǎn)細(xì)胞系

從實(shí)驗(yàn)材料中篩選高產(chǎn)的細(xì)胞株系是提高生產(chǎn)率、降低生產(chǎn)成本的重要因素。特異的次生代謝產(chǎn)物往往是特異的器官中形成的。因此，用特異器官為材料，建立特異功能的細(xì)胞系，并從中反復(fù)多代培養(yǎng)選擇有效的、高產(chǎn)的細(xì)胞株。

第四十五頁，共八十一頁，2022年，8月28日

篩選出的高效、高產(chǎn)細(xì)胞株系，有的植物細(xì)胞系其高效、高產(chǎn)性能穩(wěn)定多年，但有的植物細(xì)胞系不穩(wěn)定，因此，還需要定期檢測，更新細(xì)胞株系。第四十六頁，共八十一頁，2022年，8月28日

第一步：解決生物量生產(chǎn)（促進(jìn)細(xì)胞裂）；第二步：促進(jìn)次生代謝物合成，即在細(xì)胞指數(shù)生長停止期前后才更換培養(yǎng)基，有利于次生物質(zhì)的積累。

②、二步培養(yǎng)法第四十七頁，共八十一頁，2022年，8月28日③、培養(yǎng)基中添加前體前體：有用次生代謝物的前驅(qū)物。煙草愈傷組織培養(yǎng)中，將前體物質(zhì)—煙堿酸加入，會(huì)增加煙堿的生成量。第四十八頁，共八十一頁，2022年，8月28日

④、培養(yǎng)基中生長調(diào)節(jié)劑的作用

植物生長調(diào)節(jié)劑不僅影響植物的脫分化與再分化，而且能影響次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)生。如煙草愈傷組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中添加IAA，能合成煙堿，而在含有2,4-D的培養(yǎng)基上，煙堿合成受阻。

第四十九頁，共八十一頁，2022年，8月28日⑤、培養(yǎng)條件的影響光照、溫度等影響次生代謝。在胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)中，光照條件使紫紅色愈傷組織能夠生成大量的花箐苷，并且低溫條件下，生成量高。

第五十頁，共八十一頁，2022年，8月28日⑥、采用固相細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)

細(xì)胞生長分裂旺盛時(shí)，次生代謝物產(chǎn)量低。采用固相培養(yǎng)，將細(xì)胞培養(yǎng)在惰性基質(zhì)中，細(xì)胞生長緩慢，可提高次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)量。第五十一頁，共八十一頁，2022年，8月28日思考題1．一個(gè)好的懸浮細(xì)胞系有哪些特征？用于建立懸浮細(xì)胞系的愈傷組織有何要求？2．建立懸浮細(xì)胞系的關(guān)鍵技術(shù)有哪些？3．懸浮細(xì)胞系在繼代培養(yǎng)中其群體生長規(guī)律？4．細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)有哪些培養(yǎng)系統(tǒng)？第五十二頁，共八十一頁，2022年，8月28日第五十三頁，共八十一頁，2022年，8月28日第五十四頁，共八十一頁，2022年，8月28日紫杉醇：二萜類化合物最早由太平洋紅豆杉Taxus

brevifolia的樹皮中分離廣泛用于治療卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌等十幾種癌癥目前主要來源于紅豆杉屬植物紫杉醇簡介第五十五頁，共八十一頁，2022年，8月28日理化性質(zhì)英文名：Paclitaxel,Taxol?orTM分子式：C47H51NO4水溶性：0.7mg／ml穩(wěn)定性：pH4～8穩(wěn)定；pH<4較穩(wěn)定；pH>8易分解；在特定條件下紫杉醇可被氧化，但極難還原；第五十六頁，共八十一頁，2022年，8月28日紫杉醇研發(fā)過程年代進(jìn)展1958NCI開始大規(guī)模植物藥研發(fā)篩選1967

發(fā)現(xiàn)紫杉醇抗癌活性1968

從紅豆杉中分離出紫杉醇1971

完成結(jié)構(gòu)鑒定1979

發(fā)表作用機(jī)制1983

臨床Ⅰ試驗(yàn)1985

臨床II期1991

臨床III期1992

FDA批準(zhǔn)上市NCI稱其為過去15年中開發(fā)的最好的抗癌藥物20世紀(jì)90年代抗腫瘤藥的三大成就之一湯姆森科技桂冠獎(jiǎng)RameshPanchagnula,InternationalJournalofPharmaceutics.1998(172)1-15.第五十七頁，共八十一頁，2022年，8月28日市場需求抗癌一線用藥

銷售額年增長率5億美元

理論需求量

2g/人,500萬人/年

1000kg/年實(shí)際銷量

350kg/年紫杉醇供需相差十分懸殊

圖1：國際紫杉醇原料藥需求走勢圖（單位：公斤）圖2：國際紫杉醇銷售額（億美元）第五十八頁，共八十一頁，2022年，8月28日紫杉醇開發(fā)的關(guān)鍵問題上游產(chǎn)業(yè)——藥源問題

下游制劑產(chǎn)業(yè)藥效（活性、水溶性）安全性生物相容性第五十九頁，共八十一頁，2022年，8月28日藥源問題紅豆杉

主要原料植物國家一級(jí)保護(hù)野生植物，全球十大瀕危物種之一生長緩慢分布有限Taxol含量低

樹皮中Taxol含量:0.00001-0.069%3000棵樹=10噸樹皮=1kgTaxol=500病人第六十頁，共八十一頁，2022年，8月28日人工栽培采用種子繁殖、扦插等無性繁殖方法快速、大面積人工繁育紅豆杉幼苗尋找紅豆衫的替代物

從紅豆杉非樹皮部位提取產(chǎn)紫杉醇的非紅豆杉植物優(yōu)點(diǎn)：生長周期縮短簡便、直接缺點(diǎn)：1、紫杉醇含量低生長緩慢

2、提取工藝復(fù)雜藥源問題解決辦法（一）第六十一頁，共八十一頁，2022年，8月28日藥源問題解決辦法（二）化學(xué)合成全合成

1994年獲得成功現(xiàn)有六種途徑半合成以10-DABⅢ和BaccatinⅢ作為半合成原料獲得紫杉醇新方法用10-DAT缺點(diǎn)：1、合成過程煩瑣復(fù)雜，幾十步

2、費(fèi)用高，化學(xué)試劑昂貴

3、總收率太低（2%）優(yōu)點(diǎn)：1、原料枝葉含量豐富、提取相對(duì)容易，充分利用再生資源

2、產(chǎn)率高

3、最具實(shí)用價(jià)值可以工業(yè)化生產(chǎn)

4、獲取紫杉醇構(gòu)效關(guān)系信息，進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造缺點(diǎn)：合成過程相對(duì)復(fù)雜（11步化學(xué)轉(zhuǎn)化和7步分離）第六十二頁，共八十一頁，2022年，8月28日藥源問題解決辦法（三）生物方法組織和細(xì)胞培養(yǎng)微生物發(fā)酵生物合成研究階段紅豆杉生物合成途徑基本明確

10種相關(guān)酶基因被克隆表達(dá)利用基因工程手段改造紅豆杉提高紫杉醇產(chǎn)量

優(yōu)點(diǎn)：1、擺脫自然因素，可長期穩(wěn)定生長

2、適應(yīng)市場、方便調(diào)節(jié)

3、成分簡單，有利于分離純化

4、成本低、生長周期短

5、為半合成提供原料

6、有望工業(yè)化生產(chǎn)缺點(diǎn)：1、產(chǎn)量低、不穩(wěn)定

2、工業(yè)化放大研究第六十三頁，共八十一頁，2022年，8月28日紫杉醇水溶性很差0.77mM/L使用增溶劑：聚氧乙烯蓖麻油和無水乙醇

存在問題穩(wěn)定性和水溶性較差（7mm/L）過敏反應(yīng)產(chǎn)生沉淀缺點(diǎn)：1、產(chǎn)量低、不穩(wěn)定

2、工業(yè)化放大研究藥效問題第六十四頁，共八十一頁，2022年，8月28日一、植物來源藥物的特點(diǎn)全世界有40%的藥物來源于植物。我國是中草藥資源最豐富的國家，有詳細(xì)記載的近5000種。中草藥治療疾病的歷史上千年，中醫(yī)藥已形成完整的科學(xué)體系。對(duì)于植物藥效成分的研究已形成“天然藥物化學(xué)”研究的新領(lǐng)域。藥用植物中具有藥物功能的物質(zhì)種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜。除小分子的天然有機(jī)化合物以外，還有多種生物大分子活性物質(zhì)。

對(duì)不同組方的藥用成分和功能的研究是一項(xiàng)巨大的工程，相當(dāng)于基因組和蛋白質(zhì)組工程。中藥復(fù)方復(fù)雜系統(tǒng)研究（北京大學(xué)韓啟德院士）第六十五頁，共八十一頁，2022年，8月28日二、植物來源藥物的種類

1、天然有機(jī)化合物（1）糖和糖苷類（2）苯丙素類：苯丙烯、苯丙酸、香豆素等（3）醌類：輔酶Q10、紫草素（4）黃酮類：黃酮醇、花色素

（5）鞣質(zhì)：奎寧酸、槲皮醇。（6）萜類：青蒿素、齊墩果酸（7）甾體：烏沙苷元、毛第黃毒苷元（8）生物堿：咖啡因、喜樹堿第六十六頁，共八十一頁，2022年，8月28日2、植物蛋白質(zhì)、多肽、酶類生理活性物質(zhì)表2-163、植物糖類藥物包括單糖、聚糖和糖衍生物。表2-174、植物脂類藥物（1）脂肪和脂肪酸類：亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸（2）磷脂類：大豆磷脂（3）固醇類：豆固醇、β-谷固醇。第六十七頁，共八十一頁，2022年，8月28日三、植物來源藥物的植被實(shí)例