飛行質譜儀檢測樣品的詳細操作步驟課件

MALDI-TOF檢測樣品詳細操作過程MALDI-TOF檢測樣品1儀器名稱：基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜儀（簡稱MALDI-TOF）儀器外觀1.對生物大分子分子量的測定；

2.對蛋白質進行高通量的鑒定(高純度單一蛋白）；

3.對有機小分子化合物分子量的測定；

4.對寡核苷酸的分析；

5.對基因的單核苷酸多態(tài)性的分析。

廣泛應用于蛋白質組學、基因組學、分子生物學研究領域。主要功能與應用型號：autoflex儀器名稱：基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜儀（簡稱MA21、線性模式飛行距離：1.22米；反射模式飛行距離：2.7米

2、質量范圍：可高達300,000道爾頓或更高

3、分辨率：線性模式：ACTH18-39(m/z=2465.2)，激光打30次，分辨率>4,000反射模式：Somatostatin(m/z=3147),，激光打30次，分辨率>20,0004、靈敏度：1fmolACTH18-39(m/z=2465.2)，激光打20次線性模式信噪比大于10：1；反射模式信噪比大于10：15、質量準確度：線性模式質量準確度≤250ppm。反射模式質量準確度≤60ppm。主要性能指標1、線性模式飛行距離：1.22米；反射模式飛行距離：2.73（一）準備基質溶液（Matrixpreparationprotocol）（說明：根據樣品類型選用合適的基質，此處的HCCA適于肽類和小分子蛋白）ProduceasaturatedsolutionofHCCAin(acetonitrile:0.1%TFA,1:2v/v)MixsolutioninultrasonicdeviceSpindownexcessmatrixinacentrifuge(5minat14000RpM)andusetheclearsupernatant一、樣品制備（一）準備基質溶液（Matrixpreparation4（二）手動點靶（PreparationontoMALDITOF-Target）

干點法（Drieddropletmethod）：最為常用的一種方法MixequalvolumesofsamplewithHCCAApply1ulontothetarget按圖示模式點靶Dryatroomtemperature標樣樣樣樣樣樣樣樣標樣樣樣樣樣樣樣樣（二）手動點靶（PreparationontoMALD5“自動點靶設備樣品“靶”（MALDITOF-Target）“自動點靶設備樣品“靶”（MALDITOF-Targe6飛行質譜儀檢測樣品的詳細操作步驟課件7四、譜圖解析蛋白鑒定樣品：進入下一步網上數據庫檢索四、譜圖解析蛋白鑒定樣品：進入下一步網上數據庫檢索8下面介紹：“肽指紋譜”網上數據庫檢索兩種方法：一、登陸mascot網站，直接調用.peaklist文件，進行檢索。二、用biotools軟件，打開樣品的原始譜圖，設定參數，重新標峰，自動鏈接mascot網頁，進行檢索。將檢索到的結果與原始譜圖比對，檢查峰匹配情況。此法可以省略步驟（三、標峰）

下面介紹：“肽指紋譜”網上數據庫檢索兩種方法：9登陸網站點擊

第一種方法登陸網站點擊第一種方法10設定各參數調用.peaklist文件點擊開始設定各參數調用.peaklist文件點擊開始11網上數據庫檢索結果分值>76的區(qū)域網上數據庫檢索結果分值>76的區(qū)域12根據樣品來源確定目標蛋白點擊選中的蛋白鏈接，則顯示氨基酸序列等詳細信息根據樣品來源確定目標蛋白點擊選中的蛋白鏈接，則顯示氨基酸序列13蛋白序列信息理論與檢測值比較蛋白序列信息理論與檢測值比較14檢索結果檢索結果15選中目標蛋白后，點擊gethit(s)選中目標蛋白后，點擊gethit(s)16可通過譜圖，直觀地查看峰的匹配情況Gethit(s)后顯示的頁面可通過譜圖，直觀地查看峰的匹配情況Gethit(s)后顯示17五、校準樣品譜圖校準樣品有四種：1、peptidecalibrationstandard(~1000Da-~4000Da)簡寫為：pep_cal2、proteincalibrationstandard(~3000Da-~25000Da)簡寫為：proⅠ_cal3、proteincalibrationstandardⅡ(~20000Da-~70000Da)簡寫為：proⅡ_cal4、oligonucleotidecalibrationstandard(~3000Da-~10000Da)簡寫為：oligo_cal五、校準樣品譜圖校準樣品有四種：18pep_cal的譜圖pep_cal的譜圖19proⅠ_cal的譜圖proⅠ_cal的譜圖20proⅡ_cal的譜圖proⅡ_cal的譜圖21oligo_cal的譜圖oligo_cal的譜圖22以下幾張譜圖供大家參考。六、舉例以下幾張譜圖供大家參考。六、舉例23肽譜干凈無雜質，清晰易準確標峰，檢索結果得分值高肽譜干凈無雜質，清晰易準確標峰，檢索結果得分值高24肽譜干凈無雜質，清晰易準確標峰，檢索結果得分值高肽譜干凈無雜質，清晰易準確標峰，檢索結果得分值高25角蛋白污染嚴重角蛋白污染嚴重26一組間隔均勻的峰，為質量較差的樣品容器導致的污染，并嚴重抑制了樣品的電離。一組間隔均勻的峰，為質量較差的樣品容器導致的污染，并嚴重抑制27較臟的樣品，檢測不到肽峰較臟的樣品，檢測不到肽峰28七、特別說明

就象DNA測序儀的檢測結果好壞與模板、測序純化反應等有關一樣，MALDI-TOF檢測結果主要取決于樣品前期處理的好壞.一方面質量較差的容器、溶劑和角蛋白污染等會導致譜圖中含有大量的假樣品峰.另一方面，樣品中鹽的存在會抑制樣品的離子化，最終導致檢測不到樣品峰，所以要嚴格操作過程，控制好樣品中的含鹽量。七、特別說明就象DNA測序儀的檢測結果好壞與29質譜專家建議：跑膠、切膠、酶切、除鹽等操作過程中，盡量戴上手套、口罩、頭帽等，并選用較好的實驗材料；不要使用不揮發(fā)性鹽，揮發(fā)性鹽含量控制在20mM以下，最好做Ziptip除鹽處理。質譜專家建議：跑膠、切膠、酶切、除鹽等操作過程中，盡量戴上手30MALDI-TOF檢測樣品詳細操作過程MALDI-TOF檢測樣品31儀器名稱：基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜儀（簡稱MALDI-TOF）儀器外觀1.對生物大分子分子量的測定；

2.對蛋白質進行高通量的鑒定(高純度單一蛋白）；

3.對有機小分子化合物分子量的測定；

4.對寡核苷酸的分析；

5.對基因的單核苷酸多態(tài)性的分析。

廣泛應用于蛋白質組學、基因組學、分子生物學研究領域。主要功能與應用型號：autoflex儀器名稱：基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜儀（簡稱MA321、線性模式飛行距離：1.22米；反射模式飛行距離：2.7米

2、質量范圍：可高達300,000道爾頓或更高

3、分辨率：線性模式：ACTH18-39(m/z=2465.2)，激光打30次，分辨率>4,000反射模式：Somatostatin(m/z=3147),，激光打30次，分辨率>20,0004、靈敏度：1fmolACTH18-39(m/z=2465.2)，激光打20次線性模式信噪比大于10：1；反射模式信噪比大于10：15、質量準確度：線性模式質量準確度≤250ppm。反射模式質量準確度≤60ppm。主要性能指標1、線性模式飛行距離：1.22米；反射模式飛行距離：2.733（一）準備基質溶液（Matrixpreparationprotocol）（說明：根據樣品類型選用合適的基質，此處的HCCA適于肽類和小分子蛋白）ProduceasaturatedsolutionofHCCAin(acetonitrile:0.1%TFA,1:2v/v)MixsolutioninultrasonicdeviceSpindownexcessmatrixinacentrifuge(5minat14000RpM)andusetheclearsupernatant一、樣品制備（一）準備基質溶液（Matrixpreparation34（二）手動點靶（PreparationontoMALDITOF-Target）

干點法（Drieddropletmethod）：最為常用的一種方法MixequalvolumesofsamplewithHCCAApply1ulontothetarget按圖示模式點靶Dryatroomtemperature標樣樣樣樣樣樣樣樣標樣樣樣樣樣樣樣樣（二）手動點靶（PreparationontoMALD35“自動點靶設備樣品“靶”（MALDITOF-Target）“自動點靶設備樣品“靶”（MALDITOF-Targe36飛行質譜儀檢測樣品的詳細操作步驟課件37四、譜圖解析蛋白鑒定樣品：進入下一步網上數據庫檢索四、譜圖解析蛋白鑒定樣品：進入下一步網上數據庫檢索38下面介紹：“肽指紋譜”網上數據庫檢索兩種方法：一、登陸mascot網站，直接調用.peaklist文件，進行檢索。二、用biotools軟件，打開樣品的原始譜圖，設定參數，重新標峰，自動鏈接mascot網頁，進行檢索。將檢索到的結果與原始譜圖比對，檢查峰匹配情況。此法可以省略步驟（三、標峰）

下面介紹：“肽指紋譜”網上數據庫檢索兩種方法：39登陸網站點擊

第一種方法登陸網站點擊第一種方法40設定各參數調用.peaklist文件點擊開始設定各參數調用.peaklist文件點擊開始41網上數據庫檢索結果分值>76的區(qū)域網上數據庫檢索結果分值>76的區(qū)域42根據樣品來源確定目標蛋白點擊選中的蛋白鏈接，則顯示氨基酸序列等詳細信息根據樣品來源確定目標蛋白點擊選中的蛋白鏈接，則顯示氨基酸序列43蛋白序列信息理論與檢測值比較蛋白序列信息理論與檢測值比較44檢索結果檢索結果45選中目標蛋白后，點擊gethit(s)選中目標蛋白后，點擊gethit(s)46可通過譜圖，直觀地查看峰的匹配情況Gethit(s)后顯示的頁面可通過譜圖，直觀地查看峰的匹配情況Gethit(s)后顯示47五、校準樣品譜圖校準樣品有四種：1、peptidecalibrationstandard(~1000Da-~4000Da)簡寫為：pep_cal2、proteincalibrationstandard(~3000Da-~25000Da)簡寫為：proⅠ_cal3、proteincalibrationstandardⅡ(~20000Da-~70000Da)簡寫為：proⅡ_cal4、oligonucleotidecalibrationstandard(~3000Da-~10000Da)簡寫為：oligo_cal五、校準樣品譜圖校準樣品有四種：48pep_cal的譜圖pep_cal的譜圖49proⅠ_cal的譜圖proⅠ_cal的譜圖50proⅡ_cal的譜圖proⅡ_cal的譜圖51oligo_cal的譜圖oligo_cal的譜圖52以下幾張譜圖供大家參考。六、舉