cDNA和基因組文庫DNA的構(gòu)建課件

第九章

cDNA文庫和基因組文庫構(gòu)建第九章

cDNA文庫和基因組文庫構(gòu)建基因組文庫是含有某種生物體全部基因的隨機片段的重組DNA克隆群體；cDNA文庫是指含有所有重組cDNA的克隆群體。

基因組文庫：來源于基因組DNA，反映基因組的全部信息，用于基因組物理圖譜的構(gòu)建，基因組序列分析，基因在染色體上的定位，基因組中基因的結(jié)構(gòu)和組織形式等。

cDNA文庫：來源于細胞表達出的RNA，反映基因組表達的基因序列信息，用于研究特定細胞中基因的表達狀態(tài)和表達基因的功能等。

基因文庫＝基因組文庫＋cDNA文庫基因組文庫是含有某種生物體全部基因的隨機片段的重組DN一、載體的種類和特征：受體細胞結(jié)構(gòu)插入片段舉例質(zhì)粒E.coli環(huán)狀很小，<8kbpUC18/19,T-載體,

pGEM3zλ噬菌體E.coli線狀9-24kbEMBL，λgt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀<10kbM13系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35-45kbBACE.coli環(huán)狀約300kbPACE.coli環(huán)狀100-800kbPCYPACYAC酵母細胞線性染色體100-2000kbMAC哺乳動物細胞環(huán)狀>1000kb病毒載體動物細胞環(huán)狀SV40載體，昆蟲桿狀病毒載體穿梭載體動物細胞和細菌環(huán)狀pSVK3質(zhì)粒，PBV,Ti質(zhì)粒，一、載體的種類和特征：受體細胞結(jié)構(gòu)插入片段舉例質(zhì)粒E.col二、cDNA文庫的構(gòu)建分為六個階段：

階段1：反轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA第一鏈

階段2：cDNA第二鏈的合成

階段3：cDNA的甲基化

階段4：接頭或銜接子的連接

階段5：Sepharose

CL-4B凝膠過濾法分離cDNA

階段6：cDNA與λ噬菌體臂的連接

二、cDNA文庫的構(gòu)建分為六個階段：

階段1：反轉(zhuǎn)錄酶催化cDNA文庫的構(gòu)建mRNA

反轉(zhuǎn)錄cDNA(互補DNA）第二條DNA鏈cDNA文庫的構(gòu)建mRNA1：反轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA第一鏈

1.1.在置于冰上的無菌微量離心管內(nèi)混合下列試劑進行cDNA第一鏈的合成：

poly(A)

RNA

(1μg/μl)

10μl

寡核苷酸引物(1μg/μl)

1μl

1mol/L

Tris-HCl

(pH8.0,

37℃)

2.5μl

1mol/L

KCl

3.5μl

250

mmol/L

MgCl2

2μl

dNTP溶液（含4種dNTP，每種5mmol/L）

10μl

0.1

mol/L

DTT

2μl

RNase抑制劑（選用）

25單位

加H2O至

48μl

1.2.當(dāng)所有反應(yīng)組在0℃混合后，取出2.5μl反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到另一個0.5ml微量離心管內(nèi)。在這個小規(guī)模反應(yīng)管中加入0.1μl

[α-32P]

dCTP（400

Ci/mmol,

10mCi/ml）。

1：反轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA第一鏈

1.1.在置于冰上1.3.大規(guī)模和小規(guī)模反應(yīng)管都在37℃溫育1h。

1.4.溫育接近結(jié)束時，在含有同位素的小規(guī)模反應(yīng)管中加入1μl

0.25mol/L

EDTA，然后將反應(yīng)管轉(zhuǎn)移到冰上。大規(guī)模反應(yīng)管則在70℃溫育10

min，然后轉(zhuǎn)移至冰上。

1.5.測定0.5μl小規(guī)模反應(yīng)物中放射性總活度和可被三氯乙酸（TCA）沉淀的放射性活度。此外，用合適的DNA分子質(zhì)量參照物通過堿性瓊脂糖凝膠電泳對小規(guī)模反應(yīng)產(chǎn)物進行分析是值得的。

1.6.按下述方法計算cDNA第一鏈的合成量[摻入的活度值(cpm)/總活度值]×66(μg)=合成的cDNA第一鏈(μg)

1.7.盡可能快地進行cDNA合成的下一步驟。1.3.大規(guī)模和小規(guī)模反應(yīng)管都在37℃溫育1h。

12：cDNA第二鏈的合成

2.1：cDNA第二鏈的合成將下列試劑直接加入大規(guī)模第一鏈反應(yīng)混合物中、10mMol/Lmgcl270ul2mM/LTris-Hcl(PH7.4)5ul

10

mCi/ml[α-32P]

dCTP（400

Ci/mmol）

10μl

1

mol/L

(NH4)2SO4

1.5μl

RNase

H

(1000單位/ml)

1μl

大腸桿菌DNA聚合酶I

(10

000單位/ml)

4.5μl

溫和振蕩將上述試劑混合，在微量離心機稍離心，以除去所有氣泡。在16℃溫育2~4h。

2.2.溫育結(jié)束，將下列試劑加到反應(yīng)混合物中：

β-NAD

(50

mmol/L)

1μl

大腸桿菌DNA連接酶(1000~4000單位/ml)

1μl

室溫溫育15min。

2：cDNA第二鏈的合成

2.1：cDNA第二鏈的合成將2.3.溫育結(jié)束，加入1μl含有4種dNTP的混合物和2μl

T4噬菌體DNA聚合酶。反應(yīng)混合物室溫溫育15分鐘。

2.4.取出3μl反應(yīng)物，按步驟7和8描述的方法測定第二鏈DNA的質(zhì)量。

2.5.將5μl

0.5

mol/L

EDTA

(pH8.0)加入剩余的反應(yīng)物中，用酚：氯仿和氯仿分別抽提混合物一次。在0.3

mol/L(pH5.2)乙酸鈉存在下，通過乙醇沉淀回收DNA，將DNA溶解在90μl

TE(pH7.6)溶液中。

2.6.將下列試劑加到DNA溶液中：

10×T4多核苷酸激酶緩沖液

10μl

T4多核苷酸激酶（3000單位/ml）

1μl

室溫溫育15分鐘。

2.7.測定從上面步驟4取出的3μl反應(yīng)物中放射性活度，測定1μl第二鏈合成產(chǎn)物中能被三氯乙酸沉淀的放射性活度。

2.3.溫育結(jié)束，加入1μl含有4種dNTP的混合物和22.8.用下面公式計算第二鏈反應(yīng)中所合成的cDNA量。要考慮到已摻入到DNA第一鏈種的dNTP的量。

[第二鏈反應(yīng)中所摻入的活度值(cpm)/總活度值(cpm)]*(66μg

-xμg)=cDNA第二鏈合成量/μg

x表示cDNA第一鏈量。CDNA第二鏈合成量通常為第一鏈量的70~80%

2.9.用等量酚：氯仿對含有磷酸化cDNA（來自步驟6）的反應(yīng)物進行抽提。2.10.

Sephadex

G-50用含有10

mmol/L

NaCl的TE(pH7.6)溶液進行平衡，然后通過離子柱層析將未摻入的dNTP和cDNA分開。

2.8.用下面公式計算第二鏈反應(yīng)中所合成的cDNA量。要2.11.

加入0.1倍體積的3mol/L乙酸鈉（pH5.2）和2倍體積的乙醇，沉淀柱層析洗脫下來的cDNA，將樣品置于冰上至少15分鐘，然后在微量離心機上以最大速度4℃離心15分鐘，回收沉淀DNA。用手提微型監(jiān)測儀檢查，是否所有放射性都沉淀下來。

2.12.

用70%乙醇洗滌沉淀物，重復(fù)離心。

2.13.

小心吸出所有液體，空氣干燥沉淀物。

2.14.

如果需要用EcoR

I甲基化酶對cDNA進行甲基化，可將cDNA溶解于80μl

TE(pH7.6)溶液中。另外，如果要將cDNA直接與Not

I或Sal

I接頭或寡核苷酸銜接子相連，可將cDNA懸浮在29μl

TE(pH7.6)溶液。沉淀的DNA重新溶解后，盡快進行cDNA合成的下一步驟。2.11.

加入0.1倍體積的3mol/L乙酸鈉（pH53：cDNA的甲基化3.1.在cDNA樣品中加入以下試劑：

2

mol/L

Tris-HCl

(pH8.0)

5μl

5

mol/L

NaCl

2μl

0.5

mol/L

EDTA(pH8.0)

2μl

20

mmol/L

S-腺苷甲硫氨酸

1μl

加H2O至

96μl

3.2.取出兩小份樣品（各2μl）至0.5ml微量離心管中，分別編為1號和2號，置于冰上。

3.3.在余下的反應(yīng)混合液中加入2μl

EcoR

I

甲基化酶（80

000單位/ml），保存在0℃直至步驟4完成。

3.4.再從大體積的反應(yīng)液中吸出另外兩小分樣品（各2μl）至0.5ml微量離心管中，分別編為3號和4號。

3：cDNA的甲基化3.1.在cDNA樣品中加入以下試劑3.5.在所有四小份樣品（來自步驟2和步驟4）加入100

ng質(zhì)粒DNA或500

ng的λ噬菌體DNA。這些未甲基化的DNA在預(yù)實驗中用作底物以測定甲基化效率。

3.6.所有四份小樣實驗反應(yīng)和大體積的反應(yīng)均在37℃溫育1h。

3.7.于68℃加熱15min，用酚：氯仿抽提大體積反應(yīng)液一次，再用氯仿抽提一次。

3.8.在大體積反應(yīng)液中加入0.1倍體積的3

mol/L乙酸鈉（pH5.2）和2倍體積的乙醇，混勻后貯存于-20℃直至獲得小樣反應(yīng)結(jié)果。3.5.在所有四小份樣品（來自步驟2和步驟4）加入100

3.

9.按下述方法分析4個小樣對照反應(yīng)：

a.

在每一對照反應(yīng)中分別加入：

0.1

mol/L

MgCl2

2μl

10×EcoR

I

緩沖液

2μl

加H2O至

20μl

b.

在2號和4號反應(yīng)管中分別加入20單位EcoR

I。

c.

四個對照樣品于37℃溫育1h，通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。

3.10.

微量離心機以最大速度離心15min(4℃)以回收沉淀cDNA。棄上清，加入200μl

70%乙醇洗滌沉淀，重復(fù)離心。

3.11.

用手提式微型探測器檢查是否所有放射性物質(zhì)均被沉淀。小心吸出乙醇，在空氣中晾干沉淀，然后將DNA溶于29μl

TE（pH8.0）。

3.12.

盡可能快地進行cDNA合成的下一階段。

3.9.按下述方法分析4個小樣對照反應(yīng)：

a.

在每4：接頭或銜接子的連接

cDNA末端的削平

4.1.cDNA樣品于68℃加熱5

min。

4.2.將cDNA溶液冷卻至37℃并加入下列試劑：

5×T4噬菌體DNA聚合酶修復(fù)緩沖液

10μl

dNTP溶液，每種5

mmol/L

5μl

加H2O至

50μl

4.3.加入1~2單位T4噬菌體DNA聚合酶（500單位/ml），37℃溫育15min。

4.4.加入1μl

0.5mol/L

EDTA(pH8.0)，以終止反應(yīng)。

4：接頭或銜接子的連接cDNA末端的削平

4.1.cDN4.5.用酚：氯仿抽提，再通過Sephadex

G-50離心柱層析，除去未摻入的dNTP。

4.6.在柱流出液中加入0.1倍體積的3

mol/L

乙酸鈉（pH5.2）和二倍體積的乙醇，樣品于4℃至少放置15

min。

4.7.在微量離心機上以最大速度離心15

min(4℃)，回收沉淀的cDNA。沉淀經(jīng)空氣干燥后溶于13μl的10

mmol/L

Tris-HCl

(pH8.0).接頭-銜接子與cDNA的連接

4.5.用酚：氯仿抽提，再通過Sephadex

G-50離心4.8.將下列試劑加入到已削成平末端的DNA中：

10×T4噬菌體DNA聚合酶修復(fù)緩沖液

2μl

800~1000

ng的磷酸化接頭或銜接子

2μl

T4噬菌體DNA連接酶（105

Weiss單位/ml）

1μl

10

mmol/L

ATP

2μl

混勻后，在16℃溫育8~12h。

4.9.從反應(yīng)液中吸出0.5μl貯存于4℃，其余反應(yīng)液于68℃加熱15min以滅活連接酶。4.8.將下列試劑加入到已削成平末端的DNA中：

10×T5：Sepharose

CL-4B凝膠過濾法分離cDNA

Sepharose

CL-4B柱的制備

5.1.用帶有彎頭的皮下注射針頭將棉拭的一半推進1ml滅菌吸管端部，用無菌剪刀剪去露在吸管外的棉花并棄去，再用濾過的壓縮空氣將余下的棉拭子吹至吸管狹窄端。

5.2.將一段無菌的聚氯乙烯軟管與吸管窄端相連，將吸管寬端浸于含有0.1

mol/L

NaCl的TE（pH7.6）溶液中。將聚氯乙烯管與相連于真空裝置的錐瓶相接。輕緩抽吸，直至吸管內(nèi)充滿緩沖液，用止血鉗關(guān)閉軟管。

5：Sepharose

CL-4B凝膠過濾法分離cDNA

S5.3.在吸管寬端接一段乙烯泡沫管，讓糊狀物靜置數(shù)分鐘，放開止血鉗，當(dāng)緩沖液從吸管滴落時，層析柱亦隨之形成。如有必要，可加入更多的Sepharose

CL-4B，直至填充基質(zhì)幾乎充滿吸管為止。

5.4.將幾倍柱床體積的含0.1

mol/L氯化鈉的TE(pH7.6)洗滌柱子。洗柱完成后，關(guān)閉柱子底部的軟管。

依據(jù)大小分離回收DNA

5.3.在吸管寬端接一段乙烯泡沫管，讓糊狀物靜置數(shù)分鐘，5.5.用巴斯德吸管吸去柱中Sepharose

CL-4B上層的液體，將cDNA加到柱上（體積50μl或更?。?，放開止血鉗，使cDNA進入凝膠。用50μl

TE(pH7.6)洗滌盛裝cDNA的微量離心管，將洗液亦加于柱上。用含0.1

mol/L

NaCl的TE(pH7.6)充滿泡沫管。

5.6.用手提式小型探測器監(jiān)測cDNA流經(jīng)柱子的進程。放射性cDNA流到柱長2/3時，開始用微量離心管收集，每管2滴，直至將所有放射性洗脫出柱為止。

5.7.用切侖科夫計數(shù)器測量每管的放射性活性。

5.8.從每一管中取出一小份，以末端標記的已知大?。?.2kb~5kb）的DNA片斷作標準參照物，通過1%瓊脂凝膠電泳進行分析，將各管余下部分貯存于-20℃，直至獲得瓊脂糖凝膠電泳的放射自顯影片。5.5.用巴斯德吸管吸去柱中Sepharose

CL-45.9.電泳后將凝膠移至一張Whatman

3MM濾紙上，蓋上一張Saran包裝膜，并在凝膠干燥器上干燥。干燥過程前20min至30min于50℃加熱凝膠，然后停止加熱，在真空狀態(tài)繼續(xù)干燥1~2h.

5.10.

置-70℃加增感屏對干燥的凝膠繼續(xù)X射線曝光。

5.11.

在cDNA長度≥500bp的收集管中，加入0.1倍體積的3mol/L乙酸鈉（pH5.2）和二倍體積的乙醇。于4℃放置至少15min使cDNA沉淀，用微量離心機于4℃以12

000g離心15min，以回收沉淀的cDNA。

5.9.電泳后將凝膠移至一張Whatman

3MM濾紙上5.12.

將DNA溶于總體積為20μl的10

mmol/L

Tris-HCl(pH7.6)中。

5.13.

測定每一小份放射性活度。算出選定的組分中所得到的總放射性活度值。計算可用于λ噬菌體臂相連接的DNA總量。

[選定組分的總活度值(cpm)/摻入到第二鏈的活度值(cpm)]*2xμg

cDNA第二鏈合成量=可用于連接的cDNA

5.12.

將DNA溶于總體積為20μl的10

mmol6：cDNA與λ噬菌體臂的連接6.1.按下述方法建立4組連接-包裝反應(yīng)：連接A(μl)B(μl)C(μl)D(μl)λ噬菌體DNA(0.5μg/μl)1.01.01.01.010×T4DNA連接酶緩沖液1.01.01.01.0cDNA0ng5ng10ng50ngT4噬菌體DNA連接酶（105Weiss單位/ml）0.10.10.10.110mmol/LATP1.01.01.01.0加H2O至10101010連接混合物于16℃培育4~16h。剩余的cDNA儲存于-20℃。

6.2.按包裝提取物廠商提供的方法，從每組連接反應(yīng)物中取5μl包裝到噬菌體顆粒中。

6.3.包裝反應(yīng)完成后，在各反應(yīng)混合物中加入0.5mlSM培養(yǎng)基。

6：cDNA與λ噬菌體臂的連接6.1.按下述方法建立4組6.4.預(yù)備適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌株新鮮過夜培養(yǎng)物，包裝混合物做100倍稀釋，各取10μl和100μl涂板，于37℃或42℃培養(yǎng)8~12小時。

6.5.計算重組噬菌斑和非重組噬菌斑，連接反應(yīng)A不應(yīng)產(chǎn)生重組噬菌斑，而連接反應(yīng)B、C和D應(yīng)產(chǎn)生數(shù)目遞增的重組噬菌斑。

6.6.根據(jù)重組噬菌斑的數(shù)目，計算cDNA的克隆效率。

6.7.挑取12個重組λ噬菌體空斑，小規(guī)模培養(yǎng)裂解物并制備DNA，以供適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶消化。

6.8.通過1%瓊脂凝膠電泳分析cDNA插入物的大小，用長度范圍500bp~5kb的DNA片段作為分子質(zhì)量參照。6.4.預(yù)備適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌株新鮮過夜培養(yǎng)物，包裝混合物做注意要點cDNA雙鏈合成的注意要點:所有合成cDNA第一條鏈的方法都要依賴于ＲＮＡ的ＤＮＡ聚合酶（反轉(zhuǎn)錄酶）來催化反應(yīng)，合成中有兩個關(guān)鍵因素，一個是mＲＮＡ模板，一個是反轉(zhuǎn)錄酶．注意要點cDNA雙鏈合成的注意要點:

保證獲得足夠數(shù)量和高質(zhì)量的起始ＲＮＡ

模板mＲＮＡ的質(zhì)量直接影響到cDNA合成的效率，完成和均一是衡量mＲＮＡ質(zhì)量的兩個標準．

反轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄效率是關(guān)鍵中的關(guān)鍵．

保證獲得足夠數(shù)量和高質(zhì)量的起始ＲＮＡ

模板mＲＮＡ的質(zhì)量cDNA文庫構(gòu)建后期的注意要點反轉(zhuǎn)錄后至包裝噬菌體外殼蛋白之前的諸多步驟操作按部就班，但其中的cDNA層析柱分級很重要．注重載體與cDNA的連接效率、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化大腸桿菌的效率cDNA文庫構(gòu)建后期的注意要點反轉(zhuǎn)錄后至包裝噬菌體外殼蛋白之

三、基因組DNA文庫的構(gòu)建將總DNA經(jīng)過酶解，經(jīng)蔗糖梯度離心或瓊脂糖凝膠電泳分離不同長短的DNA片段。包含的基因組片段分別克隆在質(zhì)粒或噬菌體載體上，轉(zhuǎn)染細菌或體外包裝到噬菌體顆粒上便構(gòu)成了該生物的基因組文庫。三、基因組DNA文庫的構(gòu)建

1.基因組文庫構(gòu)建步驟

1.1載體DNA的制備：

高分子量的外源DNA

100-150kb1.2載體DNA酶切反應(yīng)（常用BamHI）1.3載體臂的純化（蔗糖密度梯度離心）

1.4載體脫磷處理

（堿性磷酸酶）

載體：

l噬菌體：48.5kb,插入型(最多可容納9kb)、取代型(可容納38-51kb，最適19-20kb)，

EMBL,

Charon粘性質(zhì)粒(Cosmid)：4-6kb,

質(zhì)粒+噬菌體的性質(zhì)，可容納大片段的外源基因，最多可容納46kb。

酵母人工染色體克隆體系（YAC，Yeast

Artificial

Chromosome

Cloning

System）

插入大小200—1000kb

·

1.1載體DNA的制備：

高分子量的外源DNA

100-11.5連接和包裝：外源片段與兩臂之間的比例，包裝蛋白

感染宿主菌：選擇合適的宿主菌，LE392,

NM538,

NM539,KW251等

1.6克隆文庫的保存和擴增：完整性和代表性

測滴度，要在106fu以上;

保存，氯仿4℃，7%

DMSO

-70℃

1.5連接和包裝：外源片段與兩臂之間的比例，包裝蛋白

人類染色體3X109，平均插入片段大小17

kb

人類染色體3X109，平均插入片段大小17

kb生物芯片生物芯片簡單地說，生物芯片就是在一塊指甲大小的玻片、硅片、尼龍膜等材料上放上生物樣品，然后由一種儀器收集信號，用計算機分析數(shù)據(jù)結(jié)果。目前制備芯片的固相材料有玻片、硅片、金屬片、尼龍膜等。目前較為常用的支持材料是玻片，因為玻片適合多種合成方法，而且在制備芯片前對玻片的預(yù)處理也相對簡單易行。生物芯片生物芯片簡單地說，生物芯片就是在一塊指甲大小的玻片、生物芯片是八十年代末在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來的一項高新技術(shù)，它主要是指通過微加工技術(shù)和微電子技術(shù)在固格體芯片表面構(gòu)建的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實現(xiàn)對細胞、蛋白質(zhì)、DNA以及其他生物組分的準確、快速、大信息量的檢測。常用的生物芯片分為三大類：即基因芯片、蛋白質(zhì)芯片和芯片實驗室。生物芯片的主要特點是高通量、微型化和自動化。芯片上集成的成千上萬的密集排列的分子微陣列，能夠在短時間內(nèi)分析大量的生物分子，使人們快速準確地獲取樣品中的生物信息，效率是傳統(tǒng)檢測手段的成百上千倍。它將是繼大規(guī)模集成電路之后的又一次具有深遠意義的科學(xué)技術(shù)革命。生物芯片是八十年代末在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來的一項高新技進入二十一世紀，隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，電子技術(shù)和生物技術(shù)相結(jié)合誕生了半導(dǎo)體芯片的兄弟——生物芯片，這將給我們的生活帶來一場深刻的革命。這種革命對于我國，乃至全世界的可持續(xù)發(fā)展都會起到不可估量的貢獻。進入二十一世紀，隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，電子技術(shù)和生物技術(shù)相1.生物芯片的種類

通常的生物化學(xué)反應(yīng)過程包括三步，即樣品的制備，生化反應(yīng)、結(jié)果的檢測和分析?？蓪⑦@三步不同步驟集成為不同用途的生物芯片，所以據(jù)此可將生物芯片分為不同的類型。例如用于樣品制備的生物芯片，生化反應(yīng)生物芯片及各種檢測用生物芯片等。現(xiàn)在，已經(jīng)有不少的研究人員試圖將整個生化檢測分析過程縮微到芯片上，形成所謂的“芯片實驗室”(Lab-on-chip)。“芯片實驗室”通過微細加工工藝制作的微濾器、微反應(yīng)器、微泵、微閥門、微電極等以實現(xiàn)對生物樣品從制備、生化反應(yīng)到檢測和分析的全過程，從而極大地縮短的檢測和分析時間，節(jié)省了實驗材料。

1.生物芯片的種類

通常的生物化學(xué)反應(yīng)過程包括三步，即樣品樣品制備芯片的目的是將通常需要在實驗室進行的多個操作步驟集成于微芯片上。目前，樣品制備芯片主要通過升溫、變壓脈沖以及化學(xué)裂解等方式對細胞進行破碎，通過微濾器、介電電泳等手段實現(xiàn)生物大分子的分離。

生化反應(yīng)芯片即在芯片上完成生物化學(xué)反應(yīng)。與傳統(tǒng)生化反應(yīng)過程的區(qū)別主要在于它可以高效、快速地完成生物化學(xué)反應(yīng)。例如，在芯片上進行PCR反應(yīng)，可以節(jié)約實驗試劑，提高反應(yīng)速度，并可完成多個片段的擴增反應(yīng)。當(dāng)前，由于檢測和分析的靈敏度所限，通常在對微量核酸樣品進行檢測時必需事先對其進行一定程度的擴增。所以用于PCR的芯片無疑為快速大量擴增樣品多個DNA片段提供了有力的工具。

樣品制備芯片的目的是將通常需要在實驗室進行的多個操作步驟集成檢測芯片顧名思義是用來檢測生物樣品的。例如用毛細管電泳芯片進行DNA突變的檢測，用于表達譜檢測、突變分析、多態(tài)性測定的DNA微點陣芯片（也稱DNA芯片、基因芯片），用于大量不同蛋白檢測和表位分析的蛋白或多肽微點陣芯片（也稱蛋白或多肽芯片）。

檢測芯片顧名思義是用來檢測生物樣品的。例如用毛細管電泳芯片進

芯片實驗室是生物芯片技術(shù)發(fā)展的最終目標。它將樣品的制備、生化反應(yīng)到檢測分析的整個過程集約化形成微型分析系統(tǒng)。現(xiàn)在，已經(jīng)有由加熱器、微泵、微閥、微流量控制器、微電極、電子化學(xué)和電子發(fā)光探測器等組成的芯片實驗室問世，并出現(xiàn)了將生化反應(yīng)、樣品制備、檢測和分析等部分集成的芯片。例如可以將樣品的制備和PCR擴增反應(yīng)同時完成于一塊小小的芯片之上。再如GeneLogic公司設(shè)計制造的生物芯片可以從待檢樣品中分離出DNA或RNA，并對其進行熒光標記，然后當(dāng)樣品流過固定于柵欄狀微通道內(nèi)的寡核苷酸探針時便可捕獲與之互補的靶核酸序列。應(yīng)用其自己開發(fā)的檢測設(shè)備即可實現(xiàn)對雜交結(jié)果的檢測與分析。這種芯片由于寡核苷酸探針具有較大的吸附表面積，所以可以靈敏地檢測到稀有基因的變化。同時，由于該芯片設(shè)計的微通道具有濃縮和富集作用，所以可以加速雜交反應(yīng)，縮短測試時間，從而降低了測試成本。

綜觀生物芯片的發(fā)展，檢測用生物芯片的發(fā)展最為迅猛。目前，檢測用生物芯片主要為微點陣技術(shù)。

芯片實驗室是生物芯片技術(shù)發(fā)展的最終目標。cDNAArray和MicroArraycDNAArray即cDNA列陣，或譯作矩陣，由排列在96孔板大小的少到幾十個，多至上萬個不同基因的cDNA點組成。MicroArray被譯作“基因芯片”，或譯作“微矩陣”，這個矩陣由點在大如載玻片，小如指甲大小面積的固定介質(zhì)表面的上百至數(shù)千個特定的基因組成。是cDNAArray的微型化。cDNAArray和MicroArraycDNA和基因組文庫DNA的構(gòu)建課件cDNA和基因組文庫DNA的構(gòu)建課件cDNA和基因組文庫DNA的構(gòu)建課件MicroArray的工作原理是將欲研究細胞組織的RNA通過不同的方式轉(zhuǎn)錄成cDNA，轉(zhuǎn)錄過程中或之后給予熒光等標記，制成探針，然后在嚴格的條件下使該探針與微矩陣上的基因雜交，雜交后，把未雜交的基因洗脫，在一定的條件下，觀察雜交結(jié)果，以了解某特定組織中基因轉(zhuǎn)錄的多寡和特征。如果兩個組織的RNA用不同發(fā)光色彩的熒光標記，同時進行雜交，由于兩個組織雜交后所激發(fā)的熒光色彩不同，微矩陣上與甲組織特有探針結(jié)合則產(chǎn)生甲探針的光色，與乙組織特有探針結(jié)合則產(chǎn)生乙探針的光色，兩種探針同時結(jié)合則產(chǎn)生相兼色。這樣在一塊基因芯片上就可以方便、迅速、大規(guī)模地觀察兩個不同組織基因轉(zhuǎn)錄的異同。MicroArray的工作原理是將欲研究細胞組織的RNA通過在基因芯片問世的短短幾年來，一些改進型的基因芯片技術(shù)陸續(xù)問世，并迅速形成產(chǎn)品。比如GeneChip。其特點為：1）容量大，每個芯片上可以達39000個基因，因此，單位時間內(nèi)識別的基因多且快；2）在基因矩陣上每個點由上下兩排更小的矩陣組成，每排由16-20個與某一mRNA不同區(qū)域?qū)?yīng)的25個寡核苷酸組成。上下兩行中，上行為正?；蛐蛄?，下行為中間有點突變的序列。這樣在相同嚴格的雜交和洗脫條件下，上行基因16-20個點應(yīng)該全部陽性反應(yīng)，而下行基因因含有點突變，退火結(jié)合后不夠穩(wěn)定，會被洗脫。因而這樣僅上行呈陽性的雜交才算有效。所以在避免假陽性方面具有別的芯片所無法比擬的優(yōu)勢。還如discoveryARRAY。該芯片把RFDD-PCR（限制性片段差異展示PCR）技術(shù)與MicroArray技術(shù)結(jié)合在一道。由于mRNA拷貝為PCR所放大，極大豐富地擴增了一些微量轉(zhuǎn)錄的mRNA，使之得以清晰地反映在Array上。我國也開始了基因芯片的研制和開發(fā)。在基因芯片問世的短短幾年來，一些改進型的基因芯片技術(shù)陸續(xù)問世通過對現(xiàn)狀的回顧，可以看出，當(dāng)前的基因芯片技術(shù)還有以下一些問題：1．要求專門設(shè)備，國內(nèi)尚未普及。2．研究成本高。3．不是所有常用生物均有全RNA組芯片。4．實驗數(shù)據(jù)龐大。5．大量的基因功能還不明朗。通過對現(xiàn)狀的回顧，可以看出，當(dāng)前的基因芯片技術(shù)還有以下一些問雖然如此，基因芯片技術(shù)已展現(xiàn)出絢麗的前景：1．已經(jīng)出品了人類全套基因組芯片，使基因芯片完全實用。2．當(dāng)基因芯片生產(chǎn)技術(shù)趨于成熟，開始象轎車、家用電器生產(chǎn)的批量化、規(guī)?；?，已經(jīng)實現(xiàn)降低生產(chǎn)成本，降低售價，便于普及。3．一旦類似高效的蛋白芯片技術(shù)的解決，與基因芯片的配套使用，將會對生命科學(xué)研究取得質(zhì)的突破。4．生物計算技術(shù)的發(fā)展，芯片結(jié)果自動化分析程度增加，將使人類更好、更快地駕馭基因芯片的海量信息。5．不同基因功能研究的積累，以及基因功能研究技術(shù)的發(fā)展與普及，使基因芯片研究的后續(xù)工作得以有效的開展，基因芯片的學(xué)術(shù)價值將得到革命性的發(fā)展。6．互聯(lián)網(wǎng)海量生物信息開放和不斷豐富，以及有關(guān)計算機輔助系統(tǒng)的發(fā)展與升級，使芯片結(jié)果的分析與深入研究空前的便利。雖然如此，基因芯片技術(shù)已展現(xiàn)出絢麗的前景：與基因芯片原理類似的有cDNAArray。CLONTECHLaboratories公司的AtlascDNAExpressionArrays是其代表。其cDNAArray的矩陣點由肉眼可見大小的cDNA點組成，點于96孔板大小的硝酸纖維素膜上。工作原理是，抽提組織的總RNA或進一步分離mRNA，用反轉(zhuǎn)錄酶和同位素反轉(zhuǎn)錄mRNA成cDNA探針，與膜上的cDNA雜交，放射自顯影。不同的組織分別用一張膜。其放射自顯影結(jié)果可以用肉眼識別。該公司還配套有分析軟件，實驗結(jié)果掃描后可以通過軟件比較不同組織基因轉(zhuǎn)錄的差異。因此該Array的優(yōu)點為1）不要求專用儀器設(shè)備，一般實驗室均可以操作。2）實驗結(jié)果肉眼可以識別，以便調(diào)整曝光時間，以獲取最佳實驗結(jié)果。3）配套有分析軟件，可以借助普通掃描儀和計算機分析實驗結(jié)果。與基因芯片原理類似的有cDNAArray。CLONTECHcDNA和基因組文庫DNA的構(gòu)建課件cDNA和基因組文庫DNA的構(gòu)建課件cDNA和基因組文庫DNA的構(gòu)建課件但是我們使用下來有以下一些缺點：1）一般組織絕大部分的RNA豐度不夠，導(dǎo)致大多數(shù)雜交的重復(fù)性差。由此造成定量的困難和錯誤，給后續(xù)研究帶來困難。2）制膜的技術(shù)性問題。比如小鼠Array的雜交背景高，影響到實驗結(jié)果的分析。3）軟件在消除背景方面的智能化技術(shù)尚不成熟，影響到結(jié)果的分析。但是我們使用下來有以下一些缺點：4）Array的基因數(shù)量少，約1200個。遠遠不能與一般組織大量轉(zhuǎn)錄的mRNA匹配。與此技術(shù)類似的Array，有單病種Array（如前面所介紹，也可以是MicroArray），但是制作在硝酸纖維膜上的Array以其價廉方便似乎更有優(yōu)勢。其原理是，通過對某一疾病基因譜改變的了解，依據(jù)若干不同基因譜變化的特征，設(shè)計出針對單病種的Array。這些Array上所含的基因有限，包含了某一病種不同基因譜的關(guān)鍵基因，因而成本低，適用于臨床的輔助診斷。4）Array的基因數(shù)量少，約1200個。遠遠不能與一般組織中科院上海細胞研究所德國馬普學(xué)會聯(lián)合實驗室曾開發(fā)cDNAArray，在96孔板大小的纖維素膜上點制成含16000個左右基因的Array。信息量大。由于基因點小而密，肉眼無法識別，要求專門設(shè)備閱讀和分析?？紤]到基因芯片要求有特殊的設(shè)備和專門的技術(shù)培訓(xùn)，在一些條件比較差的地區(qū)開展不易；而cDNAArray實驗技術(shù)與Souhternblot、Northernblot類似，不需要專門添置設(shè)備，實驗結(jié)果的放射自顯影可以直接用肉眼判斷，適用于一般普通的實驗室，為此我們介紹cDNAArray。本實驗以美國CLONTECH的AtlascDNAExpressionArrays為例。中科院上海細胞研究所德國馬普學(xué)會聯(lián)合實驗室曾開發(fā)cDNAA原理CLONTECH將目前許多研究領(lǐng)域熱門的上千個基因分類點于帶正電荷的尼龍膜上。這些基因大多已證明在不同的生物學(xué)進程中起到關(guān)鍵作用，比如癌基因、抑癌基因、細胞循環(huán)調(diào)節(jié)因子、離子通道、DNA結(jié)合蛋白、細胞表面抗體、細胞粘附受體、細胞信號和細胞外聯(lián)系等，從而實驗將提供較大信息量的結(jié)果。同時，將質(zhì)粒和噬菌體DNA作為陰性對照點于矩陣之側(cè)，以驗證雜交的特異性。伴隨有一些看家基因的cDNA作為陽性對照以觀察正常mRNA的豐度。以上各基因名稱及在GenBank中的編號該公司有專門材料提供。實驗首先將1ug的mRNA在含相應(yīng)同位素和試劑盒提供優(yōu)化了的引物的反應(yīng)液中反轉(zhuǎn)錄成cDNA探針。然后用此探針與cDNAArray尼龍膜上的cDNA雜交，在嚴格的洗膜后放射自顯影，然后進行分析，比較不同基因或不同膜上同一基因表達的多寡。該公司還有配套的計算機圖象分析軟件。原理實驗結(jié)果在放射自顯影的X光片上見有不同深淺的雜交斑點，在斑點矩陣的周圍有一些看家基因的定位雜交點?？梢酝ㄟ^試劑盒提供的印有網(wǎng)格的塑料膜確定不同基因表達的變化，或借助于該公司設(shè)計的分析軟件對掃描入計算機的圖象進行處理。實驗結(jié)果cDNA和基因組文庫DNA的構(gòu)建課件注意事項1．通常cDNAArrays是用來比較兩個標本以上的mRNA表達的變化，因此具體操作時可以同時標記兩個或兩個以上的探針，每一個探針的標記方法同上。為了減少上樣誤差，除mRNA外，其余試劑可以先統(tǒng)一配置，混勻，然后分別加入不同來源的mRNA中進行探針的標記。2．我們曾作過比較，采用總RNA不理想，mRNA濃度不夠，背景高。采用mRNA的效果比較理想，因此我們推薦采用mRNA標記探針。mRNA的分離方法請參見本書有關(guān)章節(jié)的論述。注意事項3．常用的同位素有[α-32P]dATP和[α-33P]dATP，我們使用下來，[α-32P]dATP效果比較好，曝光時間短，變化明顯，靈敏度高。對于那些強反應(yīng)的部位，可以方便地調(diào)整曝光時間，取得最佳效果。[α-33P]dATP則要求較長的曝光時間，對比反而不夠靈敏。4．當(dāng)鮭精DNA濃度很高時，一旦冷卻，不易溶解，因此可以變性后，趁熱直接加入已加熱的ExpressHyb，并混勻。5．探針的變性是必須的。常見的問題是標記完探針，分離去未標記的同位素后，忘記將探針變性，引起實驗失敗。3．常用的同位素有[α-32P]dATP和[α-33P]dAThankyou謝謝！Thankyou謝謝！第九章

cDNA文庫和基因組文庫構(gòu)建第九章

cDNA文庫和基因組文庫構(gòu)建基因組文庫是含有某種生物體全部基因的隨機片段的重組DNA克隆群體；cDNA文庫是指含有所有重組cDNA的克隆群體。

基因組文庫：來源于基因組DNA，反映基因組的全部信息，用于基因組物理圖譜的構(gòu)建，基因組序列分析，基因在染色體上的定位，基因組中基因的結(jié)構(gòu)和組織形式等。

cDNA文庫：來源于細胞表達出的RNA，反映基因組表達的基因序列信息，用于研究特定細胞中基因的表達狀態(tài)和表達基因的功能等。

基因文庫＝基因組文庫＋cDNA文庫基因組文庫是含有某種生物體全部基因的隨機片段的重組DN一、載體的種類和特征：受體細胞結(jié)構(gòu)插入片段舉例質(zhì)粒E.coli環(huán)狀很小，<8kbpUC18/19,T-載體,

pGEM3zλ噬菌體E.coli線狀9-24kbEMBL，λgt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀<10kbM13系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35-45kbBACE.coli環(huán)狀約300kbPACE.coli環(huán)狀100-800kbPCYPACYAC酵母細胞線性染色體100-2000kbMAC哺乳動物細胞環(huán)狀>1000kb病毒載體動物細胞環(huán)狀SV40載體，昆蟲桿狀病毒載體穿梭載體動物細胞和細菌環(huán)狀pSVK3質(zhì)粒，PBV,Ti質(zhì)粒，一、載體的種類和特征：受體細胞結(jié)構(gòu)插入片段舉例質(zhì)粒E.col二、cDNA文庫的構(gòu)建分為六個階段：

階段1：反轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA第一鏈

階段2：cDNA第二鏈的合成

階段3：cDNA的甲基化

階段4：接頭或銜接子的連接

階段5：Sepharose

CL-4B凝膠過濾法分離cDNA

階段6：cDNA與λ噬菌體臂的連接

二、cDNA文庫的構(gòu)建分為六個階段：

階段1：反轉(zhuǎn)錄酶催化cDNA文庫的構(gòu)建mRNA

反轉(zhuǎn)錄cDNA(互補DNA）第二條DNA鏈cDNA文庫的構(gòu)建mRNA1：反轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA第一鏈

1.1.在置于冰上的無菌微量離心管內(nèi)混合下列試劑進行cDNA第一鏈的合成：

poly(A)

RNA

(1μg/μl)

10μl

寡核苷酸引物(1μg/μl)

1μl

1mol/L

Tris-HCl

(pH8.0,

37℃)

2.5μl

1mol/L

KCl

3.5μl

250

mmol/L

MgCl2

2μl

dNTP溶液（含4種dNTP，每種5mmol/L）

10μl

0.1

mol/L

DTT

2μl

RNase抑制劑（選用）

25單位

加H2O至

48μl

1.2.當(dāng)所有反應(yīng)組在0℃混合后，取出2.5μl反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到另一個0.5ml微量離心管內(nèi)。在這個小規(guī)模反應(yīng)管中加入0.1μl

[α-32P]

dCTP（400

Ci/mmol,

10mCi/ml）。

1：反轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA第一鏈

1.1.在置于冰上1.3.大規(guī)模和小規(guī)模反應(yīng)管都在37℃溫育1h。

1.4.溫育接近結(jié)束時，在含有同位素的小規(guī)模反應(yīng)管中加入1μl

0.25mol/L

EDTA，然后將反應(yīng)管轉(zhuǎn)移到冰上。大規(guī)模反應(yīng)管則在70℃溫育10

min，然后轉(zhuǎn)移至冰上。

1.5.測定0.5μl小規(guī)模反應(yīng)物中放射性總活度和可被三氯乙酸（TCA）沉淀的放射性活度。此外，用合適的DNA分子質(zhì)量參照物通過堿性瓊脂糖凝膠電泳對小規(guī)模反應(yīng)產(chǎn)物進行分析是值得的。

1.6.按下述方法計算cDNA第一鏈的合成量[摻入的活度值(cpm)/總活度值]×66(μg)=合成的cDNA第一鏈(μg)

1.7.盡可能快地進行cDNA合成的下一步驟。1.3.大規(guī)模和小規(guī)模反應(yīng)管都在37℃溫育1h。

12：cDNA第二鏈的合成

2.1：cDNA第二鏈的合成將下列試劑直接加入大規(guī)模第一鏈反應(yīng)混合物中、10mMol/Lmgcl270ul2mM/LTris-Hcl(PH7.4)5ul

10

mCi/ml[α-32P]

dCTP（400

Ci/mmol）

10μl

1

mol/L

(NH4)2SO4

1.5μl

RNase

H

(1000單位/ml)

1μl

大腸桿菌DNA聚合酶I

(10

000單位/ml)

4.5μl

溫和振蕩將上述試劑混合，在微量離心機稍離心，以除去所有氣泡。在16℃溫育2~4h。

2.2.溫育結(jié)束，將下列試劑加到反應(yīng)混合物中：

β-NAD

(50

mmol/L)

1μl

大腸桿菌DNA連接酶(1000~4000單位/ml)

1μl

室溫溫育15min。

2：cDNA第二鏈的合成

2.1：cDNA第二鏈的合成將2.3.溫育結(jié)束，加入1μl含有4種dNTP的混合物和2μl

T4噬菌體DNA聚合酶。反應(yīng)混合物室溫溫育15分鐘。

2.4.取出3μl反應(yīng)物，按步驟7和8描述的方法測定第二鏈DNA的質(zhì)量。

2.5.將5μl

0.5

mol/L

EDTA

(pH8.0)加入剩余的反應(yīng)物中，用酚：氯仿和氯仿分別抽提混合物一次。在0.3

mol/L(pH5.2)乙酸鈉存在下，通過乙醇沉淀回收DNA，將DNA溶解在90μl

TE(pH7.6)溶液中。

2.6.將下列試劑加到DNA溶液中：

10×T4多核苷酸激酶緩沖液

10μl

T4多核苷酸激酶（3000單位/ml）

1μl

室溫溫育15分鐘。

2.7.測定從上面步驟4取出的3μl反應(yīng)物中放射性活度，測定1μl第二鏈合成產(chǎn)物中能被三氯乙酸沉淀的放射性活度。

2.3.溫育結(jié)束，加入1μl含有4種dNTP的混合物和22.8.用下面公式計算第二鏈反應(yīng)中所合成的cDNA量。要考慮到已摻入到DNA第一鏈種的dNTP的量。

[第二鏈反應(yīng)中所摻入的活度值(cpm)/總活度值(cpm)]*(66μg

-xμg)=cDNA第二鏈合成量/μg

x表示cDNA第一鏈量。CDNA第二鏈合成量通常為第一鏈量的70~80%

2.9.用等量酚：氯仿對含有磷酸化cDNA（來自步驟6）的反應(yīng)物進行抽提。2.10.

Sephadex

G-50用含有10

mmol/L

NaCl的TE(pH7.6)溶液進行平衡，然后通過離子柱層析將未摻入的dNTP和cDNA分開。

2.8.用下面公式計算第二鏈反應(yīng)中所合成的cDNA量。要2.11.

加入0.1倍體積的3mol/L乙酸鈉（pH5.2）和2倍體積的乙醇，沉淀柱層析洗脫下來的cDNA，將樣品置于冰上至少15分鐘，然后在微量離心機上以最大速度4℃離心15分鐘，回收沉淀DNA。用手提微型監(jiān)測儀檢查，是否所有放射性都沉淀下來。

2.12.

用70%乙醇洗滌沉淀物，重復(fù)離心。

2.13.

小心吸出所有液體，空氣干燥沉淀物。

2.14.

如果需要用EcoR

I甲基化酶對cDNA進行甲基化，可將cDNA溶解于80μl

TE(pH7.6)溶液中。另外，如果要將cDNA直接與Not

I或Sal

I接頭或寡核苷酸銜接子相連，可將cDNA懸浮在29μl

TE(pH7.6)溶液。沉淀的DNA重新溶解后，盡快進行cDNA合成的下一步驟。2.11.

加入0.1倍體積的3mol/L乙酸鈉（pH53：cDNA的甲基化3.1.在cDNA樣品中加入以下試劑：

2

mol/L

Tris-HCl

(pH8.0)

5μl

5

mol/L

NaCl

2μl

0.5

mol/L

EDTA(pH8.0)

2μl

20

mmol/L

S-腺苷甲硫氨酸

1μl

加H2O至

96μl

3.2.取出兩小份樣品（各2μl）至0.5ml微量離心管中，分別編為1號和2號，置于冰上。

3.3.在余下的反應(yīng)混合液中加入2μl

EcoR

I

甲基化酶（80

000單位/ml），保存在0℃直至步驟4完成。

3.4.再從大體積的反應(yīng)液中吸出另外兩小分樣品（各2μl）至0.5ml微量離心管中，分別編為3號和4號。

3：cDNA的甲基化3.1.在cDNA樣品中加入以下試劑3.5.在所有四小份樣品（來自步驟2和步驟4）加入100

ng質(zhì)粒DNA或500

ng的λ噬菌體DNA。這些未甲基化的DNA在預(yù)實驗中用作底物以測定甲基化效率。

3.6.所有四份小樣實驗反應(yīng)和大體積的反應(yīng)均在37℃溫育1h。

3.7.于68℃加熱15min，用酚：氯仿抽提大體積反應(yīng)液一次，再用氯仿抽提一次。

3.8.在大體積反應(yīng)液中加入0.1倍體積的3

mol/L乙酸鈉（pH5.2）和2倍體積的乙醇，混勻后貯存于-20℃直至獲得小樣反應(yīng)結(jié)果。3.5.在所有四小份樣品（來自步驟2和步驟4）加入100

3.

9.按下述方法分析4個小樣對照反應(yīng)：

a.

在每一對照反應(yīng)中分別加入：

0.1

mol/L

MgCl2

2μl

10×EcoR

I

緩沖液

2μl

加H2O至

20μl

b.

在2號和4號反應(yīng)管中分別加入20單位EcoR

I。

c.

四個對照樣品于37℃溫育1h，通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。

3.10.

微量離心機以最大速度離心15min(4℃)以回收沉淀cDNA。棄上清，加入200μl

70%乙醇洗滌沉淀，重復(fù)離心。

3.11.

用手提式微型探測器檢查是否所有放射性物質(zhì)均被沉淀。小心吸出乙醇，在空氣中晾干沉淀，然后將DNA溶于29μl

TE（pH8.0）。

3.12.

盡可能快地進行cDNA合成的下一階段。

3.9.按下述方法分析4個小樣對照反應(yīng)：

a.

在每4：接頭或銜接子的連接

cDNA末端的削平

4.1.cDNA樣品于68℃加熱5

min。

4.2.將cDNA溶液冷卻至37℃并加入下列試劑：

5×T4噬菌體DNA聚合酶修復(fù)緩沖液

10μl

dNTP溶液，每種5

mmol/L

5μl

加H2O至

50μl

4.3.加入1~2單位T4噬菌體DNA聚合酶（500單位/ml），37℃溫育15min。

4.4.加入1μl

0.5mol/L

EDTA(pH8.0)，以終止反應(yīng)。

4：接頭或銜接子的連接cDNA末端的削平

4.1.cDN4.5.用酚：氯仿抽提，再通過Sephadex

G-50離心柱層析，除去未摻入的dNTP。

4.6.在柱流出液中加入0.1倍體積的3

mol/L

乙酸鈉（pH5.2）和二倍體積的乙醇，樣品于4℃至少放置15

min。

4.7.在微量離心機上以最大速度離心15

min(4℃)，回收沉淀的cDNA。沉淀經(jīng)空氣干燥后溶于13μl的10

mmol/L

Tris-HCl

(pH8.0).接頭-銜接子與cDNA的連接

4.5.用酚：氯仿抽提，再通過Sephadex

G-50離心4.8.將下列試劑加入到已削成平末端的DNA中：

10×T4噬菌體DNA聚合酶修復(fù)緩沖液

2μl

800~1000

ng的磷酸化接頭或銜接子

2μl

T4噬菌體DNA連接酶（105

Weiss單位/ml）

1μl

10

mmol/L

ATP

2μl

混勻后，在16℃溫育8~12h。

4.9.從反應(yīng)液中吸出0.5μl貯存于4℃，其余反應(yīng)液于68℃加熱15min以滅活連接酶。4.8.將下列試劑加入到已削成平末端的DNA中：

10×T5：Sepharose

CL-4B凝膠過濾法分離cDNA

Sepharose

CL-4B柱的制備

5.1.用帶有彎頭的皮下注射針頭將棉拭的一半推進1ml滅菌吸管端部，用無菌剪刀剪去露在吸管外的棉花并棄去，再用濾過的壓縮空氣將余下的棉拭子吹至吸管狹窄端。

5.2.將一段無菌的聚氯乙烯軟管與吸管窄端相連，將吸管寬端浸于含有0.1

mol/L

NaCl的TE（pH7.6）溶液中。將聚氯乙烯管與相連于真空裝置的錐瓶相接。輕緩抽吸，直至吸管內(nèi)充滿緩沖液，用止血鉗關(guān)閉軟管。

5：Sepharose

CL-4B凝膠過濾法分離cDNA

S5.3.在吸管寬端接一段乙烯泡沫管，讓糊狀物靜置數(shù)分鐘，放開止血鉗，當(dāng)緩沖液從吸管滴落時，層析柱亦隨之形成。如有必要，可加入更多的Sepharose

CL-4B，直至填充基質(zhì)幾乎充滿吸管為止。

5.4.將幾倍柱床體積的含0.1

mol/L氯化鈉的TE(pH7.6)洗滌柱子。洗柱完成后，關(guān)閉柱子底部的軟管。

依據(jù)大小分離回收DNA

5.3.在吸管寬端接一段乙烯泡沫管，讓糊狀物靜置數(shù)分鐘，5.5.用巴斯德吸管吸去柱中Sepharose

CL-4B上層的液體，將cDNA加到柱上（體積50μl或更?。?，放開止血鉗，使cDNA進入凝膠。用50μl

TE(pH7.6)洗滌盛裝cDNA的微量離心管，將洗液亦加于柱上。用含0.1

mol/L

NaCl的TE(pH7.6)充滿泡沫管。

5.6.用手提式小型探測器監(jiān)測cDNA流經(jīng)柱子的進程。放射性cDNA流到柱長2/3時，開始用微量離心管收集，每管2滴，直至將所有放射性洗脫出柱為止。

5.7.用切侖科夫計數(shù)器測量每管的放射性活性。

5.8.從每一管中取出一小份，以末端標記的已知大小（0.2kb~5kb）的DNA片斷作標準參照物，通過1%瓊脂凝膠電泳進行分析，將各管余下部分貯存于-20℃，直至獲得瓊脂糖凝膠電泳的放射自顯影片。5.5.用巴斯德吸管吸去柱中Sepharose

CL-45.9.電泳后將凝膠移至一張Whatman

3MM濾紙上，蓋上一張Saran包裝膜，并在凝膠干燥器上干燥。干燥過程前20min至30min于50℃加熱凝膠，然后停止加熱，在真空狀態(tài)繼續(xù)干燥1~2h.

5.10.

置-70℃加增感屏對干燥的凝膠繼續(xù)X射線曝光。

5.11.

在cDNA長度≥500bp的收集管中，加入0.1倍體積的3mol/L乙酸鈉（pH5.2）和二倍體積的乙醇。于4℃放置至少15min使cDNA沉淀，用微量離心機于4℃以12

000g離心15min，以回收沉淀的cDNA。

5.9.電泳后將凝膠移至一張Whatman

3MM濾紙上5.12.

將DNA溶于總體積為20μl的10

mmol/L

Tris-HCl(pH7.6)中。

5.13.

測定每一小份放射性活度。算出選定的組分中所得到的總放射性活度值。計算可用于λ噬菌體臂相連接的DNA總量。

[選定組分的總活度值(cpm)/摻入到第二鏈的活度值(cpm)]*2xμg

cDNA第二鏈合成量=可用于連接的cDNA

5.12.

將DNA溶于總體積為20μl的10

mmol6：cDNA與λ噬菌體臂的連接6.1.按下述方法建立4組連接-包裝反應(yīng)：連接A(μl)B(μl)C(μl)D(μl)λ噬菌體DNA(0.5μg/μl)1.01.01.01.010×T4DNA連接酶緩沖液1.01.01.01.0cDNA0ng5ng10ng50ngT4噬菌體DNA連接酶（105Weiss單位/ml）0.10.10.10.110mmol/LATP1.01.01.01.0加H2O至10101010連接混合物于16℃培育4~16h。剩余的cDNA儲存于-20℃。

6.2.按包裝提取物廠商提供的方法，從每組連接反應(yīng)物中取5μl包裝到噬菌體顆粒中。

6.3.包裝反應(yīng)完成后，在各反應(yīng)混合物中加入0.5mlSM培養(yǎng)基。

6：cDNA與λ噬菌體臂的連接6.1.按下述方法建立4組6.4.預(yù)備適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌株新鮮過夜培養(yǎng)物，包裝混合物做100倍稀釋，各取10μl和100μl涂板，于37℃或42℃培養(yǎng)8~12小時。

6.5.計算重組噬菌斑和非重組噬菌斑，連接反應(yīng)A不應(yīng)產(chǎn)生重組噬菌斑，而連接反應(yīng)B、C和D應(yīng)產(chǎn)生數(shù)目遞增的重組噬菌斑。

6.6.根據(jù)重組噬菌斑的數(shù)目，計算cDNA的克隆效率。

6.7.挑取12個重組λ噬菌體空斑，小規(guī)模培養(yǎng)裂解物并制備DNA，以供適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶消化。

6.8.通過1%瓊脂凝膠電泳分析cDNA插入物的大小，用長度范圍500bp~5kb的DNA片段作為分子質(zhì)量參照。6.4.預(yù)備適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌株新鮮過夜培養(yǎng)物，包裝混合物做注意要點cDNA雙鏈合成的注意要點:所有合成cDNA第一條鏈的方法都要依賴于ＲＮＡ的ＤＮＡ聚合酶（反轉(zhuǎn)錄酶）來催化反應(yīng)，合成中有兩個關(guān)鍵因素，一個是mＲＮＡ模板，一個是反轉(zhuǎn)錄酶．注意要點cDNA雙鏈合成的注意要點:

保證獲得足夠數(shù)量和高質(zhì)量的起始ＲＮＡ

模板mＲＮＡ的質(zhì)量直接影響到cDNA合成的效率，完成和均一是衡量mＲＮＡ質(zhì)量的兩個標準．

反轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄效率是關(guān)鍵中的關(guān)鍵．

保證獲得足夠數(shù)量和高質(zhì)量的起始ＲＮＡ

模板mＲＮＡ的質(zhì)量cDNA文庫構(gòu)建后期的注意要點反轉(zhuǎn)錄后至包裝噬菌體外殼蛋白之前的諸多步驟操作按部就班，但其中的cDNA層析柱分級很重要．注重載體與cDNA的連接效率、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化大腸桿菌的效率cDNA文庫構(gòu)建后期的注意要點反轉(zhuǎn)錄后至包裝噬菌體外殼蛋白之

三、基因組DNA文庫的構(gòu)建將總DNA經(jīng)過酶解，經(jīng)蔗糖梯度離心或瓊脂糖凝膠電泳分離不同長短的DNA片段。包含的基因組片段分別克隆在質(zhì)?；蚴删w載體上，轉(zhuǎn)染細菌或體外包裝到噬菌體顆粒上便構(gòu)成了該生物的基因組文庫。三、基因組DNA文庫的構(gòu)建

1.基因組文庫構(gòu)建步驟

1.1載體DNA的制備：

高分子量的外源DNA

100-150kb1.2載體DNA酶切反應(yīng)（常用BamHI）1.3載體臂的純化（蔗糖密度梯度離心）

1.4載體脫磷處理

（堿性磷酸酶）

載體：

l噬菌體：48.5kb,插入型(最多可容納9kb)、取代型(可容納38-51kb，最適19-20kb)，

EMBL,

Charon粘性質(zhì)粒(Cosmid)：4-6kb,

質(zhì)粒+噬菌體的性質(zhì)，可容納大片段的外源基因，最多可容納46kb。

酵母人工染色體克隆體系（YAC，Yeast

Artificial

Chromosome

Cloning

System）

插入大小200—1000kb

·

1.1載體DNA的制備：

高分子量的外源DNA

100-11.5連接和包裝：外源片段與兩臂之間的比例，包裝蛋白

感染宿主菌：選擇合適的宿主菌，LE392,

NM538,

NM539,KW251等

1.6克隆文庫的保存和擴增：完整性和代表性

測滴度，要在106fu以上;

保存，氯仿4℃，7%

DMSO

-70℃

1.5連接和包裝：外源片段與兩臂之間的比例，包裝蛋白

人類染色體3X109，平均插入片段大小17

kb

人類染色體3X109，平均插入片段大小17

kb生物芯片生物芯片簡單地說，生物芯片就是在一塊指甲大小的玻片、硅片、尼龍膜等材料上放上生物樣品，然后由一種儀器收集信號，用計算機分析數(shù)據(jù)結(jié)果。目前制備芯片的固相材料有玻片、硅片、金屬片、尼龍膜等。目前較為常用的支持材料是玻片，因為玻片適合多種合成方法，而且在制備芯片前對玻片的預(yù)處理也相對簡單易行。生物芯片生物芯片簡單地說，生物芯片就是在一塊指甲大小的玻片、生物芯片是八十年代末在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來的一項高新技術(shù)，它主要是指通過微加工技術(shù)和微電子技術(shù)在固格體芯片表面構(gòu)建的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實現(xiàn)對細胞、蛋白質(zhì)、DNA以及其他生物組分的準確、快速、大信息量的檢測。常用的生物芯片分為三大類：即基因芯片、蛋白質(zhì)芯片和芯片實驗室。生物芯片的主要特點是高通量、微型化和自動化。芯片上集成的成千上萬的密集排列的分子微陣列，能夠在短時間內(nèi)分析大量的生物分子，使人們快速準確地獲取樣品中的生物信息，效率是傳統(tǒng)檢測手段的成百上千倍。它將是繼大規(guī)模集成電路之后的又一次具有深遠意義的科學(xué)技術(shù)革命。生物芯片是八十年代末在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來的一項高新技進入二十一世紀，隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，電子技術(shù)和生物技術(shù)相結(jié)合誕生了半導(dǎo)體芯片的兄弟——生物芯片，這將給我們的生活帶來一場深刻的革命。這種革命對于我國，乃至全世界的可持續(xù)發(fā)展都會起到不可估量的貢獻。進入二十一世紀，隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，電子技術(shù)和生物技術(shù)相1.生物芯片的種類

通常的生物化學(xué)反應(yīng)過程包括三步，即樣品的制備，生化反應(yīng)、結(jié)果的檢測和分析?？蓪⑦@三步不同步驟集成為不同用途的生物芯片，所以據(jù)此可將生物芯片分為不同的類型。例如用于樣品制備的生物芯片，生化反應(yīng)生物芯片及各種檢測用生物芯片等?，F(xiàn)在，已經(jīng)有不少的研究人員試圖將整個生化檢測分析過程縮微到芯片上，形成所謂的“芯片實驗室”(Lab-on-chip)?！靶酒瑢嶒炇摇蓖ㄟ^微細加工工藝制作的微濾器、微反應(yīng)器、微泵、微閥門、微電極等以實現(xiàn)對生物樣品從制備、生化反應(yīng)到檢測和分析的全過程，從而極大地縮短的檢測和分析時間，節(jié)省了實驗材料。

1.生物芯片的種類

通常的生物化學(xué)反應(yīng)過程包括三步，即樣品樣品制備芯片的目的是將通常需要在實驗室進行的多個操作步驟集成于微芯片上。目前，樣品制備芯片主要通過升溫、變壓脈沖以及化學(xué)裂解等方式對細胞進行破碎，通過微濾器、介電電泳等手段實現(xiàn)生物大分子的分離。

生化反應(yīng)芯片即在芯片上完成生物化學(xué)反應(yīng)。與傳統(tǒng)生化反應(yīng)過程的區(qū)別主要在于它可以高效、快速地完成生物化學(xué)反應(yīng)。例如，在芯片上進行PCR反應(yīng)，可以節(jié)約實驗試劑，提高反應(yīng)速度，并可完成多個片段的擴增反應(yīng)。當(dāng)前，由于檢測和分析的靈敏度所限，通常在對微量核酸樣品進行檢測時必需事先對其進行一定程度的擴增。所以用于PCR的芯片無疑為快速大量擴增樣品多個DNA片段提供了有力的工具。

樣品制備芯片的目的是將通常需要在實驗室進行的多個操作步驟集成檢測芯片顧名思義是用來檢測生物樣品的。例如用毛細管電泳芯片進行DNA突變的檢測，用于表達譜檢測、突變分析、多態(tài)性測定的DNA微點陣芯片（也稱DNA芯片、基因芯片），用于大量不同蛋白檢測和表位分析的蛋白或多肽微點陣芯片（也稱蛋白或多肽芯片）。

檢測芯片顧名思義是用來檢測生物樣品的。例如用毛細管電泳芯片進

芯片實驗室是生物芯片技術(shù)發(fā)展的最終目標。它將樣品的制備、生化反應(yīng)到檢測分析的整個過程集約化形成微型分析系統(tǒng)?，F(xiàn)在，已經(jīng)有由加熱器、微泵、微閥、微流量控制器、微電極、電子化學(xué)和電子發(fā)光探測器等組成的芯片實驗室問世，并出現(xiàn)了將生化反應(yīng)、樣品制備、檢測和分析等部分集成的芯片。例如可以將樣品的制備和PCR擴增反應(yīng)同時完成于一塊小小的芯片之上。再如GeneLogic公司設(shè)計制造的生物芯片可以從待檢樣品中分離出DNA或RNA，并對其進行熒光標記，然后當(dāng)樣品流過固定于柵欄狀微通道內(nèi)的寡核苷酸探針時便可捕獲與之互補的靶核酸序列。應(yīng)用其自己開發(fā)的檢測設(shè)備即可實現(xiàn)對雜交結(jié)果的檢測與分析。這種芯片由于寡核苷酸探針具有較大的吸附表面積，所以可以靈敏地檢測到稀有基因的變化。同時，由于該芯片設(shè)計的微通道具有濃縮和富集作用，所以可以加速雜交反應(yīng)，縮短測試時間，從而降低了測試成本。

綜觀生物芯片的發(fā)展，檢測用生物芯片的發(fā)展最為迅猛。目前，檢測用生物芯片主要為微點陣技術(shù)。

芯片實驗室是生物芯片技術(shù)發(fā)展的最終目標。cDNAArray和MicroArraycDNAArray即cDNA列陣，或譯作矩陣，由排列在96孔板大小的少到幾十個，多至上萬個不同基因的cDNA點組成。MicroArray被譯作“基因芯片”，或譯作“微矩陣”，這個矩陣由點在大如載玻片，小如指甲大小面積的固定介質(zhì)表面的上百至數(shù)千個特定的基因組成。是cDNAArray的微型化。cDNAArray和MicroArraycDNA和基因組文庫DNA的構(gòu)建課件cDNA和基因組文庫DNA的構(gòu)建課件cDNA和基因組文庫DNA的構(gòu)建課件MicroArray的工作原理是將欲研究細胞組織的RNA通過不同的方式轉(zhuǎn)錄成cDNA，轉(zhuǎn)錄過程中或之后給予熒光等標記，制成探針，然后在嚴格的條件下使該探針與微矩陣上的基因雜交，雜交后，把未雜交的基因洗脫，在一定的條件下，觀察雜交結(jié)果，以了解某特定組織中基因轉(zhuǎn)錄的多寡和特征。如果兩個組織的RNA用不同發(fā)光色彩的熒光標記，同時進行雜交，由于兩個組織雜交后所激發(fā)的熒光色彩不同，微矩陣上與甲組織特有探針結(jié)合則產(chǎn)生甲探針的光色，與乙組織特有探針結(jié)合則產(chǎn)生乙探針的光色，兩種探針同時結(jié)合則產(chǎn)生相兼色。這樣在一塊基因芯片上就可以方便、迅速、大規(guī)模地觀察兩個不同組織基因轉(zhuǎn)錄的異同。MicroArray的工作原理是將欲研究細胞組織的RNA通過在基因芯片問世的短短幾年來，一些改進型的基因芯片技術(shù)陸續(xù)問世，并迅速形成產(chǎn)品。比如GeneChip。其特點為：1）容量大，每個芯片上可以達39000個基因，因此，單位時間內(nèi)識別的基因多且快；2）在基因矩陣上每個點由上下兩排更小的矩陣組成，每排由16-20個與某一mRNA不同區(qū)域?qū)?yīng)的25個寡核苷酸組成。上下兩行中，上行為正常基因序列，下行為中間有點突變的序列。這樣在相同嚴格的雜交和洗脫條件下，上行基因16-20個點應(yīng)該全部陽性反應(yīng)，而下行基因因含有點突變，退火結(jié)合后不夠穩(wěn)定，會被洗脫。因而這樣僅上行呈陽性的雜交才算有效。所以在避免假陽性方面具有別的芯片所無法比擬的優(yōu)勢。還如discoveryARRAY。該芯片把RFDD-PCR（限制性片段差異展示PCR）技術(shù)與MicroArray技術(shù)結(jié)合在一道。由于mRNA拷貝為PCR所放大，極大豐富地擴增了一些微量轉(zhuǎn)錄的mRNA，使之得以清晰地反映在Array上。