獸醫(yī)生物制品學第四章-生物制品生產基本技術-下載課件

第四章生物制品生產基本技術第一節(jié)菌種與毒種選育技術1第四章生物制品生產基本技術第一節(jié)菌種與毒種選育技術一、生物制品毒種的標準生物學性狀明顯，歷史清楚：形態(tài)、生理、生化典型、血清學、來源、代數(shù)等清楚。遺傳學純一穩(wěn)定：穩(wěn)定純一的菌種，才能制造出高質量穩(wěn)定的疫苗。免疫抗原、反應抗原好：高質量疫苗的基礎。毒力在適當范圍內：滅活疫苗應該是強毒，弱毒疫苗安全，中等毒力的如ND-I系，IBD中等毒力苗。測定毒力要用敏感動物進行。2一、生物制品毒種的標準23344二、強毒種的選育1、強毒種的用途：滅活疫苗、診斷試劑、抗血清、攻毒試驗。2、強毒種來源：典型傳染病分離培養(yǎng);保藏中心提供。3、強毒種分離：5二、強毒種的選育566B、致病力（動物、雞胚、細胞試驗）。C、抗原性（免疫及反應抗原試驗）D、穩(wěn)定性（傳代不變異）7B、致病力（動物、雞胚、細胞試驗）。7(一)純粹試驗（分離培養(yǎng)、鑒定）。(二)致病力測定菌(毒)種的致病力(或稱毒力)常用易感實驗動物、本動物(原宿主動物)、禽胚或細胞進行測定，用半數(shù)致死量(LD50)、半數(shù)感染量(ID50)、禽胚半數(shù)致死量(ELD50)、胚半數(shù)感染量(HD50)、組織細胞半數(shù)感染量(TCID50)等來表示。(三)抗原性測定反應原性測定，一般采用血清學方法，以抗體滴度或效價表示。免疫原性測定，通常采用的方法是將菌(毒)株制成疫苗，免疫動物，經1～3周后用致死劑量的強毒攻擊，以保護率表示?？怪滤懒繌姸驹蕉?，保護率越高者，免疫原性越好?？乖缘臏y定，也需設陽性和陰性對照，否則無效。(四)穩(wěn)定性測定一般采用培養(yǎng)基或動物、禽胚、細胞對菌(毒)株進行傳代培養(yǎng)，觀察其生物學特性，測定其致病力和抗原性，以證明其遺傳性狀的穩(wěn)定。8(一)純粹試驗（分離培養(yǎng)、鑒定）。8達到：毒力強，純粹，抗原好，穩(wěn)定的菌種，最后凍干保藏。這就是強毒菌種的標準。復壯：弱毒菌種在敏感動物或細胞上多次傳代，達到毒力增強的目的（日本731部隊用人試驗，目的是增強細菌毒力，做細菌武器使用。）。9達到：毒力強，純粹，抗原好，穩(wěn)定的菌種，最后凍干保藏。這就是三、弱毒種的選育1、用途：弱毒疫苗，診斷試劑，免疫血清。2、來源：自然界篩選和人工誘變。3、弱毒篩選途徑：10三、弱毒種的選育101111自然界弱毒篩選：同源弱毒—新城疫I系異源弱毒—火雞皰疹病毒疫苗，它們都是在自然界尋找發(fā)現(xiàn)的。人工誘變篩選：

12自然界弱毒篩選：12人工致弱強毒株(1)物理途徑：高溫、干燥、射線等1881年，巴斯德將炭疽強毒菌在42.5℃高溫下長期傳代培養(yǎng)，育成了炭疽弱毒菌株。巴斯德又將含有狂犬病病毒的腦脊髓置干燥條件中處理，獲得了狂犬病病毒弱毒株。日本乙型腦炎病毒強毒株經紫外線照射后能引起基因突變，從而出現(xiàn)遺傳性狀分離，再進行蝕斑挑選，育成弱毒株用于制造弱毒疫苗。13人工致弱強毒株13(2)化學途徑：化學誘變劑如通過亞硝基胍處理支原體己育成了雞支原體疫苗株和肺炎支原體突變株；將豬副傷寒沙門氏菌強毒株在含有1／500~1／1000醋酸鉈的肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)傳50代后，育成了弱毒株。14(2)化學途徑：化學誘變劑14(3)生物學途徑①適應鈍感動物(非自然宿主)：我國的豬瘟兔化弱毒株，是將豬瘟病毒強毒株通過兔體傳400余代后育成的。②適應鈍感禽胚：鴨瘟雞胚化弱毒株，是將鴨瘟病毒強毒株經鴨胚傳9代和雞胚傳23代后育成的。羊痘弱毒株---強毒株,雞胚傳代;雞痘弱毒株—強毒株,鵪鶉傳代;③適應細胞：多采用同源或異源動物組織的原代細胞。我國的馬傳染性貧血病驢白細胞弱毒株，是將馬傳染性貧血病驢白細胞強毒株通過驢白細胞傳代育成的。豬丹毒弱毒株(GC42)---強毒株-豚鼠370代,雞2代.15(3)生物學途徑15④雜交減毒：流行性感冒弱毒株的育成是將溫度敏感株(毒力弱，抗原性弱)與流行株(毒力強，抗原性強)進行混合培養(yǎng)傳代，兩者毒力基因發(fā)生交換產生毒力低、抗原性強的毒株。(4)基因工程途徑偽狂犬病病毒，去除決定其致病力的TK基因獲得偽狂犬病病毒TK突變株，用該突變株制成的疫苗是第一個商品化的基因缺失疫苗，預防偽狂犬病效果十分理想。16④雜交減毒：164、初選的依據(jù)：生物性狀改變—豬丹毒桿菌變長絲狀，菌落光滑變粗糙。病毒蝕斑變異。溫度敏感變異。藥物敏感變異營養(yǎng)變異宿主變異174、初選的依據(jù)：17第三節(jié)細菌培養(yǎng)技術

細菌培養(yǎng)技術是生物制品制造的基礎，一些內容在微生物學已經學習過，這里主要講一些重要的細菌培養(yǎng)技術。18第三節(jié)細菌培養(yǎng)技術

細菌培養(yǎng)技術是生物制品一、細菌生長規(guī)律與條件大家一定要熟悉細菌的生長曲線，因為不同的生物制品，要用不同時期的細菌，如細菌疫苗，要對數(shù)期或穩(wěn)定期細菌；芽孢疫苗，要衰老期細菌；外毒素要老齡細菌。19一、細菌生長規(guī)律與條件大家一定要熟悉細菌的生長其次，要根據(jù)不同細菌用不同的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，用不同的培養(yǎng)方法（需要氧氣，微需氧，厭氧。另培養(yǎng)溫度，pH，滲透壓等。）。20其次，要根據(jù)不同細菌用不同的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，用不同的培養(yǎng)方法二、細菌培養(yǎng)的基本技術

步驟：先分離出單個菌落→斜面培養(yǎng)基→生化或血清鑒定→菌種保存→生產生物制品→先接種到斜面菌種→小三角瓶肉湯→大三角瓶肉湯。21二、細菌培養(yǎng)的基本技術

步驟：先分離出單個菌落（一）細菌分離培養(yǎng)（目的是稀釋病料，得到單個典型菌落）。1、需氧菌分離培養(yǎng)：分段劃線、傾注培養(yǎng)。2、微需氧培養(yǎng)：鴨疫巴氏桿菌，牛布氏桿菌病，豬傳染性胸膜肺炎菌等，用蠟燭缸方法。3、厭氧菌培養(yǎng)：用皰肉基，物理除氧氣（加氮氣，氫氣），化學除氧：焦性沒食子酸加燒堿。22（一）細菌分離培養(yǎng)（目的是稀釋病料，得到單個典型菌落）。2223232424厭氧罐25厭氧罐2526262727厭氧培養(yǎng)箱28厭氧培養(yǎng)箱28（二）細菌的規(guī)模培養(yǎng)生物制品是產品，一般要大規(guī)模培養(yǎng)，才能滿足基層需要。1、菌種接種量：1-3%，過少生長慢，過度帶入有害產物多，影響生長。2、培養(yǎng)時間：菌苗，對數(shù)期和穩(wěn)定期的細菌好；芽孢疫苗：衰老期細菌；外毒素：需要1周時間培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，如果有少量污染，可以提前滅活終止培養(yǎng)。29（二）細菌的規(guī)模培養(yǎng)29②液體靜止培養(yǎng)：一般細菌疫苗多用，用大三角瓶（5000ml）或發(fā)酵罐，裝入培養(yǎng)基1/2—-2/3量，需氧培養(yǎng)，要5小時搖動一次，增加氧氣濃度。培養(yǎng)厭氧細菌，可以裝滿培養(yǎng)基，上面加少量石蠟油，隔絕空氣，下加肝塊或肉渣（皰肉基），它們氧化，吸收氧氣，達到除氧氣目的。液體培養(yǎng)含菌量低，多需要濃縮。30②液體靜止培養(yǎng)：一般細菌疫苗多用，用大三角瓶（5000ml）3、培養(yǎng)方法：根據(jù)不同制品的性質和要求，選育不同方法。①固體表面培養(yǎng)：多用于診斷劑，也有菌苗生產?？呻S意調節(jié)細菌濃度，但操作麻煩，勞動量大。培養(yǎng)方法有克氏瓶，大平皿，到入菌液，L玻棒刮抹接種，培養(yǎng)后加生理鹽水，再用L棒刮洗下細菌混懸液。313、培養(yǎng)方法：根據(jù)不同制品的性質和要求，選育不同方法。3132323333③液體深層通氣培養(yǎng)（發(fā)酵罐）：可自動調節(jié)溫度、氧氣、pH、營養(yǎng)、攪拌，注意消泡沫和污染。④透析培養(yǎng)：半滲透膜作用，營養(yǎng)可以不斷補充，可以提高細菌和毒素含量。⑤連續(xù)培養(yǎng)：營養(yǎng)不斷加入，培養(yǎng)好的細菌不斷流出。34③液體深層通氣培養(yǎng)（發(fā)酵罐）：可自動調節(jié)溫度、氧氣、pH、營KRH-PB-6L玻璃發(fā)酵罐35KRH-PB-6L玻璃發(fā)酵罐35（三）細菌計數(shù)技術細菌疫苗必須有一定含菌量，才有好的免疫效果。所以，應該對生產的疫苗計算含菌量。1、直接顯微鏡檢查計數(shù)①定量定面積染色計數(shù)：10ul菌液，涂抹1cm2面積的載玻片上，干燥固定染色，油鏡下觀察，油鏡直徑是0、16mm，視野面積是0、02mm2，1cm2面積有50萬個油鏡視野，多觀察幾個視野，算出一個視野細菌平均數(shù)X50萬X100，即每ml含細菌量。36（三）細菌計數(shù)技術細菌疫苗必須有一定含②比例法計數(shù)（也叫對照法）如用已知人紅細胞為500萬/mm3（可以把紅細胞0、4%甲醛固定，長期使用），取一環(huán)紅細胞放在載玻片上，另取一環(huán)菌液與紅細胞混勻涂片，干燥固定染色，顯微鏡下檢查，如果平均每個視野是一個紅細胞，10個細菌，那么，被檢查細胞為5000萬/mm3，，1ml是500000萬個細菌。37②比例法計數(shù)（也叫對照法）37③估計計數(shù)法接種環(huán)直徑在0.5cm，取一環(huán)細菌液，涂抹在載玻片上，大約0.5—1cm2，干燥固定染色，顯微鏡檢查，如果每個視野平均是1—9個細菌，菌液含量是105-6個/ml，10—99為107-8個/ml，100以上為109-10個/ml，密不可計為1010個以上/ml。38③估計計數(shù)法38④紅細胞計數(shù)室法：（細菌量）Y/80X400X稀釋倍數(shù)X10=細菌數(shù)/mm3，變ml乘1000。（Y是5個中方格細菌總數(shù)，乘10是計數(shù)室的高度為0、1mm，計數(shù)室1mm2，有400個小格，有25個中格，每個中格是16個小格）。該方法多用于計數(shù)大的細菌或酵母菌、細胞。39④紅細胞計數(shù)室法：39404041412、比濁比色法①比濁管法含菌量與渾濁度正比，用已知菌含量的試管與標準比濁管相比，找出規(guī)律，如1億細菌=1號比濁管顏色，10億等10號，以后，用未知細菌液與標準管比色，得出大致細菌含量。

422、比濁比色法①比濁管法含菌量與渾濁度正比，用已知菌含量②美藍還原褪色法：含細菌多，使美藍褪色快。10ml牛奶，加1ml美藍液（1/3000），37度水浴，褪色少于20分鐘，細菌多于2000萬/ml，20-2小時，為400—2000萬；2----5、5小時為50—400萬；5、5小時以上，為少于50萬/ml，為一級牛奶；如果用于細菌苗，應先用已知細菌找出規(guī)律。43②美藍還原褪色法：含細菌多，使美藍褪色快。10ml牛奶，加13、活菌計數(shù)：原理，一個菌落是一個細菌的后代，數(shù)菌落就知道含菌量，也叫菌落形成單位—CFU：colonyformatunite。①傾注法（GB方法）：菌液10倍遞減稀釋，選2-3個稀釋度，各取1ml于平皿，加45-50℃營養(yǎng)瓊脂15-20ml，搖勻37度培養(yǎng)，計算菌落，乘稀釋倍數(shù)，即每ml細菌數(shù)。443、活菌計數(shù)：原理，一個菌落是一個細菌的后代，數(shù)菌落就知道含②平板表面涂布法：先做好營養(yǎng)瓊脂平板，將不同稀釋度菌液0、1ml加上，玻璃棒刮勻，37度24h培養(yǎng)，計算菌落乘稀釋度乘10=菌數(shù)/ml③微量滴板法：將不同稀釋度菌液，各取0、02ml滴在營養(yǎng)瓊脂板上，一板可以滴多點，自然擴散，37度培養(yǎng)，計算每點菌落乘50乘稀釋度=菌數(shù)/ml。45②平板表面涂布法：先做好營養(yǎng)瓊脂平板，將不同稀釋度菌液0、1三、培養(yǎng)基

微生物學已經學過，自己溫習，重點熟悉：不同微生物用不同的培養(yǎng)基來培養(yǎng)注意各種營養(yǎng)物質濃度配比調節(jié)合適的pH范圍46三、培養(yǎng)基

微生物學已經學過，自己溫習，重點熟悉：46第三節(jié)病毒的增殖技術

一、病毒的復制與培養(yǎng)病毒為專性細胞寄生物，必須在活細胞內生存，其復制過程是：吸附，進入，脫殼，生物合成，裝配和釋放。微生物已經講，自己復習。

二、病毒的動物接種增殖（一）、病毒材料的處理1、病毒的釋放：剪碎研磨，1：5-10稀釋，冰凍融及超聲波處理。2、除雜菌：細菌過濾器過濾，高速離心取上清液；其次是抗生素處理，加500—1000u/ml青霉素和鏈霉素，4度過夜殺菌。47第三節(jié)病毒的增殖技術

一、病毒的復制與培養(yǎng)47（二）動物選擇健康動物、SPF動物；未接種相應病毒疫苗動物適宜年齡和體重易感動物。（三）接種方法：皮下，肌肉，靜脈，腹腔，腦，胸腔等48（二）動物選擇48三、雞胚的接種

（一）雞胚的選擇1、健康的SPF雞胚2、白殼，薄殼消毒蛋3、沒免疫相應病毒疫苗4、5-7天照蛋，去無精、死胚雞蛋5、畫出氣室，接種24h照蛋，定時收病毒。49三、雞胚的接種

（一）雞胚的選擇49（二）雞胚的接種和收獲避開血管和心臟，確定接踵部位，先碘酒消毒，再酒精消毒，用三棱針或12號針頭鉆孔，然后可以接種。預先準備好病料，注射器，融化的石蠟。1、卵黃囊接種：用5-8天雞胚，在氣室中心，胚胎對側刺入3cm（先用三棱針鉆孔）。用于病毒，立克次氏體，衣原體接種。2、尿囊腔接種，用9-11日雞胚，在氣室邊緣下2cm，避開血管，40°進針0.5-1.5cm。適應雞新城疫，鴨肝炎，雞傳染支氣管炎病毒接種。50（二）雞胚的接種和收獲5051515252方法：(a)將蛋胚在檢卵燈上照視，標出氣室與胚胎位置，并在絨毛尿囊膜血管較少的地方作記號。

(b)將蛋胚鈍端向上豎放在蛋座木架上。用碘酒消毒氣室蛋殼，并用鋼針在記號處鉆一小孔。(c)用帶18mm長針頭的1ml注射器吸取雞新城疫病毒液，針頭刺入孔內，經絨毛尿囊膜入尿囊腔，注入0.1ml病毒液。(d)用石蠟封孔后于37℃孵卵器孵育72小時。53方法：53收獲尿囊液：

(a)將蛋胚放在冰箱內冷凍半日或一夜，使血管收縮，以便得到無胎血的純尿囊液。

(b)用碘酒消毒氣室處的卵殼，并用滅菌剪刀除去氣室的卵殼。切開殼膜及其下面的絨毛尿囊膜，翻開到卵殼邊上。

(c)將雞卵傾向一側，用滅菌吸管吸出尿囊液。一個蛋胚約可收獲6ml左右尿囊液。若操作時損傷了血管，則病毒會吸附在紅細胞上，尿囊液成為無用。收獲的尿囊液經無菌試驗后可在4℃以下的溫度中保存。觀察雞胚，看有無典型的癥狀。54收獲尿囊液：

(a)將蛋胚放在冰箱內冷凍半日或一夜，使血管收3、羊膜腔接種：用10-12日雞胚，在胚胎對側進針，有抵抗時注入病毒。4、絨毛尿囊膜接種：選11—13日雞胚，先造人工氣室，然后在人工氣室內注射，適合痘病毒，皰疹病毒等。另外，還有腦，胚體，靜脈接種，難度大，科研使用。不同病毒用不同接種途徑，培養(yǎng)時間不同，收獲組織也不同。553、羊膜腔接種：用10-12日雞胚，在胚胎對側進針，有抵抗時56565757（三）影響禽胚增殖病毒的因素1、種蛋質量：要用SPF蛋，母源抗體存在，抗生素（對立克次氏體和衣原體）。2、孵化環(huán)境：溫度是37.8--38℃，濕度53-57%，通風，定時翻蛋。3、接種技術：無菌操作和消毒，收獲根據(jù)不同病毒，收獲病毒時間不同，不要臭蛋和渾濁蛋。收獲后測效價，加雙抗-20℃保存。58（三）影響禽胚增殖病毒的因素58四、細胞增殖病毒技術1、細胞培養(yǎng)概念：利用機械、酶、化學方法使組織或單層細胞分散成單個或2-4個細胞的懸液，進行培養(yǎng)。原代細胞：新鮮組織制備的單細胞進行培養(yǎng)，一般僅可以傳代3代。二倍體細胞：自繼代細胞選出的也特殊生物學標志的細胞，染色體是二倍體，可傳代50-100代，主要做疫苗生產。細胞株傳代細胞：非二倍體，多為癌細胞，可無限生長，如Hela細胞，多用做病毒研究，不能做疫苗生產。細胞系59四、細胞增殖病毒技術1、細胞培養(yǎng)概念：利用機械、酶、化2、細胞培養(yǎng)的方法靜止培養(yǎng)：細胞懸液接入培養(yǎng)瓶中，密封置溫箱培養(yǎng)，細胞沿瓶子壁長成單層，為最簡單培養(yǎng)病毒方法。轉瓶培養(yǎng)：細胞懸液在轉瓶旋轉培養(yǎng)，10-20轉/h，細胞貼壁生長，需要營養(yǎng)液少。懸浮培養(yǎng)：通過震蕩，轉動使細胞懸浮于液體中培養(yǎng)。微載體培養(yǎng)：以固體小顆粒為載體，便于細胞附著，載體擴大了表面積。中空纖維培養(yǎng)：細胞在中空纖維內生長。微囊化培養(yǎng)：細胞在微囊中生長。602、細胞培養(yǎng)的方法603、細胞的制備1)細胞間有膠原蛋白，要破壞它們才變成分散單細胞。機械分散：將組織剪碎成1mm3小塊，再擠壓通過銅絲網孔，可得到單細胞。酶消化法：常用胰酶破壞細胞間質，活力1：250，濃度是0.25%，pH7.4-7.6。鰲合劑分散法：EDTA可除去維護細胞間結合的Ga++和Mg++，常用于單層細胞的分散。613、細胞的制備612)細胞的凍存與復蘇慢凍快融法。取對數(shù)生長期細胞消化后離心，將細胞沉淀用凍存液(10％DMSO，20％犢牛血清，70％MEM)懸浮至細胞密度為200萬～500萬/ml。分裝于細胞凍存管后4℃放置lh，然后-20℃放置2h，再放入-70℃：冰箱4～6h后放入液氮中保存。細胞復蘇時，通常將從液氮中取出的細胞管置于37～40℃水浴40～60s使細胞融化，離心后除去凍存液，然后將細胞懸浮于培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)。必要時待細胞完全貼壁后換液1次，以防止殘留的DMSO對細胞有害。細胞在液氮中可貯存3～5年，但為妥善起見，每凍存1年應復蘇1次。622)細胞的凍存與復蘇624、細胞培養(yǎng)的要素營養(yǎng)物資：培養(yǎng)液（含氨基酸，犢牛血清，維生素，鹽，糖等成分）。現(xiàn)多用成品細胞培養(yǎng)基，engle液，RPMI-1640和DMEM等。接種量：與單細胞生長成正比，量過大，因細胞碎片產生毒性作用，過小，不易長成單層。不同細胞有不同接種量，如鼠腎細胞50萬/ml，雞成纖維細胞20—40萬ml，豬腎細胞80萬/ml，血球計數(shù)室計數(shù)。634、細胞培養(yǎng)的要素63③血清：使用前須經56℃滅活30min，國內多用犢牛血清。生長液一般血清含量為5％～20％，大部分細胞生長液中加入10％血清已能滿足細胞生長要求。維持液中血清量為0～5％，盡可能不加入血清以維持細胞活力并避免血清對病毒增殖的抑制作用。④pH、溫度、氣體環(huán)境：pH7.2-7.4，不低于6.8，不高于7.6；培養(yǎng)液中的緩沖體系主要是碳酸氫鹽、磷酸氫鹽和氫離子緩沖劑HEPES。溫度一般是37℃，過高容易死亡，過低生長慢，20--25℃，細胞緩慢長。氣體環(huán)境，一是橡皮塞密封培養(yǎng)；二是CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。64③血清：使用前須經56℃滅活30min，國內多用犢牛血清。6

5、污染問題：細菌、真菌、支原體污染，加一定量抗生素可殺菌，如加青鏈霉素100u，有霉菌污染加制霉菌素。病毒污染：有組織代毒和培養(yǎng)帶毒，前者用SPF動物組織可以解決，后者注意滅菌和消毒。膠原蟲：（存在犢牛血清），血清37℃培養(yǎng)1個月以上，高速離心，檢查沉淀物。655、污染問題：656、病毒增殖技術選敏感動物細胞。注意營養(yǎng)，溫度和pH。接種量和方法：1-10%接種，V/V；分同步和異步接種。病毒接種方法有兩種：異步接毒和同步接毒。異步接毒是細胞長成單層后倒去生長液，按維持液的1％～10％接種病毒，37℃吸附1h后加入維持液。多數(shù)病毒采用這種接毒方式。同步接毒是在種植細胞同時或在種植細胞4h內接種病毒，主要用于病毒復制發(fā)生在細胞有絲分裂盛期的病毒，如細小病毒等。支原體污染，加抗生素。666、病毒增殖技術66細胞病變：細胞病變效應(CPE)是判定病毒增殖情況的重要指標。多數(shù)病毒在敏感細胞上增殖可引起CPE．在顯微鏡下主要表現(xiàn)為：①細胞圓縮，如痘病毒、呼腸孤病毒、披蓋病毒等；②細胞聚集，如腺病毒；③細胞融合形成合胞體，如副黏病毒、皰疹病毒；④輕微病變，如正黏病毒、冠狀病毒、彈狀病毒、反轉錄病毒等。但有些病毒杠細胞上增殖不產生CPE，如豬瘟病毒。除CPE外，包涵體和血凝性也可作為判定指標。病毒在敏感細胞內增殖一般在CPE達80％左右時收獲，感染細胞經反復凍融使病毒充分釋放，然后3000r/min離心15～20min去除細胞碎片，上清病毒液-20℃、凍存。對于細胞結合型病毒，如馬立克氏病病毒，收獲的感染細胞直接于液氮中保存。67細胞病變：細胞病變效應(CPE)是判定病毒增殖情況的重要指標收獲：CPE到80%收獲，反復凍融，離心取上清夜，測效價，加雙抗，-20℃保存。6868疫苗生產工藝流程

菌（毒）種培養(yǎng)物（培養(yǎng)基、動物、禽胚或細胞等）收獲抗原（培養(yǎng)液、含毒組織、胚液或細胞液等）配苗

分裝凍干成活疫苗或滅活后制成滅活疫苗。第四節(jié)疫苗制造流程69疫苗生產工藝流程第四節(jié)疫苗制造流程69一、細菌滅活疫苗制造1、種子：毒力強，免疫原性好，1—3個菌株，菌種逐級擴大培養(yǎng)。2、培養(yǎng)：選適當培養(yǎng)基和方法，如固體或液體培養(yǎng)，要計數(shù)活菌和觀察純度。3、滅活和無菌檢查：加適量甲醛37度滅活24h，接種斜面培養(yǎng)基無菌檢查，4、濃縮提高含菌量：離心或沉淀方法。5、配佐劑分裝：加20%鋁膠，或油2：1水油乳化，無菌分裝，加塞，封蠟，標簽和裝箱。6、動物安全試驗，接種小白鼠0、2ml觀察3天，健活。70一、細菌滅活疫苗制造70二、細菌弱毒疫苗制造1、菌種：中監(jiān)所提供凍干種。2、培養(yǎng)：1-3%量接種，檢查純度和計數(shù)。3、濃縮：離心或吸附沉淀法（用0、2-0、25%羧甲基纖維素濃縮。4、配苗和凍干：加入合適濃度保護劑，分裝，凍干，加塞，封口，標簽和裝箱。5、動物安全試驗。71二、細菌弱毒疫苗制造71細菌疫苗的制造流程蛋白胨、肉浸液等原料培養(yǎng)基配制、滅菌菌種生產用種子培養(yǎng)菌液菌苗原液配苗分裝凍干、扎蓋帖簽活疫苗原料佐劑滅活菌液配苗乳化分裝、扎蓋、帖簽滅活疫苗滅活檢驗配制、滅菌保護劑原料配制、滅菌72細菌疫苗的制造流程蛋白胨、肉浸液等原料培養(yǎng)基配制、滅菌菌種生三、病毒性動物組織苗制造病毒在易感動物體內增殖，用含毒量高的組織制造疫苗，叫滅活組織苗，如兔瘟，自家組織滅活苗；弱毒疫苗有豬瘟兔化弱毒疫苗。（一）自家組織滅活苗1、選癥狀典型、含毒量高的組織。2、稱重和打勻：切碎組織，搗碎機打勻，一般按組織和生理鹽水按1：5—8打勻加生理鹽水，加青鏈霉素各1000u/ml。3、凍融和過濾：冰柜反復冰凍和融化三次，釋放病毒，8層紗布過濾。73三、病毒性動物組織苗制造734、滅活：加0.4%甲醛滅活，37度24h，5、無菌檢查：接種斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，無細菌生長。菌苗8層紗布再過濾一次。6、加佐劑分裝：加20%鋁膠，分裝。7、動物安全檢查:接種小白鼠0、2ml，觀察3天，無反應，安全。8、場內實驗：先注射兩頭豬，觀察三天，無反應，全場使用。9、使用方法：8、18日齡仔豬每次注射2-3ml；大豬發(fā)病前1個月、半月各注射5ml。10、保存：2-15℃一年。744、滅活：加0.4%甲醛滅活，37度24h，74（二）病毒弱毒疫苗選易感的SPF動物，年齡大小一致。毒種：選適宜毒力的病毒，減少傳代次數(shù)，選適宜接種途徑。觀察、收獲和測效價：觀察食欲、體溫、精神等，符合癥狀者剖殺，取含度高組織測效價，符合效價可以做疫苗。研磨、稀釋和殺菌：將組織剪碎研磨，按1：10—1：100加入稀釋劑，過濾，加雙抗500-1000u/ml，0-4度處理過夜。75（二）病毒弱毒疫苗75無菌檢查，半成品疫苗接種適宜培養(yǎng)基培養(yǎng)，無細菌生長。加保護劑凍干分裝。動物安全試驗，接種適宜動物10倍量，3天安全。保存：-15℃一年。（使用：弱毒疫苗一般3-5天產生免疫。）76無菌檢查，半成品疫苗接種適宜培養(yǎng)基培養(yǎng)，無細菌生長。76病毒性組織疫苗的制造工藝流程感染動物或胚胎分裝、扎蓋、貼簽健康動物或SPF雞胚等健康動物或SPF雞胚等動物或SPF雞胚等基礎種毒生產用種毒收獲感染組織或胚液純化配制成含毒懸液配苗分裝凍干活疫苗保護劑原料配制檢驗滅活病毒液配苗、乳化滅活疫苗原料佐劑配制滅活檢驗77病毒性組織疫苗的制造工藝流程感染動物或胚胎分裝、扎蓋、貼簽健四、病毒禽胚疫苗的制備除禽病可以用禽胚外，其它正粘病毒（流感）、副粘病毒等，都可以用禽胚培養(yǎng)，生產工藝簡單，質量容易控制。78四、病毒禽胚疫苗的制備78雞胚的選擇：SPF、未免疫、未用抗生素，適宜的雞胚齡。種毒和繼代：凍干毒要雞胚活化三代以上，效價合格方可使用。接種與收獲:接種合適部位、合適時間，適宜濃度和量，如NDⅠ系，為10-3、0.1ml接種。NDⅡ系是用10-4、0.1ml接種.培育及收獲：NDⅠ系，為38、5-39℃,60-70%濕度培育，收24-48h的雞胚，0-4℃冷卻，收尿囊液。79雞胚的選擇：SPF、未免疫、未用抗生素，適宜的雞胚齡。79檢查無菌和效價。NDNDⅠ系效價是1：80以上合格。配疫苗：濕疫苗：尿囊液加雙抗，-20℃保存1-2年，0-8℃保存3-6個月。用時按10-4稀釋，每雞一滴。凍干疫苗：尿囊液適當稀釋10-2，加等量保護劑，雙抗，分裝凍干，-15℃一年保存。油乳滅活疫苗：尿囊液適當稀釋10-2，加0.1%甲醛滅活，加雙抗，按油：水疫苗，3-1：1乳化即成，3-15度保存半年，小雞0、1-0、2ml，大雞0、5—1ml。80檢查無菌和效價。NDNDⅠ系效價是1：80以上合格。80五、病毒細胞疫苗的制備(一)種毒和繼代：毒種要經過毒力、安全、無菌檢查合格才可以做毒種。其次，毒種要細胞適應后可以大規(guī)模培養(yǎng)。（二）營養(yǎng)液：多用專門商品培養(yǎng)基。（三）細胞制備：多用原代細胞和二倍體細胞，選擇依據(jù)：病毒適應性高、毒價高，細胞來源方便、制備簡單，生命力強。不能用癌細胞或其它含逆轉錄病毒的細胞。81五、病毒細胞疫苗的制備81（四）接毒和收獲：接毒分同步和異步，同步即細胞分裝后不久接種，如細小病毒。異步是細胞形成單層后接種，如豬水泡病病毒。一般按1—2%量接種，70-85%細胞病變時收獲。（五）配疫苗：1、滅活苗，加入滅火劑，阻滯劑，再加佐劑混合而成。2、凍干疫苗，加保護劑混合，分裝凍干。82（四）接毒和收獲：接毒分同步和異步，同步即細胞分裝后不久接種病毒性細胞疫苗的制造工藝流程健康動物（或胚胎）組織原料細胞懸液生長細胞病毒液配苗分裝凍干、扎蓋帖簽活疫苗基礎種毒生產用種毒原料保護劑配制滅菌細胞培養(yǎng)液傳代細胞滅活病毒液配苗（混勻、乳化）分扎蓋帖簽裝滅活疫苗檢驗原料佐劑配制滅菌滅活檢驗配制培養(yǎng)收獲83病毒性細胞疫苗的制造工藝流程健康動物（或胚胎）組織原料細胞懸六、寄生蟲疫苗是新發(fā)展的疫苗，臨床主要用的有雞球蟲疫苗及原蟲疫苗。大寄生蟲因為抗原復雜，不可做疫苗。致弱疫苗蟲體致弱，篩選天然弱毒蟲株做疫苗。人工致弱：體內傳代致弱，牛巴貝斯蟲在犢牛傳15代成弱毒。

84六、寄生蟲疫苗84

體外傳代致弱，如艾美爾球蟲通過雞胚傳代，牛泰勒蟲是淋巴細胞傳代致弱，還有放射線和藥物致弱。抗原疫苗：大量提取寄生蟲有效保護性抗原制成。寄生蟲抗原苗：獲取大量蟲體----機械粉碎裂解----提取抗原浸出物---濃縮配苗。分子水平寄生蟲疫苗；通過基因生物工程，獲取大量純化的寄生蟲功能抗原，制成疫苗。85體外傳代致弱，如艾美爾球蟲通過雞胚傳第四節(jié)診斷用生物制品制造技術

診斷劑；是利用微生物，寄生蟲，及其代謝產物，及高免血清制成,用于鑒定微生物以及診斷動物傳染病的試劑。分診斷抗原、診斷抗體和標記抗體三類，原理是根據(jù)抗原抗體特異反應。86第四節(jié)診斷用生物制品制造技術

診斷劑；是利用（一）診斷抗原：用已知抗原成分，來檢測血清未知抗體的方法。1、凝集反應抗原：常見有雞白痢、布氏、馬流產，雞支原體，豬萎鼻抗原。抗原是顆粒狀，加被檢查血清，如果反應，出現(xiàn)大顆粒或片狀凝集。下面講雞白痢沙門氏菌全血平板抗原制備步驟；雞白痢沙門氏菌---固體平板培養(yǎng)—2%甲醛生理鹽水洗菌苔滅活—離心沉淀比濁（100億/ml---加結晶紫染色（3/10000）--加10%甘油—混勻即成。使用：取被檢母雞翅下靜脈血一滴在玻璃板上，加一滴抗原攪和勻,3—10分鐘出現(xiàn)凝集為陽性。87（一）診斷抗原：用已知抗原成分，來檢測血清未知抗體的方法。82、沉淀抗原：是可溶抗原（細菌浸出物，病毒），炭疽沉淀抗原、馬立克氏抗原，法氏囊抗原等。①炭疽沉淀抗原：懷疑炭疽病料—剪碎研磨—1：10加入生理鹽水—煮半小時—濾紙過濾---即成。使用：將炭疽沉淀素加入直徑0.5厘米試管---上面慢慢加入制備的沉淀抗原，3-10分鐘，兩液界面出現(xiàn)白色沉淀環(huán)沉淀。882、沉淀抗原：是可溶抗原（細菌浸出物，病毒），炭疽沉淀抗原②雞法氏囊病抗原：取典型病變法氏囊數(shù)個稱重—剪碎研磨---加0.5%石炭酸生理鹽水1：5量—凍融三次—高速離心取上清液即成。使用：制備1%瓊脂板（5%氯化鈉液，加1%瓊脂糖，煮3-5分鐘，倒平板）--在板上打梅花孔7個（孔間距離3—5mm，孔底火焰封底），中央孔加抗原，外周孔加不同稀釋的抗體，30-37℃1-3天觀察，如果出現(xiàn)沉淀線，說明抗體的效價。特異線是內彎弧，非特異是外彎或直線。89②雞法氏囊病抗原：取典型病變法氏囊數(shù)個稱重—剪碎研磨---加人醫(yī)用非特異抗原，牛心肌浸出物，測定人血清梅毒抗體，是康氏反應。3、補體結合抗原（制備同凝集反應抗原）：因補體結合反應需5—7天時間，準備要5種材料，現(xiàn)很少使用。90人醫(yī)用非特異抗原，牛心肌浸出物，測定人血清梅毒抗體，是康氏反（二）變態(tài)反應抗原；獸醫(yī)經常用測牛結核病，布氏病，馬鼻疽。原理：是傳染性變態(tài)反應，屬遲發(fā)變態(tài)反應，多用于胞內細菌感染，寄生蟲病測定；方法有滴眼、觀察眼紅腫流淚；皮內注射、觀察皮膚增厚。布氏桿菌水解素：菌種—固體表面培養(yǎng)—0.5%石炭酸生理鹽水洗下—離心洗滌濃縮—高壓滅菌水解—蔡氏濾器過濾—剴氏定氮0.4—0.5mg/ml。91（二）變態(tài)反應抗原；獸醫(yī)經常用測牛結核病，布氏病，馬鼻疽。9二、診斷抗體有診斷血清和單克隆抗體血清，原理：已知血清+未知細菌---凝集為陽性。診斷血清制備：用已知細菌疫苗---多次免疫兔子---取血清—加0.5%石炭酸即成。如沙門氏菌A—F多價血清，可以檢測97%范圍的沙門氏菌，不可以定是什么群沙門氏菌，要用因子血清、H血清、VI血清才可以確定是什么血清的沙門氏菌。92二、診斷抗體92因子血清：是僅含某主要抗原的抗體血清。細菌有主要抗原和次要抗原，如沙門氏菌A群的甲型副傷寒菌，O抗原有1、2、12；B群的得爾俾沙門氏菌O抗原是1、4、12；它們兩重復的抗原是1、12，是次要抗原，單獨有的O2，O4是主要抗原，可以區(qū)別它們。93因子血清：是僅含某主要抗原的抗體血清。細菌有主要抗原和次要抗因子血清制備：用甲型副傷寒細菌免疫兔子多次—取血清—然后和B群得爾俾沙門氏菌混合凝集—除去凝集顆粒和片（除去了O1、O12血清）—剩下即只有O2的抗體血清。一般血清為多克隆抗體，是多個不同B細胞產生的抗體，所以反應不準確。單克隆抗體是一個B細胞后代產生的純一抗體。94因子血清制備：用甲型副傷寒細菌免疫兔子多次—取血清—然后和B三、標記抗體抗體經過標記后，增強了反應靈敏性和準確性；由于標記復雜，保質期短和使用少，多為買商品，一般單位不自己制備。常見有熒光抗體、酶標抗體和同位素抗體等。95三、標記抗體951)HRP（辣根過氧化物酶）標記抗體的方法：戊二醛二步法

戊二醛為一種雙功能試劑，通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價結合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結合物。本法標記步驟比較簡單，重復性好。缺點是酶的利用率低，一般只有2～4％的酶與蛋白質結合。2)熒光素標記抗體技術熒光素主要有異硫氰酸熒光素(FITC)或羅達明（RB200)961)HRP（辣根過氧化物酶）標記抗體的方法：戊二醛二步法3)放射性同位素標記抗體技術（一）氯胺T法：氯胺T法標記效率高、重復性好、試劑便宜易得，是目前使用最多的碘標記方法。原理：氯胺—T（Chloramine--T）是一種溫和的氧化劑，在水溶液中產生次氯酸，可使碘陰離子氧化成碘分子。這活性碘可取代肽鏈上酪氨酸苯環(huán)上羥基位的一個或兩個氫，使之成為含有放射性碘化酪氨酸的多肽鏈。（二）乳過氧化物酶法（LPO）本法反應溫和，對抗原、抗體免疫活性影響小，已被廣泛應用。缺點是標記率較低，一般為20～40%。原理此法是利用乳過氧化物酶（Lactoperoxidase）有促進微量過氧化氫對125I-的氧化作用，生成125I+，并標記在多肽、蛋白質酪氨酸分子上（三）Iodogen碘化法：氯甘脲是70年代中期發(fā)展起來的蛋白質碘化試劑,在多肽激素標記中日益廣泛采用。973)放射性同位素標記抗體技術97免疫血清制造流程一、動物的選擇與管理二、免疫原三、免疫程序四、血液的采集與血清提取五、幾種重要畜禽用免疫血清、卵黃抗體的制備方法六、免疫血清及卵黃抗體使用注意事項第六節(jié)治療用生物制品的制造技術98免疫血清制造流程一、動物的選擇與管理第六節(jié)治療用生物制品的1、免疫血清的概念又稱高免血清、抗血清、免疫血清、被動免疫制品。利用病原微生物或其代謝產物等作為免疫原，經過反復多次注射同一動物體，促使動物不斷產生免疫應答，在血清中含有大量對應的特異性抗體而制成。分類（據(jù)免疫血清作用的對象不同）：抗病血清和抗毒素。991、免疫血清的概念又稱高免血清、抗血清、免疫血清、被動免疫制2、作用機理含有特異性的免疫球蛋白——抗體輸入動物體后，動物即可被動地獲得抗體，從而形成免疫力，即所謂的人工被動免疫。當動物已感染某種病原微生物發(fā)生傳染病時，注射大量抗病血清后，由于抗體的作用，可抑制動物體內的病原體繼續(xù)繁殖，并協(xié)助體內正常防御機能，消滅病原微生物，使病畜逐漸恢復健康。特點：具有很強的特異性，一種血清只對相應的一種病原微生物或毒素起作用。1002、作用機理含有特異性的免疫球蛋白——抗體輸入動物體后，動物3、應用用作緊急預防注射，通常是在已經發(fā)生傳染病或受到傳染病威脅的情況下使用。優(yōu)點：產生免疫力快，缺點：持續(xù)期短（一般僅2~3周）。目前生產較多的抗病血清有：破傷風抗毒素、1013、應用用作緊急預防注射，通常是在已經發(fā)生傳染病或受到傳染病4、免疫血清制造流程動物的選擇與管理→免疫原的制備→免疫程序→血液采集與血清提取1024、免疫血清制造流程動物的選擇與管理→免疫原的制備→免疫程序一、動物的選擇與管理（一）動物的選擇1、動物的品種用于制備免疫血清的動物有馬、牛、山羊、綿羊、豬、兔、犬、雞和鵝等。用同種動物產生的稱同源血清，用異種動物生產的稱異源血清。103一、動物的選擇與管理（一）動物的選擇1、動物的品種用同種動物（1）制備抗菌和抗毒素血清多用異種動物，通常用馬和牛等大動物制備。如破傷風抗毒素多用青年馬制備，抗豬丹毒血清多用牛制備。

抗病毒血清的制備多用同種動物。如犬瘟熱血清用犬制備，抗豬瘟血清用豬制備。（2）制備免疫血清用馬較多，也可使用多種動物（如馬、牛、羊三種動物）制備一種抗毒素血清。（3）選定動物應有一定的數(shù)量，一個批次應用多頭動物。104（1）制備抗菌和抗毒素血清多用異種動物，通常用馬和牛等大動物2、動物的年齡及健康情況（1）通常選擇體型較大、性情溫馴、體制強健的青壯年動物為宜。馬以年齡3~8歲、體重350kg以上者為宜；牛以3~10歲、體重300~400kg以上為宜；豬以50kg以上，年齡6~12月齡為宜；家兔體重需達2kg以上為好。（2）供制造免疫血清的動物，必須從非疫區(qū)選購，經過嚴格檢疫，并經隔離觀察，每日測溫兩次，觀察2周以上，確認健康者方可應用。1052、動物的年齡及健康情況（1）通常選擇體型較大、性情溫馴、體（二）動物的管理1、動物應在隔離條件下飼養(yǎng)，杜絕高免時強毒及發(fā)病時散毒。2、應詳細登記每頭動物的來源、品種、性別、年齡、體重、特征及營養(yǎng)狀況、體溫記錄和檢疫結果等，建立制造血清動物的檔案，只有符合要求的動物才能投入生產。3、加強日常飼養(yǎng)管理，給適量的食鹽和含鈣的補充飼料。106（二）動物的管理1、動物應在隔離條件下飼養(yǎng)，杜絕高免時強毒及4、在高度免疫和采血期間，每日要檢測體溫兩次，隨時觀察其健康情況。每日至少運動4h。動物采血前1d禁食喂水，避免血中出現(xiàn)乳糜。5、在生產過程中，若發(fā)現(xiàn)健康狀況異常或有患病可疑時，應停止注射抗原和采血，并進行隔離治療。1074、在高度免疫和采血期間，每日要檢測體溫兩次，隨時觀察其健康二、免疫原（一）免疫原的基本要求一般來說，顆粒性抗原較可溶性抗原的抗原性強，聚合狀態(tài)的蛋白質較單體狀態(tài)的蛋白質免疫原性強。相對分子質量較小和抗原性較低的蛋白質應吸附于載體上，才可獲得較高的免疫原性。異物性、結構的復雜性、分子量大、一定的物理性狀。108二、免疫原（一）免疫原的基本要求一般來說，顆粒性抗原較可溶性（二）免疫原的制備1、抗細菌免疫血清制備基礎免疫用抗原多為疫苗或死菌，而高度免疫的抗原，一般選用毒力較強的毒株。多價抗病血清用的抗原，要求用多血清型菌株。細菌抗原：培養(yǎng)→洗菌苔→離心→計數(shù)→稀釋為含菌100億/毫升→滅活（水浴80℃2h或加0.4%甲醛37℃24~48h）。109（二）免疫原的制備1、抗細菌免疫血清制備1092、抗病毒免疫血清制備以病毒為免疫原，須通過反復凍融或超聲裂解方法，將病毒從細胞中釋放出來，并盡可能地提高病毒滴度和免疫原性。如抗豬瘟血清，基礎免疫的抗原，可用豬瘟兔化弱毒疫苗；高度免疫抗原，則用豬瘟血毒或臟淋毒乳劑等強毒。病毒抗原：①離心：8000轉/min20min→取上清液→超速離心2萬轉/min2h→病毒沉淀下來。②聚乙二醇吸附：聚乙二醇+NDV尿囊液→NDV↓。③透析袋：將病毒培養(yǎng)液放入透析袋中，用蔗糖吸收水分。1102、抗病毒免疫血清制備1103、抗毒素血清制備免疫原可用類毒素、毒素或全培養(yǎng)物（活菌加毒素），但后兩者只有在需要加強免疫刺激的情況下才應用，一般多用類毒素作免疫原。1113、抗毒素血清制備111三、免疫程序基礎免疫高度免疫（加強免疫）免疫途徑：皮下或肌肉注射，如劑量較大時，采用多部位注射法。112三、免疫程序基礎免疫免疫途徑：皮下或肌肉注射，如劑量較大時，1、基礎免疫：注射死苗或弱毒苗，一般2~3次，間隔時間1~2周，劑量逐漸加大。首免1頭份→1~2周后二免5頭份→1~2周后三免20頭份。可為高度免疫產生有效的回憶應答打下基礎。1131、基礎免疫：注射死苗或弱毒苗，一般2~3次，間隔時間1~22、加強免疫：（高度免疫）：攻強毒（攻多次，一般3~5次），間隔1周?；A免疫后2周第一次加強免疫→1周后第二次加強免疫→1周后第三次加強免疫→……→抗體水平升高→測抗體效價→符合要求→采血→制備血清。（高免的注射次數(shù)要視血清抗體效價而定。有的只要大量注射1~2次強毒抗原，即可完成高度免疫；有的則要注射10次以上，才能產生高效價的免疫血清。

）1142、加強免疫：（高度免疫）：攻強毒（攻多次，一般3~5次），初次及再次免疫應答抗體產生的一般規(guī)律115初次及再次免疫應答抗體產生的一般規(guī)律115（三）制定原則1、免疫原注射途徑一般采用皮下或肌肉注射。如果免疫劑量大，應采用多部位注射法，尤其在應用佐劑抗原時更應注意此點。2、免疫程序對制備高免血清非常重要，掌握抗體消長規(guī)律，適時免疫和采血尤為重要。不能機械地定期免疫和采血。3、如有的動物在長期免疫和采血過程中，可能在抗體達到一定水平后，反而逐漸降低，對免疫原的刺激無應答反應，這可能與免疫劑量、免疫間隔時間和免疫原中混雜免疫抑制物有關。此時，應給免疫動物足夠時間休息，解除免疫抑制作用，并調整免疫程序。116（三）制定原則1、免疫原注射途徑一般采用皮下或肌肉注射。如果四、血液采集與血清提?。ㄒ唬┎裳螖?shù)和方法1、采血時間一般血清抗體的效價高峰在最后一次免疫后的7~10d。按照免疫程序完成免疫的動物，經采血檢驗（試血），血清效價達到合格標準時，即可采血。不合格者，再度免疫，多次免疫仍不合格者淘汰。117四、血液采集與血清提?。ㄒ唬┎裳螖?shù)和方法1、采血時間按照免2、采血次數(shù)采血可以全放血或部分采血，即一次采集或多次采集，采血時應盡可能地作到無菌操作。3、采血方法放血前，動物應禁食24h，但需飲水以防止血脂過高。多次采血者，按體重每千克采血約10ml，經3~5d第二次采血，按體重每千克采8~10ml。第二次采血后經2~3d，注射足量免疫原。如此循環(huán)免疫和采血。全放血者，在最后一次高免之后的8~11d進行放血。1182、采血次數(shù)1184、采血部位豚鼠由心臟穿刺采血；家兔可以從心臟采血或頸靜脈、頸動脈放血，少量采血可通過耳靜脈采取；馬由頸動脈或頸靜脈放血；羊可從頸靜脈采血或頸動脈、頸靜脈放血；家禽可以心臟穿刺采血或頸動脈放血。1194、采血部位119（二）血清的分離采血時一般不加抗凝劑，全血在室溫中自然凝固，在滅菌容器中使之與空氣有較大的接觸面。待血液凝固后進行剝離或者將凝血切成若干小塊，并使其與容器剝離。先置于37℃1~2h，然后置于4℃冰箱過夜，次日離心收集血清。如果采集的血量較大時，可采用自然凝固加壓法。即將動物血直接集于事先用滅菌生理鹽水或PBS液濕潤的玻璃筒內，置室溫自然凝約2~4h，有血清析出時，每采血筒中加入滅菌的不銹鋼壓鉈，經24h后，用虹吸法將血清吸入滅菌瓶中。120（二）血清的分離采血時一般不加抗凝劑，全血在室溫中自然凝固，提取的血清放入滅菌瓶中，加入0.5%石炭酸或0.02%硫柳汞防腐。放置數(shù)日作無菌檢驗。無菌的血清，組批分裝，保存于－15℃半成品庫，待抽檢合格后交成品庫保存出廠。121提取的血清放入滅菌瓶中，加入0.5%石炭酸或0.02%硫柳汞基礎免疫用抗原多為疫苗或死菌，而高度免疫的抗原，一般選用毒力較強的毒株。五、幾種重要畜禽用免疫血清、卵黃抗體的制備方法（一）豬瘟抗血清1、動物的選擇選用60kg左右，健康、營養(yǎng)良好的豬；2、免疫原基礎免疫：豬瘟兔化弱毒疫苗高度免疫：血毒抗病毒血清的制備多用同種動物；通常選擇體型較大、體質強健的青壯年動物。122基礎免疫用抗原多為疫苗或死菌，而高度免疫的抗原，一般選用毒力3、免疫程序（1）基礎免疫注射豬瘟兔化弱毒疫苗2ml（2）高度免疫基礎免疫后隔14～21d后，用強毒進行高度免疫，第一次高免，肌肉注射血毒100ml；第二次，肌肉注射血毒200ml；第三次，肌肉注射血毒300ml；每次間隔10d。4、血液采集第三次高免后9～11d放血，也可以多次采血?；A免疫抗原無須過多過強免疫原注射途徑一般采用皮下或肌肉注射免疫劑量逐漸增加1233、免疫程序基礎免疫抗原無須過多過強123（二）破傷風抗毒素1、動物的選擇選擇5～12歲營養(yǎng)良好的馬匹；2、免疫原基礎免疫：破傷風類毒素高度免疫：血毒124（二）破傷風抗毒素1、動物的選擇1243、免疫程序（1）基礎免疫第一次，注射精制破傷風類毒素油佐劑抗原1ml；第二次，注射2ml。1253、免疫程序125（2）高度免疫基礎免疫1～3個月后進行第一程高度免疫，第一程高度免疫，一般注射5～8針，1～4針各針之間間隔2～3d，5～8針各針之間間隔4～6d?？乖棵酷樳f增1～2ml。第5次開始試血至第8次。第一程采血后，休息14～16d后進行第二程高度免疫，第二程高度免疫，一般免疫3次，間隔5～7d，最后一次免疫后7～9d采血。126（2）高度免疫1264、血液采集第一程高免最后一次免疫后6～7d采血，第二程高免最后一次免疫后7～9d采血，隔1天再次采血，檢測效價。5、血清的純化破傷風血清，用胃酶消化，按次序加入15%、20%硫酸銨進行沉淀，然后加入10%的明礬使明礬含量為1%，靜置使之沉淀。取沉淀后的上清加38%的硫酸銨沉淀，沉淀物經透析即成精制破傷風抗毒素。掌握抗體消長規(guī)律，適時免疫和采血。血清效價達到合格標準時，即可采血。1274、血液采集掌握抗體消長規(guī)律，適時免疫和采血。血清效價達到合（三）抗炭疽血清1、動物的選擇選擇健壯馬匹2、免疫原基礎免疫：炭疽疫苗（無毒炭疽芽孢苗或Ⅱ號炭疽芽孢苗）高度免疫：炭疽強毒或炭疽疫苗128（三）抗炭疽血清1、動物的選擇1283、免疫程序（1）基礎免疫用炭疽疫苗（無毒炭疽芽孢苗或Ⅱ號炭疽芽孢苗）于第1、9、11、13日共進行4次基礎免疫。（2）高度免疫用炭疽強毒或炭疽疫苗，于第15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37日共高免12次，劑量遞增。1293、免疫程序1294、血液采集和血清分離第45日試血，試血合格后，再按最后一次的劑量免疫一次，7～8d后采血分離血清，加防腐劑，密封于冷暗處，靜置1～2個月使之澄清，經檢驗合格后分裝。1304、血液采集和血清分離130（四）卵黃抗體1、定義通過免疫注射產蛋雞，即可由其生產的蛋黃中提取相應得抗體，并可用于相應疾病的預防和治療，該類制劑稱為卵黃抗體。優(yōu)點：成本較低、生產周期較短，能用同批動物連續(xù)生產。缺點：有潛伏野毒的危險。131（四）卵黃抗體1、定義1312、制備過程例如：IBD（雞傳染病法氏囊?。?）選擇健康無病的產蛋雞群，開產前或開產后，以免疫原性良好的IBD油佐劑滅活苗肌肉注射，2ml/只；（2）7~10d后，重復注射一次；（3）再過7~10d再注射一次，油苗劑量適度遞增；（4）第三次免疫后定期檢測卵黃抗體水平，待瓊擴效價達1：128時開始收集高免蛋，4℃貯存?zhèn)溆?。瓊擴效價降到1：64時停止收蛋，可再進行加強免疫。高免蛋合格時間大約持續(xù)1個月。1322、制備過程132（5）將高免蛋用0.5%新潔爾滅溶液浸泡或清洗消毒，再用酒精棉擦拭蛋殼，打取雞卵分離蛋黃。（6）根據(jù)卵黃抗體瓊擴效價水平加入生理鹽水進行稀釋（稀釋后的卵黃抗體瓊擴效價不低于1：16~1：32），加青、鏈霉素各1000IU/ml，加硫柳汞濃度達0.01%，充分攪拌后分裝于滅菌瓶內4℃貯存。（7）每批都進行效價測定、細菌培養(yǎng)和安全檢驗，合格后方可出廠。133（5）將高免蛋用0.5%新潔爾滅溶液浸泡或清洗消毒，再用酒精六、免疫血清及卵黃抗體使用注意事項使用免疫血清時應注意以下方面：①正確診段，盡早應用。特別是治療時，應用越早效果越好。②血清的用量根據(jù)動物的體重和年齡不同而定。預防量，大動物10~12ml，中等動物（豬、羊等）5~10ml；以皮下注射為主，也可肌肉注射。治療量，按預防量加倍，并根據(jù)病情采取重復注射；注射方法以靜脈為好，以使其盡速奏效。134六、免疫血清及卵黃抗體使用注意事項使用免疫血清時應注意以下方③靜脈注射血清的量較大時，最好將血清加溫至30℃左右再注射。④皮下或肌肉注射，當血清量大時，可分幾個部位注射，并加揉壓使之分散。⑤對不同動物源的血清（異源血清），有時可能引起過敏反應。如果在注射后數(shù)分鐘或半小時內，動物出現(xiàn)不安、呼吸急促、戰(zhàn)抖、出汗等癥狀，應立即搶救。搶救的方法，可皮下注射1：100腎上腺素，大動物5~10ml，中小動物2~5ml，反應嚴重者若搶救不及時常造成損失，故使用血清時應注意觀察，發(fā)現(xiàn)問題及時處理。135③靜脈注射血清的量較大時，最好將血清加溫至30℃左右再注射。第七節(jié)生物制品冷凍干燥技術一、概念和優(yōu)點1、概念：疫苗冰凍狀態(tài)下，抽真空，適當加溫，升華為水汽，疫苗冰直接變?yōu)楦晒腆w物質為凍干。136第七節(jié)生物制品冷凍干燥技術1362、優(yōu)點：保護生物及酶的活性。易融化，凍干物為海綿狀，吸水容易，體積沒變。易保存：凍干含水在4%，保存時間長3、應用：生物制品、醫(yī)藥（抗生素、維生素）酶類、食品速溶咖啡等。1372、優(yōu)點：137二、共熔點及測定1、概念：由電阻儀測得，溶質溶液共同融化的溫度點，叫共溶點，也叫凝固點或共晶點。2、測定：電阻法，冰凍溶液在-40℃時，電阻無窮大，當溫度升至某一溫度時，電阻突然降低，此時溫度叫共熔點，水分子才游離出來，真空下冰升華。3、不同保護劑，不同濃度，共熔點不同：有機物濃度越大，共熔點越低。生理鹽水為--22℃，10%蔗糖是—26℃，40%蔗糖是--33℃。138二、共熔點及測定138139139三、凍干機組和凍干程序（一）凍干機組：主要有制冷系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、控制系統(tǒng)。制冷系統(tǒng)：冷凍機，凍干箱，冷凝器。真空系統(tǒng)：真空泵，凍干箱，冷凝器。加熱系統(tǒng)：有電直接加熱和循環(huán)加熱?？刂葡到y(tǒng)：開關，閥門，指示表及記錄儀。凍干箱：同時兼顧冷凍和加熱功能。冷凝器：接受來自凍干箱升華的水汽冷凝為水，防止進入真空泵。140三、凍干機組和凍干程序140141141142142（二）凍干程序：液體疫苗分裝—半加塞---裝凍干箱—預凍—抽真空—第一步加熱到共熔點（叫升華干燥）--第二步加熱（解析干燥）--壓塞。預凍：疫苗凍至--40℃以下，叫預凍。分箱內和箱外預凍；裝量為瓶子的1/4到1/5，高度不超過1、5cm；預凍速凍是3—4h冷凍到--40℃.143（二）凍干程序：143144144真空干燥：升華干燥：真空條件下（10—30Pa），加熱到共熔點，升華開始；一克冰升華為水吸收2805J的熱量，所以，不斷加熱才抗原保持共熔點的溫度。升華快慢與物質共熔點、以及裝量有關。解析干燥：使疫苗剩余水分通過加熱和真空方法除去，一般溫度是20--30℃，氣壓是15—30Pa。145真空干燥：145凍干時序：預凍速凍要快：先開機冷凍，再裝箱冷凍3-4h。抽真空要快：30分鐘到10Pa。開始加熱時機：10Pa時加熱。解析干燥時的溫度：非生命物質可以到40℃，細菌為30℃，病毒為20℃；維持2-3小時，使疫苗含水降至3-4%。146凍干時序：146凍干全過程16—30h。加塞與壓塞：箱內加塞：用四腳或兩腳疫苗塞，疫苗裝后半加塞，露出透氣孔；箱內瓶子擺放均勻；壓塞時壓力適當。箱外加塞：開口的疫苗凍干后，把凍干箱內充入氮氣或無菌空氣，再開箱加塞和壓塞；這種塞是反扣膠塞，現(xiàn)已經淘汰。147凍干全過程16—30h。147思考題：生物制品毒種標準是什么？強毒、弱毒菌種如何選育？細菌規(guī)?；囵B(yǎng)方法有哪些？細菌計數(shù)技術有哪些？病毒材料如何處理？雞胚接種日齡和部位有哪些？什么叫細胞培養(yǎng)？幾種單細胞的概念？細胞培養(yǎng)的方法有哪些？如何分散細胞？148思考題：148簡述以下疫苗制備流程（細菌滅活苗，細菌弱毒苗，自家組織滅活苗，動物、雞胚、細胞病毒弱毒疫苗制備）。什么叫診斷劑？包括哪些種類？診斷抗原（雞白痢平板抗原）和因子血清如何制備？豬瘟血清和卵黃抗體如何制備？名詞：凍干、共熔點，升華。凍干時序是什么？149簡述以下疫苗制備流程（細菌滅活苗，細菌弱毒苗，自家組織滅活苗第四章生物制品生產基本技術第一節(jié)菌種與毒種選育技術150第四章生物制品生產基本技術第一節(jié)菌種與毒種選育技術一、生物制品毒種的標準生物學性狀明顯，歷史清楚：形態(tài)、生理、生化典型、血清學、來源、代數(shù)等清楚。遺傳學純一穩(wěn)定：穩(wěn)定純一的菌種，才能制造出高質量穩(wěn)定的疫苗。免疫抗原、反應抗原好：高質量疫苗的基礎。毒力在適當范圍內：滅活疫苗應該是強毒，弱毒疫苗安全，中等毒力的如ND-I系，IBD中等毒力苗。測定毒力要用敏感動物進行。151一、生物制品毒種的標準215231534二、強毒種的選育1、強毒種的用途：滅活疫苗、診斷試劑、抗血清、攻毒試驗。2、強毒種來源：典型傳染病分離培養(yǎng);保藏中心提供。3、強毒種分離：154二、強毒種的選育51556B、致病力（動物、雞胚、細胞試驗）。C、抗原性（免疫及反應抗原試驗）D、穩(wěn)定性（傳代不變異）156B、致病力（動物、雞胚、細胞試驗）。7(一)純粹試驗（分離培養(yǎng)、鑒定）。(二)致病力測定菌(毒)種的致病力(或稱毒力)常用易感實驗動物、本動物(原宿主動物)、禽胚或細胞進行測定，用半數(shù)致死量(LD50)、半數(shù)感染量(ID50)、禽胚半數(shù)致死量(ELD50)、胚半數(shù)感染量(HD50)、組織細胞半數(shù)感染量(TCID50)等來表示。(三)抗原性測定反應原性測定，一般采用血清學方法，以抗體滴度或效價表示。免疫原性測定，通常采用的方法是將菌(毒)株制成疫苗，免疫動物，經1～3周后用致死劑量的強毒攻擊，以保護率表示?？怪滤懒繌姸驹蕉?，保護率越高者，免疫原性越好?？乖缘臏y定，也需設陽性和陰性對照，否則無效。(四)穩(wěn)定性測定一般采用培養(yǎng)基或動物、禽胚、細胞對菌(毒)株進行傳代培養(yǎng)，觀察其生物學特性，測定其致病力和抗原性，以證明其遺傳性狀的穩(wěn)定。157(一)純粹試驗（分離培養(yǎng)、鑒定）。8達到：毒力強，純粹，抗原好，穩(wěn)定的菌種，最后凍干保藏。這就是強毒菌種的標準。復壯：弱毒菌種在敏感動物或細胞上多次傳代，達到毒力增強的目的（日本731部隊用人試驗，目的是增強細菌毒力，做細菌武器使用。）。158達到：毒力強，純粹，抗原好，穩(wěn)定的菌種，最后凍干保藏。這就是三、弱毒種的選育1、用途：弱毒疫苗，診斷試劑，免疫血清。2、來源：自然界篩選和人工誘變。3、弱毒篩選途徑：159三、弱毒種的選育1016011自然界弱毒篩選：同源弱毒—新城疫I系異源弱毒—火雞皰疹病毒疫苗，它們都是在自然界尋找發(fā)現(xiàn)的。人工誘變篩選：

161自然界弱毒篩選：12人工致弱強毒株(1)物理途徑：高溫、干燥、射線等1881年，巴斯德將炭疽強毒菌在42.5℃高溫下長期傳代培養(yǎng)，育成了炭疽弱毒菌株。巴斯德又將含有狂犬病病毒的腦脊髓置干燥條件中處理，獲得了狂犬病病毒弱毒株。日本乙型腦炎病毒強毒株經紫外線照射后能引起基因突變，從而出現(xiàn)遺傳性狀分離，再進行蝕斑挑選，育成弱毒株用于制造弱毒疫苗。162人工致弱強毒株13(2)化學途徑：化學誘變劑如通過亞硝基胍處理支原體己育成了雞支原體疫苗株和肺炎支原體突變株；將豬副傷寒沙門氏菌強毒株在含有1／500~1／1000醋酸鉈的肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)傳50代后，育成了弱毒株。163(2)化學途徑：化學誘變劑14(3)生物學途徑①適應鈍感動物(非自然宿主)：我國的豬瘟兔化弱毒株，是將豬瘟病毒強毒株通過兔體傳400余代后育成的。②適應鈍感禽胚：鴨瘟雞胚化弱毒株，是將鴨瘟病毒強毒株經鴨胚傳9代和雞胚傳23代后育成的。羊痘弱毒株---強毒株,雞胚傳代;雞痘弱毒株—強毒株,鵪鶉傳代;③適應細胞：多采用同源或異源動物組織的原代細胞。我國的馬傳染性貧血病驢白細胞弱毒株，是將馬傳染性貧血病驢白細胞強毒株通過驢白細胞傳代育成的。豬丹毒弱毒株(GC42)---強毒株-豚鼠370代,雞2代.164(3)生物學途徑15④雜交減毒：流行性感冒弱毒株的育成是將溫度敏感株(毒力弱，抗原性弱)與流行株(毒力強，抗原性強)進行混合培養(yǎng)傳代，兩者毒力基因發(fā)生交換產生毒力低、抗原性強的毒株。(4)基因工程途徑偽狂犬病病毒，去除決定其致病力的TK基因獲得偽狂犬病病毒TK突變株，用該突變株制成的疫苗是第一個商品化的基因缺失疫苗，預防偽狂犬病效果十分理想。165④雜交減毒：164、初選的依據(jù)：生物性狀改變—豬丹毒桿菌變長絲狀，菌落光滑變粗糙。病毒蝕斑變異。溫度敏感變異。藥物敏感變異營養(yǎng)變異宿主變異1664、初選的依據(jù)：17第三節(jié)細菌培養(yǎng)技術

細菌培養(yǎng)技術是生物制品制造的基礎，一些內容在微生物學已經學習過，這里主要講一些重要的細菌培養(yǎng)技術。167第三節(jié)細菌培養(yǎng)技術

細菌培養(yǎng)技術是生物制品一、細菌生長規(guī)律與條件大家一定要熟悉細菌的生長曲線，因為不同的生物制品，要用不同時期的細菌，如細菌疫苗，要對數(shù)期或穩(wěn)定期細菌；芽孢疫苗，要衰老期細菌；外毒素要老齡細菌。168一、細菌生長規(guī)律與條件大家一定要熟悉細菌的生長其次，要根據(jù)不同細菌用不同的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，用不同的培養(yǎng)方法（需要氧氣，微需氧，厭氧。另培養(yǎng)溫度，pH，滲透壓等。）。169其次，要根據(jù)不同細菌用不同的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，用不同的培養(yǎng)方法二、細菌培養(yǎng)的基本技術

步驟：先分離出單個菌落→斜面培養(yǎng)基→生化或血清鑒定→菌種保存→生產生物制品→先接種到斜面菌種→小三角瓶肉湯→大三角瓶肉湯。170二、細菌培養(yǎng)的基本技術

步驟：先分離出單個菌落（一）細菌分離培養(yǎng)（目的是稀釋病料，得到單個典型菌落）。1、需氧菌分離培養(yǎng)：分段劃線、傾注培養(yǎng)。2、微需氧培養(yǎng)：鴨疫巴氏桿菌，牛布氏桿菌病，豬傳染性胸膜肺炎菌等，用蠟燭缸方法。3、厭氧菌培養(yǎng)：用皰肉基，物理除氧氣（加氮氣，氫氣），化學除氧：焦性沒食子酸加燒堿。171（一）細菌分離培養(yǎng)（目的是稀釋病料，得到單個典型菌落）。221722317324厭氧罐174厭氧罐251752617627厭氧培養(yǎng)箱177厭氧培養(yǎng)箱28（二）細菌的規(guī)模培養(yǎng)生物制品是產品，一般要大規(guī)模培養(yǎng)，才能滿足基層需要。1、菌種接種量：1-3%，過少生長慢，過度帶入有害產物多，影響生長。2、培養(yǎng)時間：菌苗，對數(shù)期和穩(wěn)定期的細菌好；芽孢疫苗：衰老期細菌；外毒素：需要1周時間培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，如果有少量污染，可以提前滅活終止培養(yǎng)。178（二）細菌的規(guī)模培養(yǎng)29②液體靜止培養(yǎng)：一般細菌疫苗多用，用大三角瓶（5000ml）或發(fā)酵罐，裝入培養(yǎng)基1/2—-2/3量，需氧培養(yǎng)，要5小時搖動一次，增加氧氣濃度。培養(yǎng)厭氧細菌，可以裝滿培養(yǎng)基，上面加少量石蠟油，隔絕空氣，下加肝塊或肉渣（皰肉基），它們氧化，吸收氧氣，達到除氧氣目的。液體培養(yǎng)含菌量低，多需要濃縮。179②液體靜止培養(yǎng)：一般細菌疫苗多用，用大三角瓶（5000ml）3、培養(yǎng)方法：根據(jù)不同制品的性質和要求，選育不同方法。①固體表面培養(yǎng)：多用于診斷劑，也有菌苗生產?？呻S意調節(jié)細菌濃度，但操作麻煩，勞動量大。培養(yǎng)方法有克氏瓶，大平皿，到入菌液，L玻棒刮抹接種，培養(yǎng)后加生理鹽水，再用L棒刮洗下細菌混懸液。1803、培養(yǎng)方法：根據(jù)不同制品的性質和要求，選育不同方法。311813218233③液體深層通氣培養(yǎng)（發(fā)酵罐）：可自動調節(jié)溫度、氧氣、pH、營養(yǎng)、攪拌，注意消泡沫和污染。④透析培養(yǎng)：半滲透膜作用，營養(yǎng)可以不斷補充，可以提高細菌和毒素含量。⑤連續(xù)培養(yǎng)：營養(yǎng)不斷加入，培養(yǎng)好的細菌不斷流出。183③液體深層通氣培養(yǎng)（發(fā)酵罐）：可自動調節(jié)溫度、氧氣、pH、營KRH-PB-6L玻璃發(fā)酵罐184KRH-PB-6L玻璃發(fā)酵罐35（三）細菌計數(shù)技術細菌疫苗必須有一定含菌量，才有好的免疫效果。所以，應該對生產的疫苗計算含菌量。1、直接顯微鏡檢查計數(shù)①定量定面積染色計數(shù)：10ul菌液，涂抹1cm2面積的載玻片上，干燥固定染色，油鏡下觀察，油鏡直徑是0、16mm，視野面積是0、02mm2，1cm2面積有50萬個油鏡視野，多觀察幾個視野，算出一個視野細菌平均數(shù)X50萬X100，即每ml含細菌量。185（三）細菌計數(shù)技術細菌疫苗必須有一定含②比例法計數(shù)（也叫對照法）如用已知人紅細胞為500萬/mm3（可以把紅細胞0、4%甲醛固定，長期使用），取一環(huán)紅細胞放在載玻片上，另取一環(huán)菌液與紅細胞混勻涂片，干燥固定染色，顯微鏡下檢查，如果平均每個視野是一個紅細胞，10個細菌，那么，被檢查細胞為5000萬/mm3，，1ml是500000萬個細菌。186②比例法計數(shù)（也叫對照法）37③估計計數(shù)法接種環(huán)直徑在0.5cm，取一環(huán)細菌液，涂抹在載玻片上，大約0.5—1cm2，干燥固定染色，顯微鏡檢查，如果每個視野平均是1—9個細菌，菌液含量是105-6個/ml，10—99為107-8個/ml，100以上為109-10個/ml，密不可計為1010個以上/ml。187③估計計數(shù)法38④紅細胞計數(shù)室法：（細菌量）Y/80X400X稀釋倍數(shù)X10=細菌數(shù)/mm3，變ml乘1000。（Y是5個中方格細菌總數(shù)，乘10是計數(shù)室的高度為0、1mm，計數(shù)室1mm2，有400個小格，有25個中格，每個中格是16個小格）。該方法多用于計數(shù)大的細菌或酵母菌、細胞。188④紅細胞計數(shù)室法：3918940190412、比濁比色法①比濁管法含菌量與渾濁度正比，用已知菌含量的試管與標準比濁管相比，找出規(guī)律，如1億細菌=1號比濁管顏色，10億等10號，以后，用未知細菌液與標準管比色，得出大致細菌含量。

1912、比濁比色法①比濁管法含菌量與渾濁度正比，用已知菌含量②美藍還原褪色法：含細菌多，使美藍褪色快。10ml牛奶，加1ml美藍液（1/3000），37度水浴，褪色少于20分鐘，細菌多于2000萬/ml，20-2小時，為400—2000萬；2----5、5小時為50—400萬；5、5小時以上，為少于50萬/ml，為一級牛奶；如果用于細菌苗，應先用已知細菌找出規(guī)律。192②美藍還原褪色法：含細菌多，使美藍褪色快。10ml牛奶，加13、活菌計數(shù)：原理，一個菌落是一個細菌的后代，數(shù)菌落就知道含菌量，也叫菌落形成單位—CFU：colonyformatunite。①傾注法（GB方法）：菌液10倍遞減稀釋，選2-3個稀釋度，各取1ml于平皿，加45-50℃營養(yǎng)瓊脂15-20ml，搖勻37度培養(yǎng)，計算菌落，乘稀釋倍數(shù)，即每ml細菌數(shù)。1933、活菌計數(shù)：原理，一個菌落是一個細菌的后代，數(shù)菌落就知道含②平板表面涂布法：先做好營養(yǎng)瓊脂平板，將不同稀釋度菌液0、1ml加上，玻璃棒刮勻，37度24h培養(yǎng)，計算菌落乘稀釋度乘10=菌數(shù)/ml③微量滴板法：將不同稀釋度菌液，各取0、02ml滴在營養(yǎng)瓊脂板上，一板可以滴多點，自然擴散，37度培養(yǎng)，計算每點菌落乘50乘稀釋度=菌數(shù)/ml。194②平板表面涂布法：先做好營養(yǎng)瓊脂平板，將不同稀釋度菌液0、1三、培養(yǎng)基

微生物學已經學過，自己溫習，重點熟悉：不同微生物用不同的培養(yǎng)基來培養(yǎng)注意各種營養(yǎng)物質濃度配比調節(jié)合適的pH范圍195三、培養(yǎng)基

微生物學已經學過，自己溫習，重點熟悉：46第三節(jié)病毒的增殖技術

一、病毒的復制與培養(yǎng)病毒為專性細胞寄生物，必須在活細胞內生存，其復制過程是：吸附，進入，脫殼，生物合成，裝配和釋放。微生物已經講，自己復習。

二、病毒的動物接種增殖（一）、病毒材料的處理1、病毒的釋放：剪碎研磨，1：5-10稀釋，冰凍融及超聲波處理。2、除雜菌：細菌過濾器過濾，高速離心取上清液；其次是抗生素