第九章病毒學(xué)研究方法

第九章

病毒學(xué)的研究方法

第一節(jié)

描述病毒體性質(zhì)的參數(shù)、量綱和術(shù)語分子量浮力密度沉降系數(shù)線形長度等物理、化學(xué)參數(shù)來描述病毒體的性質(zhì)。1．分子量：許多分子結(jié)合形成的顆粒--顆粒重量但具有分子的屬性，一些簡單的病毒可視為一個(gè)核蛋白分子，故用分子量來描述病毒的顆粒質(zhì)量具有實(shí)際意義。

病毒體的分子量都在百萬道爾頓以上，其值皆以×106表示，一般3~800×106。

病毒核酸的分子量大小也可以×106表示，一般0.4~200×106道爾頓。

病毒蛋白質(zhì)的分子量常以K表示，1K=1000道爾頓，一般10K~200K之間。2．病毒的線形長度：

通常使用nm（×10-9）表示。大小或質(zhì)量所使用的數(shù)據(jù)，并非定量意義的嚴(yán)格數(shù)據(jù)。因?yàn)樵跍y(cè)定時(shí)，存在著方法學(xué)的誤差:同一種病毒或同一種病毒化學(xué)組成，用不同的方法測(cè)定，結(jié)果卻可能不同。病毒的外殼:42K和22K的蛋白質(zhì)有兩種外殼蛋白的存在其中一種的分子量是另一種的近兩倍每一種的真實(shí)分子量在所給定值的±20%范圍內(nèi)。以序列分析所確定的病毒核酸和蛋白質(zhì)的分子量，反映了它們的真實(shí)值。3．病毒體的密度：用密度梯度離心方法測(cè)定的通常稱做浮力密度以ρ表示單位是克/厘米3

梯度介質(zhì)的性質(zhì)對(duì)病毒體的浮力密度有很大的影響。不同的密度梯度介質(zhì)浮力密度不同。指出測(cè)定時(shí)所使用的梯度介質(zhì)。

病毒體的密度依賴于組成，含有大量脂質(zhì)的有包膜病毒的浮力密度通常在1.3以下。4．沉降系數(shù)：在單位離心力作用下顆粒的沉降速率。

反映病毒顆粒的大小、形狀和密度等病毒顆粒在一定溫度下和一定介質(zhì)中的特征性參數(shù)。沉降系數(shù)以Svedberg表示，簡稱S，量綱為秒，1S單位等于10-13秒。

在不同的溫度下和/或不同的介質(zhì)中所測(cè)得的病毒沉降系數(shù)可能不同，所以都要將在非標(biāo)準(zhǔn)條件下所測(cè)定的S值，校正為標(biāo)準(zhǔn)條件下（即20℃，以水為介質(zhì)）的沉降系數(shù)（S20W）。

不同病毒的沉降系數(shù)相差十分懸殊，小者數(shù)十，大者上千。一、病毒感染的癥狀二、病毒的測(cè)定三、病毒的純化方法四、病毒的鑒定第二節(jié)

病毒學(xué)研究的一般方法一、病毒感染的癥狀無論進(jìn)行何種研究，都需肯定病毒存在但病毒體積微小，在人工培養(yǎng)基上也不能生長。

根據(jù)它感染宿主機(jī)體組織或細(xì)胞所引起的異常表現(xiàn)來識(shí)別。癥狀可分為系統(tǒng)反應(yīng)和局部反應(yīng)。自然的病毒病害或?qū)嶒?yàn)室感染引起

病毒學(xué)研究工作-建立病毒的實(shí)驗(yàn)感染。（一）

系統(tǒng)反應(yīng)——系統(tǒng)性病理反應(yīng)

病毒感染的系統(tǒng)反應(yīng)是指動(dòng)、植物機(jī)體或細(xì)菌群體受到病毒普遍感染后表現(xiàn)出的系統(tǒng)性病理反應(yīng)。

如：動(dòng)物麻痹、器官畸形植物出現(xiàn)環(huán)斑、花葉細(xì)菌培養(yǎng)液變清亮

根據(jù)動(dòng)、植物系統(tǒng)反應(yīng)的性質(zhì)，可對(duì)病毒進(jìn)行鑒定。（二）

局部病損反應(yīng)局部病損反應(yīng):病毒感染的癥狀僅僅局限于動(dòng)、植物機(jī)體的局部部位細(xì)胞培養(yǎng)中的少數(shù)細(xì)胞細(xì)菌群體中的部分細(xì)菌

（二）

局部病損反應(yīng)1．噬菌體的噬斑

噬菌體感染敏感的宿主細(xì)菌所表現(xiàn)出的癥狀是溶菌現(xiàn)象。

在細(xì)菌的菌苔上產(chǎn)生局部的透明溶菌區(qū)域，即噬斑。

圓形，清晰透明邊緣模糊--不完全溶菌1個(gè)噬斑-1個(gè)克隆,1個(gè)噬菌體的子代。107～109個(gè)噬菌體噬斑熒光假單胞菌（二）

局部病損反應(yīng)2．動(dòng)物病毒的局部病損疣、皮疹--臨床診斷指標(biāo)。如扁平疣乳頭瘤病毒感染傳染性軟疣--痘病毒感染（二）

局部病損反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室工作中，最為普遍的是以病毒感染的局部病損反應(yīng)作為鑒定病毒存在的重要依據(jù):雞胚的絨毛尿囊膜痘皰動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞--蝕斑（plaque）等。（二）

局部病損反應(yīng)①雞胚培養(yǎng)和痘皰。

a.雞胚培養(yǎng)：在細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)建立以前,有效實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),廣泛用于動(dòng)物病毒分離鑒定制備疫苗研究病毒性質(zhì)至今雞胚培養(yǎng)還用于痘病毒、正粘病毒和皰疹病毒的研究中。（二）

局部病損反應(yīng)（二）

局部病損反應(yīng)

b.痘皰：病毒感染絨毛尿囊膜上皮細(xì)胞，產(chǎn)生特征性的局部病損，形成痘皰。通常表現(xiàn)為在透明的絨毛尿囊膜上出現(xiàn)白色的、伴有溢血的不透明區(qū)域。肯定病毒感染的證據(jù)大小和形狀特征鑒定病毒的一項(xiàng)指標(biāo)。

（二）

局部病損反應(yīng)②動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和蝕斑a.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)

組織培養(yǎng)指的是從體內(nèi)取出組織模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無菌、適當(dāng)溫度和一定營養(yǎng)條件下，使之生存和生長并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。

細(xì)胞培養(yǎng)指的是從體內(nèi)取出細(xì)胞。（二）

局部病損反應(yīng)

動(dòng)物機(jī)體的復(fù)雜性給病毒學(xué)的各方面研究工作都造成了較大的困難。

細(xì)胞培養(yǎng)為動(dòng)物病毒學(xué)研究提供了一個(gè)極為理想的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。

可以用組織培養(yǎng)法來培養(yǎng)、分離、鑒定和定量測(cè)定病毒，研究病毒的復(fù)制、遺傳和變異、病毒與宿主的相互作用以及制備疫苗等等。（二）

局部病損反應(yīng)b.蝕斑致細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathiceffect,CPE）:病毒感染敏感的培養(yǎng)細(xì)胞后，導(dǎo)致細(xì)胞聚集成團(tuán)、細(xì)胞脫落、細(xì)胞融合、胞內(nèi)出現(xiàn)包含體等等。

（二）

局部病損反應(yīng)不同類型的蝕斑：蝕斑:細(xì)胞受破壞、死亡所形成的局部病損合胞體蝕斑:細(xì)胞融合產(chǎn)生的合胞體（二）

局部病損反應(yīng)增生性病灶或轉(zhuǎn)化灶:腫瘤病毒感染培養(yǎng)細(xì)胞能夠引起細(xì)胞惡變，接觸抑制喪失，形成不定向的三維空間的細(xì)胞集落。（二）

局部病損反應(yīng)病毒只在其敏感細(xì)胞的培養(yǎng)物中形成相應(yīng)的蝕斑。蝕斑實(shí)驗(yàn):將所接種的病毒足夠地稀釋，造成一個(gè)細(xì)胞只被一個(gè)病毒感染的機(jī)會(huì)，一個(gè)蝕斑是由一個(gè)病毒顆粒感染后經(jīng)過多次繁殖循環(huán)形成的。病毒分離純化和定量測(cè)定（二）

局部病損反應(yīng)3．植物病毒的局部病損植物病毒的辨別主要是通過植物機(jī)體的實(shí)驗(yàn)感染進(jìn)行。

（二）

局部病損反應(yīng)

植物病毒通過摩擦接種于植物葉片，或發(fā)生系統(tǒng)感染或出現(xiàn)局部病損。

局部病損僅出現(xiàn)在接種的葉片上，一般都為壞死斑，亦稱枯斑。一、病毒感染的癥狀二、病毒的測(cè)定三、病毒的純化方法四、病毒的鑒定第二節(jié)

病毒學(xué)研究的一般方法二、病毒的測(cè)定病毒的測(cè)定（assayofviruses）:對(duì)病毒進(jìn)行定量的分析，確定在所研究的系統(tǒng)中病毒的含量或濃度。1．

電鏡計(jì)數(shù)樣品均一僅含一種類型的病毒顆粒其數(shù)目很容易確定將一定體積的病毒樣品懸液與已知數(shù)目的聚苯乙烯乳膠顆粒均勻混合在電鏡下分別進(jìn)行病毒顆粒和乳膠顆粒的計(jì)數(shù)。根據(jù)樣品中兩類顆粒的比例，計(jì)算出樣品中病毒顆粒的數(shù)目。

不能區(qū)別有感染性和無感染性的病毒顆粒。2．

病毒的感染性測(cè)定病毒感染性測(cè)定（assayofinfectivity）：有感染性病毒顆粒數(shù)量的測(cè)定。以前稱為病毒滴定（virustitration）。①噬斑計(jì)數(shù)用于噬菌體的感染性測(cè)定。在延伸成片的細(xì)菌菌苔上出現(xiàn)分散的單個(gè)噬斑。統(tǒng)計(jì)噬斑數(shù)目便可計(jì)算出單位體積內(nèi)病毒數(shù)量。2．

病毒的感染性測(cè)定噬斑熒光假單胞菌2．

病毒的感染性測(cè)定②蝕斑(plaque)測(cè)定統(tǒng)計(jì)蝕斑的數(shù)目，便可計(jì)算出病毒的數(shù)量。③

感染灶的檢測(cè)Focalinfectivityassay(FIA),foci2．

病毒的感染性測(cè)定④壞死斑測(cè)定

植物病毒最為方便的感染性測(cè)定方法是壞死斑測(cè)定，稱為枯斑測(cè)定。在一定范圍內(nèi)，受染植物葉片上所產(chǎn)生的壞死斑與病毒的濃度成正比，可測(cè)得病毒的相對(duì)含量。2．

病毒的感染性測(cè)定一、病毒感染的癥狀二、病毒的測(cè)定三、病毒的純化方法四、病毒的鑒定第二節(jié)

病毒學(xué)研究的一般方法三、病毒的純化方法

1．

超速離心

①

差速離心：低速和高速的交替循環(huán)--沉降速率不同顆粒。

②

密度梯度離心：沉降速率相同，只有用某些溶質(zhì)（如蔗糖、氯化銫）制備密度梯度，密度梯度離心機(jī)離心，病毒→相應(yīng)密度介質(zhì)位置。

三、病毒的純化方法2．

沉淀法

①

鹽析：蛋白質(zhì)表面的電荷被溶液中的鹽大量中和，使蛋白質(zhì)聚集、沉淀、析出。如硫酸銨。

②

有機(jī)溶劑沉淀：有機(jī)溶劑降低溶液的介電常數(shù)，增大病毒表面不同電荷之間的引力，病毒沉淀。如乙醚、氯仿等等。三、病毒的純化方法

3.柱層析離子交換（樹脂）分子篩（瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠）。

4.電泳病毒和雜質(zhì)所帶電荷不同，分子大小不同，在一定強(qiáng)度的電場(chǎng)中表現(xiàn)出不同的泳動(dòng)速度。三、病毒的純化方法一、病毒感染的癥狀二、病毒的測(cè)定三、病毒的純化方法四、病毒的鑒定第二節(jié)

病毒學(xué)研究的一般方法四、病毒的鑒定1、電鏡2、X射線衍射3、病毒感染宿主范圍和表現(xiàn)鑒定。4、根據(jù)對(duì)藥物及理化因子的敏感性鑒定5、分子生物學(xué)方法對(duì)病毒核酸鑒定6、病毒蛋白的檢測(cè)7、病毒蛋白與蛋白相互作用

四、病毒的鑒定

1．電鏡技術(shù)：負(fù)染、超薄切片（磷鎢酸和醋酸鈾、檸檬酸鉛）

2.

X射線衍射：不同的晶狀排列得到不同的衍射圖。

MolecularsurfaceofPoliovirusType1,assolvedbyX-raycrystallographyMolecularsurfaceofCanineParvovirus,assolvedbyX-raycrystallography

四、病毒的鑒定

4.根據(jù)對(duì)藥物及理化因子的敏感性鑒定

①

DNA合成抑制劑敏感實(shí)驗(yàn)。核酸類型②

脂溶劑敏感實(shí)驗(yàn)。如：乙醚、氯仿。③

核酸酶敏感性實(shí)驗(yàn)。

四、病毒的鑒定3.病毒感染宿主范圍和表現(xiàn)鑒定。5．

分子生物學(xué)方法對(duì)病毒核酸鑒定

PCR限制性酶切圖譜核酸分子雜交DNA印跡術(shù)(SouthernBlotting)RNA印跡術(shù)(NorthernBlotting)④DNA序列測(cè)定

四、病毒的鑒定

聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）

四、病毒的鑒定1985年,美國PE公司Mullis等快速--數(shù)小時(shí)靈敏--ng甚至fg級(jí)的靶DNA特異

四、病毒的鑒定

PCR的原理：

實(shí)際上是一個(gè)在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸等存在的情況下，DNA聚合酶依賴的酶促聚合反應(yīng).引物—primer模板片斷兩端的已知序列,決定擴(kuò)增特異性。

四、病毒的鑒定PCR產(chǎn)物的檢測(cè)方法（一）凝膠電泳另一種方法是：反向點(diǎn)雜交

膜多個(gè)探針液相--標(biāo)記的PCR產(chǎn)物一次雜交根據(jù)陽性位置--判斷產(chǎn)物的類型。

（二）點(diǎn)雜交一種方法是：膜PCR產(chǎn)物液相--標(biāo)記探針幾種PCR方法原位PCR（InsituPCR）

在細(xì)胞或組織（石蠟、冰凍切片）上直接對(duì)靶DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，通過摻入標(biāo)記基團(tuán)（生物素、地高辛等）直接顯色或結(jié)合原位雜交（也就是用相應(yīng)的探針來檢測(cè)）進(jìn)行檢測(cè)的方法，稱為原位PCR。

分為：

直接原位PCR：PCR擴(kuò)增時(shí)，即摻入生物素/地高辛標(biāo)記的dNTP，擴(kuò)增后即可檢測(cè)。

間接原位PCR：擴(kuò)增時(shí)不進(jìn)行標(biāo)記基團(tuán)的摻入，而在擴(kuò)增結(jié)束后，應(yīng)用一段和擴(kuò)增片段互補(bǔ)的標(biāo)記探針進(jìn)行原位雜交。逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverstranscriptionPCR，RT-PCR）

原理：由mRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)生的cDNA（互補(bǔ)DNA）鏈作為PCR反應(yīng)模板。RT-PCR較Northern雜交檢測(cè)RNA的敏感性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)。

巢式PCR（nestedPCR）用外部引物1和2擴(kuò)增完后，取產(chǎn)物1—10μl做模板再用內(nèi)部引物3和4進(jìn)行2次擴(kuò)增（也可用1、4或2、3擴(kuò)增）。nestedPCR適用于極微量的靶序列。不對(duì)稱性PCR（asymmetricPCR）兩個(gè)引物的濃度不一樣產(chǎn)生單鏈的情況

比例通常為50：1--100：1在前10—15個(gè)循環(huán)中主要產(chǎn)生雙鏈DNA,一個(gè)引物耗盡，只產(chǎn)生另一引物形成的單鏈。這一單鏈可用于測(cè)序，也可用于制備單鏈探針。Figure.OnewayofusingPCRtopreparetemplateDNAforchainterminationsequencing.ThePCRiscarriedoutwithonenormalprimer(showninred),andoneprimerthatislabeledwithametallicbead(showninbrown).AfterPCR,thelabeledstrandsarepurifiedwithamagneticdevice.

常規(guī)PCR是知道目的DNA兩端的序列，來擴(kuò)增中間序列。反向PCR（reversePCR，inverseorinvertedPCR，IPCR）

反向PCR是知道中間的序列，來擴(kuò)增兩端的未知序列。

一、直接擴(kuò)增檢測(cè)目的DNA或通過反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)檢測(cè)目的RNA。

二、PCR克隆技術(shù)在PCR引物中附加酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增的DNA經(jīng)酶切后，可直接克隆到質(zhì)?；騇13噬菌體載體中。

PCR技術(shù)在病毒學(xué)中的應(yīng)用

三、PCR直接測(cè)序技術(shù)PCR產(chǎn)物可以克隆到載體內(nèi)進(jìn)行測(cè)序，或不用克隆而直接進(jìn)行測(cè)序。直接測(cè)序有兩大優(yōu)點(diǎn)：第一易于標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化，因?yàn)樵摲ú灰蕾囉谏矬w。第二更快速。

需要測(cè)定幾份PCR產(chǎn)物高保真的Taq酶體外定點(diǎn)突變用PCR構(gòu)建載體分析基因組DNA的多態(tài)性（RAPD）

PCR在診斷方面應(yīng)用很廣泛。Real-timePCR

實(shí)時(shí)PCR

real-timequantitativePCR

實(shí)時(shí)定量PCR

KineticPCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。特異性的熒光探針：兩端標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收PCR擴(kuò)增時(shí)，探針降解，2基團(tuán)分離熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。Diagramofmolecularbeacon.

33nucleotideslong

DetectionofPCRproductbymolecularbeacon.

Ct值，C代表Cycle，t代表threshold，每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。相同模板在同一臺(tái)PCR儀上進(jìn)行96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖終點(diǎn)處檢測(cè)產(chǎn)物量不恒定；Ct值則極具重現(xiàn)性每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。無需ＰＣＲ后處理和冗長的電泳檢測(cè)解決了常規(guī)ＰＣＲ實(shí)驗(yàn)不能定量的問題

成為常規(guī)ＰＣＲ的更新?lián)Q代技術(shù)是目前最先進(jìn)的ＰＣＲ技術(shù)。缺點(diǎn)：昂貴。

限制性酶切圖譜（restrictionmap）:同一DNA用不同的限制酶進(jìn)行切割，從而獲得各種限制酶的切割位點(diǎn)，由此建立的位點(diǎn)圖譜有助于對(duì)DNA的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。限制性核酸內(nèi)切酶分析技術(shù)是病原變異、毒株鑒別、分型及了解基因結(jié)構(gòu)和進(jìn)行流行病學(xué)研究的有效方法。

Southern雜交：DNA片段經(jīng)電泳分離后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，然后與探針雜交。被檢對(duì)象為DNA，探針為DNA或RNA。

Northern雜交：RNA片段經(jīng)電泳后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上或尼龍膜，然后用探針雜交。被檢對(duì)象為RNA,探針為DNA或RNA。DNA序列測(cè)定

Sanger法測(cè)序

In1974,twoDNAsequencingmethodswereindependentlydevelopedbyanAmericanteamandanEnglishteam.TheAmericans,leadbyMaxamandGilbert,useda“chemicalcleavageprotocol”TheEnglish,leadbySanger,designedaproceduresimilartothenaturalprocessofDNAreplication.Eventhoughbothteamssharedthe1980NobelPrize,Sanger’smethodbecamethestandardbecauseofitspracticality

四、病毒的鑒定FrederickSanger(1918-),桑格是英國生物化學(xué)家。他是第一位兩次獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的人，第一次在1958年(40歲)，是因?yàn)榇_定胰島素的分子結(jié)構(gòu)，第二次在1980年(62歲)，是因?yàn)樵O(shè)計(jì)出一種測(cè)定DNA內(nèi)核苷酸排列順序的方法

歷史上有四人曾兩度獲貝爾獎(jiǎng)：林納鮑林（LinusPauling，化學(xué)和和平）、居禮夫人（MarieCurie，物理和化學(xué)）、約翰巴定（JohnBardeen，物理）、佛烈德瑞克桑格（FrederickSanger，化學(xué)）。dideoxysequencingorchaintermination,isbasedontheuseofdideoxynucleotides(ddNTP’s,雙脫氧核苷三磷酸)inadditiontothenormalnucleotides(NTP’s)foundinDNA.Dideoxynucleotidesareessentiallythesameasnucleotidesexcepttheycontainahydrogengrouponthe3’carboninsteadofahydroxylgroup(OH).Thesemodifiednucleotides,whenintegratedintoasequence,preventtheadditionoffurthernucleotides.Thisoccursbecauseaphosphodiester(磷酸二酯鍵)bondcannotformbetweenthedideoxynucleotideandthenextingnucleotide,andthustheDNAchainisterminated.

BeforetheDNAcanbesequenced,ithastobedenaturedintosinglestrandsusingheat.Nextaprimerisannealedtooneofthetemplatestrands.Eitherthisprimeroroneofthenucleotidesshouldberadioactivelyorfluorescentlylabeledsothatthefinalproductcanbedetectedonagel.OncetheprimerisattachedtotheDNA,thesolutionisdividedintofourtubeslabeled"G","A","T"and"C".Thenreagentsareaddedtothesesamplesasfollows:"G"tube:allfourdNTP's,ddGTPandDNApolymerase"A"tube:allfourdNTP's,ddATPandDNApolymerase"T"tube:allfourdNTP's,ddTTPandDNApolymerase"C"tube:allfourdNTP's,ddCTPandDNApolymerase

四、病毒的鑒定AstheDNAissynthesized,nucleotidesareaddedontothegrowingchainbytheDNApolymerase.However,onoccasionadideoxynucleotideisincorporatedintothechaininplaceofanormalnucleotide,whichresultsinachain-terminatingevent.Forexampleifwelookedatonlythe"G"tube,wemightfindamixtureofthefollowingproducts:Figure1:Anexampleofthepotentialfragmentsthatcouldbeproducedinthe"G"tube.ThefragmentsarealldifferentlengthsduetotherandomintegrationoftheddGTP's.Figure2:Thisisapolyacrylmidegelofthereactionsinthe"G"tube(thesamesequencesseeninfigure1).ThelongerfragmentsofDNAtraveledshorterdistancesthanthesmallerfragmentsbecauseoftheirheaviermolecularweight.Thebluesectionindicatestheprimer,theblacksectionindicatesthenewlysynthesizedstrandandthereddenotesaddGTP,whichterminatedthechainFigure3:Thisisanautoradiogramofadideoxysequencinggel.Thelettersoverthelanesindicatewhichdideoxynucleotidewasusedinthesamplebeingrepresentedbythatlane.Whenyoureadfromthebottomup,youarereadingthe

complementary

sequenceofthetemplatestrand.AutomatedSequencing

BasedonthesameprinciplesofSanger'smethod,automatedsequencinghasbeendevelopedsothatmoreDNAcanbesequencedinashorterperiodoftime.WiththeautomatedproceduresthereactionsareperformedinasingletubecontainingallfourddNTP's,eachlabeledwithadifferentcolordye

四、病毒的鑒定Figure4:Inautomatedsequencing,theoligonucleotideprimerscanbe"end-labeled"withdifferentcolordyes,oneforeachddNTP.Thesedyesfluoresceatdifferentwavelengths,whicharereadviaamachine.Figure5:ResultsofgelelectrophoresisforthedyelabeledDNAinautomatedsequencing.Theimageontheleftshowswhatthegellookslikeifthefourreactionsarerunindifferentlanes,asopposedtotheimageontherightwhichshowsagelwherealltheDNAisruninonelane.Sincethefourdyesfluoresceatdifferentwavelengths,alaserthenreadsthegeltodeterminetheidentityofeachbandaccordingtothewavelengthsatwhichitfluoresces.Theresultsarethendepictedintheformofachromatogram(色譜),whichisadiagramofcoloredpeaksthatcorrespondtothenucleotideinthatlocationinthesequence

Figure6:Resultsfromanautomatedsequenceshownintheformofachromatogram.Thecolorsrepresentthefourbases:blueisC,greenisA,blackisGandredisT

DNA焦磷酸序列分析技術(shù)(Pyrosequencing)一種全新的不依賴平板膠電泳/毛細(xì)管電泳和DNA的熒光標(biāo)記/激發(fā)與檢測(cè)的分析技術(shù)高通量、快速DNA序列分析技術(shù).

四、病毒的鑒定

四、病毒的鑒定lighttimedNTP結(jié)合的過程會(huì)釋放焦磷酸鹽，焦磷酸鹽被硫酸化酶轉(zhuǎn)化為ATP，ATP（在熒光素酶的作用下）就會(huì)促使氧合熒光素的合成并釋放可見光。在測(cè)序過程中,依次加入4種的dNTP,如配對(duì),反應(yīng)發(fā)生,就有可見光的產(chǎn)生。（此過程無需電泳）Pyrosequencing?

四、病毒的鑒定12345678910110-1AAGCTGAGGCAGNucleotidesdispensedsequentiallyThesequenceinthispyrogram?isAGGCAG

四、病毒的鑒定

2005年8月《Nature》，在焦磷酸測(cè)序技術(shù)的基礎(chǔ)上，454公司采用自動(dòng)化的微流技術(shù)（microfluidictechnologies）,同時(shí)分析數(shù)以千計(jì)的DNA分子;基因組DNA進(jìn)行隨機(jī)切割,不在細(xì)菌中進(jìn)行亞克隆或處理單個(gè)克隆。縮短了測(cè)序時(shí)間。比普通Sanger法快100倍。新型測(cè)序采用的介質(zhì)玻片上面有160萬個(gè)孔（普通測(cè)序96孔），一個(gè)典型的反應(yīng)可以在4小時(shí)內(nèi)測(cè)出2千5百萬個(gè)堿基(2500Kb)，其準(zhǔn)確率可達(dá)到99%。454技術(shù)

四、病毒的鑒定新型測(cè)序反應(yīng)分4個(gè)部分1隨機(jī)切割基因組，將雙鏈解旋，給單鏈的DNA加上接頭（adapter）2每顆珠子帶有單一的DNA片段，然后在倒入的含有PCR必需試劑的乳膠顆粒中發(fā)生PCR反應(yīng)。3洗去乳膠物質(zhì)，使DNA變性，將帶有單鏈DNA的珠子加入到光學(xué)纖維玻片上（fiber-opticslide）4加入更小的帶有焦磷酸鹽測(cè)序所需酶的顆粒。光學(xué)纖維玻片每個(gè)孔的直徑大約44μm,深55μm，每個(gè)孔的反應(yīng)容量為75pL（1pL為0.1nL,10-10L）(L,mL,μL，nL)，在1mm2的地方大概有480個(gè)這樣的孔。

四、病毒的鑒定454測(cè)序工作流程圖a光學(xué)纖維玻片裝載的地方，從ATGC瓶子來的溶液垂直流過開放的板面，在那里進(jìn)行DNA合成反應(yīng)。b電荷偶聯(lián)裝置，它負(fù)責(zé)捕獲每個(gè)孔發(fā)出的光子。C負(fù)責(zé)處理信息，與人交互作用的電腦。6．

病毒蛋白檢測(cè)電泳：確定病毒蛋白的數(shù)量及分子大小。血清學(xué)鑒定：抗原、抗體反應(yīng)。免疫沉淀反應(yīng)凝集反應(yīng)補(bǔ)體結(jié)合ELISA

Westernblot免疫熒光免疫電鏡放免

四、病毒的鑒定SDSofthestructuralproteinspreparedfromintactWSSVvirions.8to18%gradientgelNumbersindicatetheexcisedbands.M,proteinmolecularmassmarker(kilodaltons).

Western印跡是通過電泳區(qū)分不同的蛋白組分，并轉(zhuǎn)移至固相支持體，通過特異試劑（抗體）作為探針，對(duì)靶物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，可檢測(cè)到低至1—5ng中等大小的靶蛋白。

Westernblot

四、病毒的鑒定酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)

1966年，酶免疫試驗(yàn)(enzymeimmunoassay,EIA)。

1972年，在EIA的基礎(chǔ)上發(fā)展了ELISA技術(shù)。

四、病毒的鑒定

目前，ELISA在細(xì)菌、病毒、寄生蟲、腫瘤、自身免疫及血液等有關(guān)的抗原、抗體系統(tǒng)的定性或定量測(cè)定領(lǐng)域內(nèi)已被廣泛應(yīng)用。

ELISA:敏感性、特異性快速、簡便大批量標(biāo)本的篩選

四、病毒的鑒定基本原理利用酶與抗體或抗原相結(jié)合后，既保留抗體或抗原的免疫學(xué)反應(yīng)活性，又不影響酶本身的酶活性。抗體或抗原都可用酶標(biāo)記。

四、病毒的鑒定酶結(jié)合物與相應(yīng)抗體或抗原特異結(jié)合后，再遇酶底物時(shí)，在酶的強(qiáng)烈催化作用下，使原來無色的底物產(chǎn)生水解、氧化或還原等化學(xué)反應(yīng)，形成有色的可溶性的產(chǎn)物，便可用肉眼或分光光度計(jì)定性或定量（根據(jù)顏色深淺定量）檢測(cè)其含量。

四、病毒的鑒定FigureA.6.Theprincipleoftheenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA).TodetectantigenA,purifiedantibodyspecificforantigenAislinkedchemicallytoanenzyme.Thesamplestobetestedarecoatedontothesurfaceofplasticwellstowhichtheybindnonspecifically;residualstickysitesontheplasticareblockedbyaddingirrelevantproteins(notshown).Thelabeledantibodyisthenaddedtothewellsunderconditionswherenonspecificbindingisprevented,sothatonlybindingtoantigenAcausesthelabeledantibodytoberetainedonthesurface.Unboundlabeledantibodyisremovedfromallwellsbywashing,andboundantibodyisdetectedbyanenzyme-dependentcolor-changereaction.Thisassayallowsarraysofwellsknownasmicrotiterplatestobereadinfiberopticmultichannelspectrometers,greatlyspeedingtheassay.Modificationsofthisbasicassayallowantibodyorantigeninunknownsamplestobemeasured.

四、病毒的鑒定酶標(biāo)儀測(cè)定各反應(yīng)孔的OD值陽性：標(biāo)本的OD值/陰性對(duì)照的OD值2.1陰性:標(biāo)本的OD值/陰性對(duì)照的OD值1.5可疑:標(biāo)本的OD值/陰性對(duì)照的OD值1.52.1yeasttwo-hybridsystem

Theyeasttwo-hybridsystemisapowerfulscreenforidentifyingprotein-proteinassociations.

7.病毒蛋白與蛋白相互作用

四、病毒的鑒定Nature.1989Jul20;340(6230):245-6.

Anovelgeneticsystemtodetectprotein-proteininteractions.

FieldsS,SongO.

DepartmentofMicrobiology,StateUniversityofNewYorkatStonyBrook,StonyBrook11794.

四、病毒的鑒定

細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4兩個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成:DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNAbindingdomain,DNA-BD)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activationdomain，DNA-AD）結(jié)構(gòu)分開，功能獨(dú)立

四、病毒的鑒定DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-bindingdomain)可識(shí)別DNA上的特異序列，并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)節(jié)的基因的上游轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcription-activatingdomain)可同轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的其他成分作用，啟動(dòng)它所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄。

四、病毒的鑒定Figure.Theyeasttwo-hybridsystemfordetectinggeneinteraction.ThesystemusesthebindingoftwoproteinsundertesttorestorethefunctionoftheGAL4protein,whichactivatesareportergene.Figure.Theyeasttwo-hybridsystem.(A)Ontheleft,ageneforahumanproteinhasbeenligatedtothegenefortheDNA-bindingdomainofayeastactivator.Aftertransformationofyeast,thisconstructspecifiesafusionprotein,parthumanproteinandpartyeastactivator.Ontheright,varioushumanDNAfragmentshavebeenligatedtothegenefortheactivationdomainoftheactivator:theseconstructsspecifyavarietyoffusionproteins.(B)Thetwosetsofconstructsaremixedandcotransformedintoyeast.Acolonyinwhichthereportergeneisexpressedcontainsfusionproteinswhosehumansegmentsinteract,therebybringingtheDNA-bindingandactivationdomainsintoproximityandstimulatingtheRNApolymerase.酵母雙雜交系統(tǒng)主要有二類載體:a含DNA-bindingdomain的載體b含DNA-activatingdomain的載體雙雜交系統(tǒng)的另一個(gè)重要的元件是報(bào)道株。報(bào)道株指經(jīng)改造的、含報(bào)道基因(reportergene)的宿主細(xì)胞。最常用的是酵母細(xì)胞.優(yōu)點(diǎn):〈1〉易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴(kuò)增質(zhì)粒。〈2〉具有可直接進(jìn)行選擇的標(biāo)記基因和特征性報(bào)道基因。〈3〉酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來源于哺乳動(dòng)物的蛋白結(jié)合。

四、病毒的鑒定酵母雙雜交系統(tǒng)的特點(diǎn)與優(yōu)點(diǎn):

⑴省去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。⑵檢測(cè)在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況。⑶基因表達(dá)產(chǎn)物的積累效應(yīng)，蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時(shí)的相互作用也可檢測(cè)。⑷可采用不同組織、器官、細(xì)胞類型和分化時(shí)期材料構(gòu)建cDNA文庫，能分析細(xì)胞漿、細(xì)胞核及膜結(jié)合蛋白等多種不同亞細(xì)胞部位及功能的蛋白。

四、病毒的鑒定應(yīng)用:1、利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能

2、利用酵母雙雜交在細(xì)胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用

四、病毒的鑒定3、利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點(diǎn)以及藥物對(duì)蛋白質(zhì)之間相互作用的影響

4、利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖（GenomeProteinLinkageMap）

四、病毒的鑒定Figure.Amapoftheprotein–proteininteractionsobservedbetweendifferentfunctionalgroupsofproteinsintheyeastS.cerevisiae.

Toproducethismap,morethan1500proteinswereassignedtotheindicated31functionalgroups.About70percentoftheknownprotein–proteininteractionswereobservedtooccurbetweenproteinsassignedtothesamefunctionalgroup.However,asindicated,asurprisinglylargenumberofinteractionscrossedbetweenthesegroups.Eachlineinthisdiagramdesignatesthatmorethan15protein–proteininteractionswereobservedbetweenproteinsinthetwofunctionalgroupsthatareconnectedbythatline.Thethreefunctionalgroupshighlightedinyellowdisplayatleast15interactionswith10ormoreofthe31functionalgroupsdefinedinthestudy.1989年，酵母細(xì)胞核的雙雜交系統(tǒng)局限性：如果Baitprotein是一個(gè)通路中的因子轉(zhuǎn)錄激活或抑制因子，就不能進(jìn)行篩選。酵母細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行雜交，若蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)以后不能定位到核中，就無法檢測(cè)。1997年，酵母細(xì)胞質(zhì)的雙雜交系統(tǒng)優(yōu):1.蛋白更接近天然狀態(tài)，翻譯后有足夠時(shí)間被修飾2.轉(zhuǎn)錄激活及抑制因子均可缺:酵母長的慢

操作難轉(zhuǎn)化效率低表達(dá)真核來源的蛋白可能有毒性1997年,在大腸桿菌中的雙雜交系統(tǒng)大腸桿菌生長迅速轉(zhuǎn)化效率高不存在核定位問題DNA操作簡單PhageDisplayMethodsDetectProteinInteractionsDefinitionPrincipleApplication

四、病毒的鑒定In1985,GeorgeP.Smith,FatherofPhageDisplay,inventedphagedisplay

InventionBackground?GeorgeP.Smith–Alternativevectors1984,1985–Mappingepitopes/peptideslibrary1988–Monoclonalantibody/antibodylibrary1988.10–Drugs/peptideligandsforreceptors1988.12?FilamentousFusionPhage:NovelExpressionVectorsThatDisplayClonedAntigensontheVirionSurface–Science,1985,228:1315Phagedisplay,

anexpressioncloningmethodinwhichforeigngenesareinsertedintoaphagevectorandareexpressedtogivepolypeptidesthataredisplayedonthesurface(proteincoat,capside)ofthephage.

DefinitionGeneticengineeringtechniquesareusedtoinsertforeignDNAfragmentsintoasuitablephagecoatproteingene.Themodifiedgenecanthenbeexpressedasafusionproteinwhichisincorporatedintothevirionanddisplayedonthesurfaceofthephagewhich,however,retainsinfectivity(fusionphage).Ifanantibodyisavailableforaspecificprotein,phagedisplayingthatproteincanbeselectedbypreferential(優(yōu)先的)bindingtotheantibody:affinitypurificationofvirionsbearingatargetdeterminantcanbeachievedfroma108-foldexcessofphagenotbearingthedeterminant,usingevenminutequantitiesoftherelevantantibody.

PrincipleofphagedisplayBycloninglargenumbersofDNAsequencesintothephage,displaylibrariesareproducedwithmanybillionsofuniquedisplayedproteins.

四、病毒的鑒定Usingaprocessofbiopanning（生物淘洗）,onecanrescuephagethatdisplayaproteinthatspecificallybindstoatargetofinterest.Briefly,asimplemethodforbiopanninginvolves:coatingaplatewiththetargetincubatingthelibraryontheplatetoallowphagedisplayingacomplementaryproteintothetargettobindNon-bindingphagearethenwashedawayandthosethatareboundareeluted（洗提，洗脫，淘洗）.Infectionofbacteriawiththebindingphageresultsinphageamplification.

Successiveroundsofbiopanningenrichthepoolofphage,withclonesthatspecificallybindthetarget.PhagedisplayhasmanyapplicationsSeveralusefulapplicationshavebeendevised:Antibodyengineering.Phagedisplayisprovingapowerfulalternativesourceofconstructingantibodies,includinghumanizedantibodies,bypassingimmunizationandevenhybridomatechnologyGeneralproteinengineering.Phagedisplayisapowerfuladjuncttorandommutagenesisprogramsasawayofselectingfordesiredvariantsfromalibraryofmutants.Studyingprotein-proteininteractions.Thisisalibrary-basedmethodwhichcanbeusedtoidentifyproteinsthatinteractwithagivenprotein.Thegivenproteincanselectfusionphagewhichdisplayanyotherproteinsthatsignificantlybindtoit.Application

四、病毒的鑒定Antibodyengineering

Theessenceofthismethodisthatthegenesegmentsencodingantibodyheavyandlightchainvariablesequencesareclonedandexpressedonthesurfaceofafilamentousbacteriophage,andrarephageareselectedfromacomplexpopulationbybindingtoanantigenofinterest.

四、病毒的鑒定Figure.Theproductionofantibodiesbygeneticengine