參芪復(fù)方對GK大鼠大血管病變內(nèi)皮細(xì)胞凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究

文檔可自由編輯打印10/10文檔可自由編輯打印文檔可自由編輯打印參芪復(fù)方對GK大鼠大血管病變內(nèi)皮細(xì)胞凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究作者：陳敏，莊燦，謝春光，劉椏，高泓【摘要】目的觀察參芪復(fù)方對GK大鼠大血管病變血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。方法設(shè)GK組、模型組、阿托伐他汀組、參芪復(fù)方組及Wistar正常對照組，各組大鼠灌胃及喂飼相應(yīng)藥物或飼料35d。原位末端標(biāo)記Tunel法觀察內(nèi)皮細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度，進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞凋亡程度評價(jià)，免疫組組織化學(xué)染色（SP法）測定caspase-3陽性物質(zhì)積分光密度情況。結(jié)果阿托伐他汀組、參芪復(fù)方組內(nèi)皮細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡程度、caspase-3積分光密度均低于模型組（P＜0.05或P＜0.01），阿托伐他汀組、參芪復(fù)方組間比較無差異。結(jié)論抑制主動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及caspase-3表達(dá)可能是參芪復(fù)方防治糖尿病大血管早期病變的機(jī)制之一。【關(guān)鍵詞】參芪復(fù)方；糖尿病大血管病變；內(nèi)皮細(xì)胞凋亡；caspase-32004年《中國糖尿病防治指南》明確提出：糖尿病大血管病變已經(jīng)成為我國糖尿病發(fā)病率和致死率最高、危害最大的慢性并發(fā)癥，并且指出糖尿病動脈內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、動脈內(nèi)皮損傷，繼之對血管損傷的反應(yīng)提早發(fā)生和加速動脈粥樣硬化是增加冠心病事件及死亡的重要原因［1］?，F(xiàn)在認(rèn)為糖尿病大血管并發(fā)癥的主要病理過程是動脈粥樣硬化，糖尿病人群大血管病變的發(fā)生與非糖尿病人群比具有發(fā)病更早，范圍更廣、病情更重的特點(diǎn)［2］。參芪復(fù)方是謝春光教授根據(jù)中醫(yī)理論，針對消渴病氣陰兩虛、燥熱津傷、瘀血阻滯之基本病機(jī)，具有益氣養(yǎng)陰活血功效的自擬方。該方主要由人參、黃芪、生地黃、天花粉、山茱萸、山藥、丹參、制大黃等8味中藥組成。既往研究發(fā)現(xiàn)本方有抗2型糖尿病早期動脈粥樣硬化的作用［3］。本研究在既往研究的基礎(chǔ)上觀察參芪復(fù)方對GK大鼠大血管病變內(nèi)皮細(xì)胞凋亡影響。1材料與儀器1.1動物5月齡SPF級自發(fā)性2型糖尿病GK雄性大鼠85只和雄性Wistar大鼠20只［購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，質(zhì)量合格證號：SCXK（滬）2007～0005］，按2～3只籠飼養(yǎng)于四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院﹠四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心，獨(dú)立通氣籠具（IVC）系統(tǒng)內(nèi)。1.2藥品與試劑參芪復(fù)方浸膏（1g浸膏相當(dāng)于原生藥10g，由四川省中醫(yī)藥研究院中醫(yī)研究所藥劑科生產(chǎn)，批號：080928），阿托伐他汀鈣片（10mg/片，北京嘉林藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，批號：080502），Nω-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME，sigma公司產(chǎn)品，批號：107K1055），原位細(xì)胞凋亡檢測（POD試劑盒，美國Roche生產(chǎn)，貨號：11684817910），濃縮型DAB試劑盒（中杉金橋產(chǎn)品，貨號：ZLI-9031），半胱胺酸蛋白酶蛋白-3（Caspase-3，北京博奧森產(chǎn)品，批號：03-297）。1.3儀器光學(xué)顯微鏡（MoticBA200雙目生物顯微鏡，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)中國有限公司產(chǎn)品），明視場顯微鏡（Bx-40型，日本Olympus公司產(chǎn)品），熒光活體微循環(huán)顯微鏡（Ax70型，日本Olympus公司產(chǎn)品），Mias-2000圖象分析系統(tǒng)(四川大學(xué)智勝軟件股份有限公司)等。2方法2.1分組及造模85只GK大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)血糖值11.1mmol·L-1以上者73只入選本實(shí)驗(yàn)，查隨機(jī)排列表將其隨機(jī)分為GK組18只、模型組（簡寫為model）19只、西藥阿托伐他汀組（簡寫為atorvastatin）18只、中藥參芪復(fù)方組（簡寫為SQCR）18只，Wistar大鼠20只中剔除血糖值在6.7mmol·L-1者2只，其余18只作為正常Wistar對照組（簡寫為Wistar），共5組。模型、西藥、中藥組均給予一氧化氮合成酶(NOS)抑制劑-L-NAME0.1mg·ml-1·d-1，加入飲用水中進(jìn)行造模，GK、模型、西藥、中藥組喂飼高脂飼料，高脂飼料配方為：普通飼料88.2%、精練豬油10%、膽固醇1.5%、豬膽鹽0.3%，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心制成塊料，Wistar組喂飼普通飼料。2.2給藥方法造模同時(shí)開始給藥，周期35d。具體如下：①正常Wistar對照組：按5ml·kg-1·d-1灌服生理鹽水；②GK組：按5ml·kg-1·d-1灌服生理鹽水；③模型組：按5ml·kg-1·d-1灌服生理鹽水；④atorvastatin組：按1.6mg·kg-1·d-1(相當(dāng)于成人劑量10倍，成人體質(zhì)量按60kg計(jì))體質(zhì)量灌服阿托伐他汀鈣懸液；⑤SQCR組：按1.44g·kg-1·d-1(相當(dāng)于成人劑量的10倍，成人按60kg計(jì))體重灌服中藥混懸液。2.3觀察指標(biāo)及檢測方法動物給藥35d后處死，腹腔注射8%戊巴比妥鈉麻醉動物，取主動脈，冰上除去主動脈周圍組織和腔內(nèi)血液，固定組織，備免疫組織化學(xué)染色及原位末端標(biāo)記Tunel法檢測。2.3.1內(nèi)皮細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度檢測采用原位末端標(biāo)記Tunel法檢測，大鼠處死后，用10％中性甲醛固定24h，梯度乙醇脫水，透明浸蠟，石蠟包埋過夜，縱向切片等處理，而后參照Roche原位細(xì)胞凋亡檢測POD試劑盒及濃縮型DAB試劑盒操作，激發(fā)光波長450～500nm，檢測波長515～565nm，在熒光活體微循環(huán)顯微鏡系統(tǒng)下觀察熒光染色結(jié)果，每個(gè)組織＞400×視野下隨機(jī)選5個(gè)視野，平均熒光強(qiáng)度＝累積熒光強(qiáng)度/發(fā)光物體的表面積。2.3.2內(nèi)皮細(xì)胞凋亡程度評價(jià)操作方法同上，觀察了熒光染色情況后，用DAB復(fù)染，封片，在明視場顯微鏡下觀察，每個(gè)組織400倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，對主動脈內(nèi)膜凋亡情況進(jìn)行評價(jià)。計(jì)數(shù)凋亡內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目：數(shù)目在1個(gè)以下，記作“－”；病變數(shù)目在1～5個(gè)之間，記作“+”；病變數(shù)目在6～10個(gè)之間，記作“++”；病變數(shù)目在10個(gè)以上，記作“+++”。同一只動物不同視野的不同情況，按最嚴(yán)重的級別計(jì)。最后，對主動脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2.3.3Caspase-3表達(dá)采用免疫組組織化學(xué)染色（SP法）測定Caspase-3陽性物質(zhì)情況。用OLYMPUSBX50光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司）觀察染色結(jié)果，參考文獻(xiàn)［4］，胞漿棕染為陽性，每張切片隨機(jī)選5個(gè)視野，輸入Mias-2000圖像分析系統(tǒng)（四川大學(xué)智勝軟件股份有限公司），在200倍鏡下分別測量內(nèi)皮細(xì)胞Caspase-3陽性物質(zhì)積分光密度及平均光密度并計(jì)算其均值。2.4統(tǒng)計(jì)方法計(jì)量資料以±s表示，多樣本均數(shù)的兩兩比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA)，用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。等級資料的比較采用Ridit分析。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3結(jié)果3.1一般狀況造模前，各組動物狀態(tài)好，反應(yīng)靈敏，被毛光澤。與正常Wistar對照組相比，GK大鼠攝食量偏少，飲水量偏多，尿量多，體重偏輕。實(shí)驗(yàn)過程中model組大鼠死亡3只，西藥組大鼠死亡1只，中藥組大鼠死亡2只。Wistar組與GK組大鼠均無死亡情況。3.2參芪復(fù)方對各組大鼠凋亡內(nèi)皮細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度的影響如表1所示。從表1可以看出，模型組主動脈內(nèi)膜凋亡內(nèi)皮細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度顯著高于正常Wistar對照組（P＜0.01）；GK組主動脈內(nèi)膜凋亡內(nèi)皮細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度顯著低于模型組（P＜0.05）；兩治療組主動脈內(nèi)膜凋亡內(nèi)皮細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度均顯著低于模型組，其中參芪復(fù)方治療組P＜0.01，阿托伐他汀治療組P＜0.05；兩治療組之間主動脈內(nèi)膜凋亡內(nèi)皮細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度比較均無差異。表1胸主動脈內(nèi)膜凋亡內(nèi)皮細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度的影響（略）3.3參芪復(fù)方對內(nèi)皮細(xì)胞凋亡程度的影響如表2及圖1所示所示，從表2及圖1看出，GK組、模型組主動脈內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞凋亡程度均顯著高于正常Wistar對照組（P＜0.01）。阿托法伐汀組主動脈內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞凋亡程度比GK組有顯著降低（P＜0.05）。兩治療組主動脈內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞凋亡程度與模型組比較均顯著降低（P＜0.01）。兩治療組之間比較無差異。表2對胸主動脈內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞凋亡程度的影響（略）3.4參芪復(fù)方對Caspase-3表達(dá)的影響如表3所示，從表3可以看出，GK組與模型組Caspase-3積分光密度值顯著高于正常Wistar對照組（P＜0.05或P＜0.01）；GK組及兩治療組Caspase-3積分光密度值均顯著低于模型組（P＜0.01）。兩治療組之間積分光密度值比較無差異。表3主動脈Caspase-3表達(dá)水平比較（略）4討論GK大鼠是國際上公認(rèn)的自發(fā)性T2DM模型，較符合T2DM的病理生理特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)灌胃給予GK大鼠NOS抑制劑加飼高脂飲食，成功復(fù)制出了DM早期大血管病變的動物模型。血管內(nèi)皮由血管內(nèi)皮細(xì)胞呈單層縱向排列襯于血管內(nèi)壁，對血管起保護(hù)作用。糖尿病患者中，內(nèi)皮功能異常是導(dǎo)致動脈粥樣硬化的機(jī)制之一。細(xì)胞凋亡(apoptosis)是普遍存在于人體組織細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞死亡的形式之一。研究表明，在炎癥、高糖等多種因素刺激下，血管內(nèi)皮可出現(xiàn)凋亡［5］。內(nèi)皮細(xì)胞凋亡異?？赡軐?dǎo)致內(nèi)皮功能異常，從而導(dǎo)致一系列病變的發(fā)生發(fā)展。凋亡在高血糖引起的損傷模型中尤為重要，在血管內(nèi)皮組織損傷中也占有很大比重［6，7］。Caspase-3，亦稱CPP32，在細(xì)胞凋亡發(fā)生過程中有重要作用。Caspase-3的活化是途經(jīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?；罨腃aspase-3可致蛋白酶級聯(lián)切割放大，最終使細(xì)胞發(fā)生凋亡。檢測Caspase-3可較其它方法更能檢測凋亡的早期事件［8］。近十年來的大量有關(guān)他汀防治冠心病的臨床試驗(yàn)都一致證明，在預(yù)防動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展方面，他汀是目前最有效的藥物，有明確的保護(hù)血管內(nèi)皮作用，且不影響血糖，不僅能減緩AS斑塊的形成，減少斑塊大小，還能穩(wěn)定斑塊，從而阻止AS斑塊的進(jìn)一步發(fā)展［9］，因此本研究選擇他汀類藥物作為陽性對照藥物。本研究證實(shí)，參芪復(fù)方可顯著減少模型組大鼠主動脈caspase-3的表達(dá)，減少凋亡內(nèi)皮細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度以及減低內(nèi)皮細(xì)胞凋亡程度，且與西藥治療組比較沒有差異。因此，抗凋亡作用可能成為參芪復(fù)方防治糖尿病大血管早期病變的機(jī)制之一?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】［1］衛(wèi)生部疾病控制司，中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)分會.《中國糖尿病防治指南》試行本節(jié)選［S］.中國慢性病預(yù)防與控制，2004，12（6）：283.［2］王姮，楊永年.糖尿病現(xiàn)代治療學(xué)［M］.北京科學(xué)出版社，2006：345.［3］張紅敏，陳世偉，謝春光，等.參芪復(fù)方抗自發(fā)性糖尿病GK大鼠早期動脈粥樣硬化的作用機(jī)制［J］.中國中藥雜志2006，31(15)：1272.［4］李輝，朱天明，張衛(wèi)華，等.參芪復(fù)方對GK大鼠胰島β細(xì)胞凋亡及Caspase-3表達(dá)的影響［J］.浙江中醫(yī)雜志，2007，42（9）：536.［5］deBonoDP,YangWD.ExposuretoLowConcentrationsofHydrogenPeroxideCausesDelayedCellDeathandInhibitsProliferationofSurvivingCell［J］.Atherosclerosis,1995,114（2）:235.［6］CerielloA,QuagliaroL,DAmicoM.Acutehyperglycemiainducesnitrotyrosineformationandapoptosisinperfusedheartfromrat［J］.Diabetes，2002，51：1076.［7］ZouMH,ShiC,CohenRA.Highglucoseviaperoxynitritecausestyrosinenitrationandinactivationofprostacyclinsynthasethatisassociated